piggyBac טרנספוסאז בתיווך טרנספורמציה נבטים בתולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda

Summary

טרנספורמציה נבט מוצלחת תולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda, הושג באמצעות mRNA של piggyBac היפראקטיבי transposase.

Abstract

החדרה יציבה של מטען גנטי לגנומי חרקים באמצעות אלמנטים הניתנים להחלפה היא כלי רב עוצמה למחקרים גנומיים פונקציונליים ולפיתוח אסטרטגיות לניהול מזיקים גנטיים. האלמנט הנפוץ ביותר לשינוי חרקים הוא piggyBac, ושינוי נבטים מבוסס piggyBacנערך בהצלחה בחרקים לדוגמה. עם זאת, עדיין קשה להשתמש בטכנולוגיה זו בחרקים שאינם מודל הכוללים מזיקים חקלאיים. מאמר זה מדווח על טרנספורמציה נבט של מזיק חקלאי גלובלי, תולעת צבא הסתיו (FAW), Spodoptera frugiperda, באמצעות piggyBac transposase היפראקטיבי (hyPBase).

בעבודה זו, ה- hyPBase mRNA יוצר ושימש במקום פלסמיד עוזר במיקרו-בייג'ציות עובריות. שינוי זה הוביל לדור המוצלח של FAW מהונדס. יתר על כן, מתוארים גם שיטות הסינון של בעלי חיים מהונדסים, זיהוי מהיר מבוסס PCR של החדרת טרנסג'נים וקביעה אסימטרית תרמית של PCR (TAIL-PCR) של אתר האינטגרציה. לפיכך, מאמר זה מציג פרוטוקול לייצור FAW מהונדס, אשר יקל על transgenesis מבוסס piggyBacב- FAW וחרקים לפידופטרנים אחרים.

Introduction

תולעת צבא הסתיו (FAW), Spodoptera frugiperda, היא ילידת אזורים טרופיים וסובטרופיים של אמריקה. נכון לעכשיו, זהו אוכל עשב חרקים הרסני ביותר מ -100 מדינות ברחבי העולם¹. זחלי FAW ניזונים מיותר מ־350 צמחים מארחים, כולל כמה גידולי מזון חשובים². יכולת ההגירה החזקה של בוגרי FAW תורמת להתפשטות המהירה האחרונה שלה מיבשת אמריקה למקומות אחרים^1,2. כתוצאה מכך, חרק זה מאיים כעת על ביטחון המזון ברחבי העולם. יישום טכנולוגיות חדשות עשוי להקל על מחקרים מתקדמים ב- FAW ולספק אסטרטגיות חדשניות לניהול מזיק זה.

שינוי חיידקי חרקים שימש לחקר תפקוד הגנים ולייצור חרקים מהונדסים לשימוש בשליטה גנטית^3,4. בין השיטות השונות המשמשות להשגת טרנספורמציה גנטית בחרקים, השיטה המבוססת על אלמנט piggyBac היא השיטה הנפוצה ביותר⁵. עם זאת, בשל השיעור הנמוך של טרנספוזיציה, זה עדיין מאתגר לנהל טרנסגנזה בחרקים שאינם מודל. לאחרונה, גרסה היפראקטיבית של piggyBac transposase (hyPBase) פותחה^6,7. טרנספורמציה Germline הושגה לאחרונה FAW⁸, שהוא הדו"ח הראשון שהשתמש hyPBase חרקים lepidopteran. בדו"ח זה, מידע מפורט על שימוש hyPBase mRNA ביצירת FAW מהונדס מתואר. השיטה המתוארת כאן יכולה להיות מיושמת כדי להשיג את השינוי של חרקים lepidopteran אחרים.

Protocol

1. סינתזה במבחנה של hyPBase mRNA

הערה: רצף הקידוד המלא של רצף hyPBase היה מסונתז והוכנס לווקטור pTD1-Cas9 (ראה טבלת החומרים) כדי לייצר את מבנה בסיס ה- pTD1-hyPBase, המכיל קלטת הבעת hyPBase, מקדם T7: פוליהדרין-5' UTR: hyPBase: polyhedrin-3' UTR: poly (A). הרצף המלא של מבנה pTD1-hyPBase מסופק בחומר המשלים.

