Piggy iperattivoTrasponsi-mediata dalla trasposizione della linea germinale nel verme dell'esercito autunnale, Spodoptera frugiperda

Riepilogo

La trasformazione germinale di successo nel verme dell'esercito autunnale, Spodoptera frugiperda,è stata ottenuta utilizzando l'mRNA della trasposasi iperattiva piggyBac.

Abstract

L'inserimento stabile di carichi genetici nei genomi degli insetti utilizzando elementi trasponibili è un potente strumento per studi genomici funzionali e lo sviluppo di strategie genetiche di gestione dei parassiti. L'elemento trasponibile più utilizzato nella trasformazione degli insetti è piggyBace la trasformazione germinale a base di piggyBacè stata condotta con successo negli insetti modello. Tuttavia, è ancora difficile impiegare questa tecnologia in insetti non modello che includono parassiti agricoli. Questo documento riporta la trasformazione germinale di un parassita agricolo globale, il verme dell'esercito autunnale (FAW), Spodoptera frugiperda, utilizzando la trasposasi iperattiva piggyBac (hyPBase).

In questo lavoro, l'mRNA hyPBase è stato prodotto e utilizzato al posto del plasmide helper nelle microiniezioni embrionali. Questo cambiamento ha portato alla generazione di successo di FAW transgenico. Inoltre, vengono descritti anche i metodi di screening degli animali transgenici, il rilevamento rapido basato sulla PCR dell'inserimento transgenico e la determinazione termica asimmetrica interlacciata della PCR (TAIL-PCR) del sito di integrazione. Pertanto, questo documento presenta un protocollo per produrre FAW transgenico, che faciliterà la transgenesi basata su piggyBacin FAW e altri insetti lepidotteri.

Introduzione

Il verme dell'esercito autunnale (FAW), Spodoptera frugiperda, è originario delle regioni tropicali e subtropicali dell'America. Attualmente, questo è un erbivoro insetto devastante in più di 100 paesi in tutto il mondo¹. Le larve faw si nutrono di oltre 350 piante ospiti, tra cui alcune importanti colture alimentari di base². La forte capacità migratoria degli adulti FAW contribuisce alla sua recente rapida diffusione dalle Americhe ad altri luoghi^1,2. Di conseguenza, questo insetto sta ora minacciando la sicurezza alimentare a livello internazionale. L'applicazione di nuove tecnologie può facilitare studi avanzati in FAW e fornire nuove strategie per gestire questo parassita.

La trasformazione germinale degli insetti è stata utilizzata per studiare la funzione genica e generare insetti transgenici da utilizzare nel controllo^genetico3,4. Tra i vari metodi utilizzati per ottenere la trasformazione genetica negli insetti, il metodo basato sugli elementi piggyBac è il metodo più utilizzato⁵. Tuttavia, a causa del basso tasso di trasposizione, è ancora difficile condurre la transgenesi in insetti non modello. Recentemente, una versione iperattiva di piggyBac transposase (hyPBase) è stata sviluppata^6,7. La trasformazione germinale è stata raggiunta in FAW recentemente⁸, che è il primo rapporto che ha utilizzato l'hyPBase negli insetti lepidotteri. In questo rapporto vengono descritte informazioni dettagliate sull'utilizzo di mRNA hyPBase nella generazione di FAW transgenica. Il metodo qui descritto potrebbe essere applicato per ottenere la trasformazione di altri insetti lepidotteri.

Protocollo

1. Sintesi in vitro di mRNA hyPBase

NOTA: La sequenza di codifica completa della sequenza hyPBase è stata sintetizzata e inserita in un vettore pTD1-Cas9 (vedi la Tabella dei materiali)per produrre il costrutto pTD1-hyPBase, che contiene una cassetta che esprime hyPBase, promotore T7: poliedrino-5' UTR: hyPBase: poliedrina-3' UTR: poly (A). La sequenza completa del costrutto pTD1-hyPBase è fornita nel Materiale supplementare.