1. הכנת התבנית לסינתזה במבחנה
   1. בצע תגובת PCR כדי להגביר את הקלטת המביעה hyPBase באמצעות פריימר קדמי, 5'- atgctgtgaaataccgcacagatgcg-3', ו- פריימר הפוך 5'- tagaggccccaaggttatgtctag-3', פולימראז בעל נאמנות גבוהה ו- pTD1-hyPBase plasmid כתבנית.
      הערה: תגובת PCR (נפח סופי של 50 μL) מכיל 5.0 μL של 10x חיץ תגובה, 4.0 μL של 10 mM deoxynucleoside טריפוספט (dNTP), 1.0 μL של plasmid (50 מיקרוגרם / μL), 1.0 μL של פולימראז אמינות גבוהה, 1.0 μL כל אחד של 10 מיקרומטר קדימה והפוך פריימרים, ו 33 μL של מים ללא נוקלאז. ההגדרות היו כדלקמן: דגירה ראשונית של 95 °C (70 °F) במשך 3 דקות, ואחריו 35 מחזורים של 98 °C (50 °F) במשך 10 מעלות צלזיוס, 60 °C (70 °F) במשך 15 °C (68 °F) למשך 2 דקות.
   2. בדוק את מוצר PCR על ג'ל אגרוז 1% ב 120 V טריס אצטט-אתילנדיאמין חומצה טטראצטית (TAE) חוצץ במשך 30 דקות לטהר את המוצר עם ערכת החילוץ ג'ל.
      הערה: אין להשתמש בערכת טיהור המוצר PCR. אפילו כמות זעירה של pTD1-hyPBase plasmid מקטין באופן משמעותי את היעילות של סינתזה במבחנה.
2. סינתזה במבחנה של hyPBase mRNA באמצעות ערכה מסחרית
   1. להפשיר לחלוטין את הריאגנטים הקפואים, לשמור את האנזים ואת תמיסת 2x NTP /CAP על קרח, ולהשאיר את חיץ תגובה 10x מופשר בטמפרטורת החדר.
   2. להרכיב את התגובה בטמפרטורת החדר על ידי הוספת הרכיבים הבאים: פתרון 2x NTP / CAP: 10 μL; מאגר תגובה 10x: 2 μL; DNA תבנית: 0.1-0.2 מיקרוגרם; תערובת אנזימים: 2 μL; מים ללא נוקלאז עד 20 μL.
   3. מערבבים את הריאגנטים ביסודיות על ידי צנרת עדינה של התערובת למעלה ולמטה ודגרה ב 37 °C (2-4 שעות).
3. התאוששות של mRNA מסונתז על ידי משקעים ליתיום כלוריד
   1. הוסף 30 μL של פתרון משקעים LiCl, לערבב ביסודיות על ידי הבהוב הצינור, ולאחר מכן לשמור על -20 °C (50 °F) במשך ≥ 30 דקות.
   2. צנטריפוגה ב 4 °C (5 °F) במשך 15 דקות במהירות המרבית, ולהסיר בזהירות את supernatant.
   3. לשטוף את הכדור פעם אחת עם 1 מ"ל של 70% אתנול, מחדש צנטריפוגה, ולהסיר את supernatant בזהירות.
   4. יבש את הכדור בטמפרטורת החדר במשך 1-2 דקות, ולאחר מכן resuspend הכדור עם 20-40 μL של מים ללא נוקלאז.
   5. לדלל 1 μL של פתרון mRNA עם 9 μL של מים ללא נוקלאז. קח 2 μL כדי לקבוע את ריכוז mRNA ולהשתמש 8 μL כדי לבדוק את איכות mRNA על ג'ל אגרוז 1% ב 100 V במאגר TAE טרי במשך 40 דקות.
   6. Aliquot פתרון mRNA ולאחסן קפוא ב -70 °C (70 °F) עד שנה אחת.
      הערה: אין לייבש לחלוטין את גלולה mRNA; זה עלול להיות קשה יותר להמיס אותו במים.

2. מיקרו-ינון

1. אוסף ביצים
   1. מניחים 12 גלמים זכרים ו-12 גלמים נשיים בקופסה 15 ס"מ על 15 ס"מ על 10 ס"מ. מכסים את הקופסה במגבת נייר. מניחים 10% תמיסת סוכרוז בתיבה להאכלת מבוגרים.
   2. ביום 2 לאחר העיקול, לחשוף את המבוגרים לאור אינטנסיבי לילה.
   3. ביום 3 לאחר העיקול, העבירו את המבוגרים מצעד 2.1.2 למקום חשוך. לאסוף את העוברים בתוך 2 שעות לאחר oviposition.
   4. מוסיפים טיפות מים לחתיכת מגבת נייר עם ביצים טריות שנשמרות בצלחת פטרי על קרח. מעבירים את הביצים בעדינות למגלשת זכוכית עם מברשת עדינה ומיישרים אותן אחת אחת על מגלשת זכוכית. שמור את שקופיות הזכוכית עם הביצים המיושרות על קרח לפני microinjection.
2. הגדרת מיקרו-ערך
   1. הזריקו תערובת של חלבון פלואורסצנטי ירוק מהונדס (EGFP) המבטא פלסמיד (200 ננוגרם/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hyPBase mRNA (200 ננוגרם/ μL), ומים מזוקקים סטריליים לתוך הביצים,תוך שימוש בלחץ הפיצוי של המיקרו-נג'ר האוטומטי (ראה טבלת החומרים ).
   2. שמור את הביצים המוזרקות ב 27 ± 1 °C (60),60 ± 10% לחות יחסית עד הבקיעה.
   3. האכילו את הזחלים בקעו בדיאטה מלאכותית, והעבירו כל זחל לכוס אחת קטנה בשלב ה-instar המוקדם של^ה-3 (באורך של כ-6 מ"מ, וצבע הגוף הופך לשחור).