1. Preparazione del modello per la sintesi in vitro
   1. Eseguire una reazione PCR per amplificare la cassetta che esprime hyPBase utilizzando un primer in avanti, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3' e un primer inverso 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', polimerasi ad alta fedeltà e plasmide pTD1-hyPBase come modello.
      NOTA: La reazione PCR (volume finale di 50 μL) contiene 5,0 μL di 10x tampone di reazione, 4,0 μL di 10 mM di desossinucleoside trifosfato (dNTP), 1,0 μL di plasmide (50 μg/μL), 1,0 μL di polimerasi ad alta fedeltà, 1,0 μL ciascuno di primer avanti e indietro da 10 μM e 33 μL di acqua priva di nucleasi. Le impostazioni erano le seguenti: un'incubazione iniziale di 95 °C per 3 minuti, seguita da 35 cicli di 98 °C per 10 s, 60 °C per 15 s e 68 °C per 2 min.
   2. Controllare il prodotto PCR su un gel di agarosio all'1% a 120 V in tampone fresco di acido tetraacetico Tris-acetato-etilendiammina (TAE) per 30 minuti e purificare il prodotto con il kit di estrazione del gel.
      NOTA: non utilizzare il kit di purificazione del prodotto PCR. Anche una traccia del plasmide pTD1-hyPBase riduce significativamente l'efficienza della sintesi in vitro.
2. Sintesi in vitro di mRNA hyPBase utilizzando un kit commerciale
   1. Scongelare completamente i reagenti congelati, mantenere l'enzima e 2x soluzione NTP/CAP sul ghiaccio e lasciare il tampone di reazione 10x scongelato a temperatura ambiente.
   2. Assemblare la reazione a temperatura ambiente aggiungendo i seguenti componenti: 2x soluzione NTP/CAP: 10 μL; 10x Tampone di reazione: 2 μL; Modello DNA: 0,1-0,2 μg; Miscela enzimatica: 2 μL; Acqua priva di nucleasi a 20 μL.
   3. Mescolare accuratamente i reagenti convogliando delicatamente la miscela su e giù e incubare a 37 °C per 2-4 ore.
3. Recupero dell'mRNA sintetizzato mediante precipitazione del cloruro di litio
   1. Aggiungere 30 μL di soluzione di precipitazione LiCl, mescolare accuratamente facendo scorrere il tubo e quindi mantenere a -20 °C per ≥ 30 minuti.
   2. Centrifugare a 4 °C per 15 minuti alla massima velocità e rimuovere con cura il surnatante.
   3. Lavare il pellet una volta con 1 mL di etanolo al 70%, ricentravorare e rimuovere accuratamente il surnatante.
   4. Asciugare il pellet a temperatura ambiente per 1-2 minuti, quindi risospesciare il pellet con 20-40 μL di acqua priva di nucleasi.
   5. Diluire 1 μL di soluzione di mRNA con 9 μL di acqua priva di nucleasi. Prendi 2 μL per determinare la concentrazione di mRNA e usa 8 μL per controllare la qualità dell'mRNA su un gel di agarosio all'1% a 100 V in tampone TAE fresco per 40 minuti.
   6. Aliquotare la soluzione di mRNA e conservare congelata a -70 °C per un massimo di un anno.
      NOTA: Non asciugare completamente il pellet di mRNA; potrebbe essere più difficile scioglierlo in acqua.

2. Microiniezione

1. Raccolta di uova
   1. Metti 12 pupe maschili e 12 pupe femmine in una scatola di 15 cm x 15 cm x 10 cm. Coprire la scatola con un tovagliolo di carta. Posizionare una soluzione di saccarosio al 10% nella scatola per l'alimentazione degli adulti.
   2. Il giorno 2 dopo l'eclosion, esporre gli adulti a una luce intensa durante la notte.
   3. Il giorno 3 dopo l'eclosion, trasferisci gli adulti dal passaggio 2.1.2 in un luogo buio. Raccogliere gli embrioni entro 2 ore dall'ovodeposizione.
   4. Aggiungere gocce d'acqua al pezzo di un tovagliolo di carta con uova fresche conservate in una capsula di Petri su ghiaccio. Trasferire delicatamente le uova su un vetrino con un pennello sottile e allinearle una ad una su una diapositiva di vetro. Tenere i vetrini con le uova allineate sul ghiaccio prima della microiniezione.
2. Configurazione della microiniezione
   1. Iniettare una miscela di un plasmide transgenico che esprime proteine fluorescenti verdi (EGFP) (200 ng/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, mRNA hyPBase (200 ng/μL) e acqua distillata sterile nelle uova, utilizzando la pressione di compensazione del microiniettore automatizzato (vedere la tabella dei materiali).
   2. Conservare le uova iniettate a 27 ± 1 °C, 60 ± 10% di umidità relativa fino alla schiusa.
   3. Nutrire le larve tratteggiate con una dieta artificiale e trasferire ogni larva in una piccola tazza all'inizio del 3^° stadio instar (~ 6 mm di lunghezza e il colore del corpo diventa nero).

3. Screening di fluorescenza e incrocio genetico

1. Raccogli le pupe e posiziona ~ 150 pupe femmine e ~ 150 pupe maschili in una gabbia di 35 cm x 35 cm x 35 cm. Appendere diversi pezzi di carta assorbente (~ 30 cm x 15 cm) nella gabbia per raccogliere le uova.
2. Raccogliere gli asciugamani di carta con le uova ogni giorno e mantenere le uova a 27 ± 1 °C, 60 ± il 10% di umidità relativa fino alla schiusa.
3. Tenere le larve neonate a 4 °C per 5 minuti per immobilizzarle, quindi trasferirle su una piastra ghiacciata.
4. Schermare le larve neonate immobilizzate sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza. Selezionare i neonati EGFP-positivi, portarli allo stadio pupale in ~ 2 settimane a 27 ± 1 ° C e separarli per sesso in base alle differenze fenotipiche nei segmenti dell'addome ventrale.
   NOTA: La pupa femminile ha un'apertura genitale a fessura sull'ottavo segmento addominale e i margini cefalici del nono e decimo segmento curvano verso l'apertura genitale. L'apertura genitale della pupa maschile ha una leggera elevazione sul nono segmento addominale.
5. Posiziona le pupe EGFP-positive e le pupe selvatiche del sesso opposto in un rapporto maschio: femmina di 1: 1 in una gabbia. Sib-cross gli adulti che esprimono EGFP per produrre le generazioni successive.

4. Rilevazione PCR dell'inserzione transgenica

1. Estrarre il DNA genomico dalle singole larve wild-type e EGFP-positive utilizzando qualsiasi kit commerciale di estrazione del DNA genomico seguendo le istruzioni del produttore.
2. Eseguire una reazione PCR utilizzando il DNA genomico come modello; un primer in avanti, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3' situato nella regione del promotore ie1; e un primer inverso, 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3' situato nella regione EGFP del vettore di trasformazione.
3. Impostare ogni reazione PCR (volume finale di 40 μL) per contenere 20 μL della miscela di polimerasi, 1,0 μL di DNA genomico (40 μg/μL), 1,0 μL ciascuno di 10 μM di primer avanti e indietro e 17 μL di acqua priva di nucleasi. Utilizzare le seguenti impostazioni: un'incubazione iniziale di 95 °C per 3 minuti, seguita da 35 cicli di 95 °C per 20 s, 56 °C per 20 s e 68 °C per 40 s impostazioni.
4. Controllare i prodotti PCR su un gel di agarosio all'1% a 120 V per 30 min.

5. Determinazione del sito di inserimento transgenico

1. Eseguire la TAIL-PCR ad alta efficienza utilizzando il DNA genomico come modello per determinare il sito di integrazione dell'inserimento transgenico negli insetti EGFP-positivi.
   1. Eseguire le reazioni PCR seguendo i passaggi descritti altrove⁹.
      1. Utilizzare tre primer, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3' e P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgct-3', che sono specifici per il vettore piggyBac, rispettivamente nei 3 round di reazione PCR.
2. Sequenziare i prodotti PCR finali per determinare il sito di integrazione.

Risultati

Un costrutto per l'espressione del promotore T7 contenente hyPBase: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) signal è stato generato (Figura 1A) e amplificato come un frammento PCR ~ 2.2 kb per sintetizzare l'mRNA hyPBase in vitro (Figura 1B). Quindi, l'mRNA hyPBase è stato prodotto e sottoposto a elettroforesi su gel di agarosio. L'mRNA della dimensione prevista (banda ~1,1 kb) è stato rilevato su un gel di agarosio all'1% (

Discussione

Il basso tasso di trasposizione e la difficoltà di fornire componenti transgenici in embrioni freschi limitano il successo della trasformazione germinale in molti insetti non modello, specialmente quelli di ordine, Lepidotteri. Per aumentare il tasso di trasformazione della linea germinale, è stata sviluppata una versione iperattiva della trasposasi piggyBac più utilizzata (hyPBase)^7,10. Ad oggi, la trasformazione germinale di successo negli insetti l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5" Dental Cotton Rolls	PlastCare USA	8542025591	REARING
1 oz Souffle Cup Lids	DART	PL1N
1 oz Souffle Cups	DART	P100N	REARING
48 oz Plastic Deli Containers	Genpack	AD48	REARING
Add-on Filter Set (Green)	NightSea LLC	SFA-BLFS-GR	SCREENING
Borosilicate Glass	Sutter Instruments	BF100-50-10	INJECTION
Borosilicate Glass	SUTTER INSTRUMENT	BF-100-50-10
Dissecting Scope	Nikon	SMZ745T	SCREENING
Featherweight Forceps	BioQuip	4750	REARING
Gutter Guard	ThermWell Products	VX620	REARING
Inverted Microscope	Olympus	IX71	INJECTION
Microinjector	Narishige	IM-300	INJECTION
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	INJECTION
Microscope Slides	VWR	16004-22	INJECTION
NightSea Full System	NightSea LLC	SFA-RB-DIM	SCREENING
Nitrogen Gas	AWG/Scott-Gross	NI 225	INJECTION
Paper Towels	Bounty	43217-45074	REARING
Spodoptera frugiperda Artificial Diet	Southland Products, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Spodoptera frugiperda Eggs	Benzon Research, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Taq MasterMix			polymerase mixture