3. סינון פלואורסצנטיות ומעבר גנטי

1. לאסוף את הגולם ומניחים ~ 150 גלמים נקבה ~ 150 גולם זכר בכלוב 35 ס"מ x 35 ס"מ x 35 ס"מ. לתלות כמה חתיכות של מגבות נייר (~ 30 ס"מ x 15 ס"מ) בכלוב כדי לאסוף את הביצים.
2. לאסוף את מגבות הנייר עם ביצים מדי יום, ולשמור את הביצים ב 27 ± 1 °C (60°F), 60 ± 10% לחות יחסית עד הבקיעה.
3. שמור את זחלי ניאון ב 4 °C (5 °F) במשך 5 דקות כדי לשתק אותם, ולאחר מכן להעביר אותם על צלחת קרה כקרח.
4. מסך זחלי ניאון משותקים תחת סטריאופיקום פלואורסצנטי. בחר את יילודים חיוביים EGFP, להעלות אותם לשלב הגועל ב ~ 2 שבועות ב 27 ± 1 °C (50 °F), ולהפריד אותם על ידי סקס על פי הבדלי פנוטיפ בקטעי הבטן הגחון.
   הערה: הגולם הנשי יש פתח איברי מין דמוי חריץ על קטע הבטן השמיני ואת השוליים cephalic של החלקים התשיעי והעשירי מתעקל לכיוון פתח איברי המין. פתיחת איברי המין של הגולם הגברי יש עלייה קלה על קטע הבטן התשיעי.
5. מניחים את הגולם החיובי EGFP ואת הגולם הפראי של המין השני בזכר: יחס נשי של 1:1 בכלוב. Sib לחצות את המבוגרים ביטוי EGFP לייצר את הדורות הבאים.

4. זיהוי PCR של החדרה מהונדסת

1. לחלץ DNA גנומי מן הסוג הפראי EGFP חיובי זחלים בודדים באמצעות כל ערכת מיצוי DNA גנומי מסחרי בעקבות הוראות היצרן.
2. ביצוע תגובת PCR באמצעות ה- DNA הגנומי כתבנית; פריימר קדמי, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3' הממוקם באזור האמרגן ie1; פריימר הפוך, 5'- aagcactgcacgegtaggtcag-3' הממוקם באזור EGFP של וקטור הטרנספורמציה.
3. הגדר כל תגובת PCR (נפח סופי של 40 μL) כדי להכיל 20 μL של תערובת פולימראז, 1.0 μL של DNA גנומי (40 מיקרוגרם / μL), 1.0 μL כל אחד של 10 μM קדימה ופריימרים הפוכים, ו 17 μL של מים ללא נוקלאז. השתמש בהגדרות הבאות: דגירה ראשונית של 95 °C (70 °F) למשך 3 דקות, ואחריו 35 מחזורים של 95 °C (70 °F) עבור 20 s, 56 °C (56 °F) עבור 20 s ו 68 °C (70 °F) עבור 40 מעלות צלזיוס.
4. בדוק את מוצרי PCR על ג'ל אגרוז 1% ב 120 V במשך 30 דקות.

5. קביעת אתר ההחדרה הטרנסגני

1. בצעו TAIL-PCR ביעילות גבוהה באמצעות DNA גנומי כתבנית לקביעת אתר האינטגרציה של החדרת טרנסג'נים בחרקים החיוביים ל- EGFP.
   1. בצע את תגובות PCR בעקבות השלבים המתוארים במקום אחר⁹.
      1. השתמש בשלושה פריימרים, P1: 5'-atcagtgtacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', ו- P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgatcgcgct-3', הספציפיים לווקטור piggyBac, בשלושת הסיבובים של תגובת PCR, בהתאמה.
2. רצף את מוצרי ה- PCR הסופיים כדי לקבוע את אתר האינטגרציה.

תוצאות

מבנה לביטוי של מקדם T7 המכיל hyPBase: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: אות פולי (A) נוצר (איור 1A) והוגבר כשבר PCR ~ 2.2 kb כדי לסנתז hyPBase mRNA במבחנה (איור 1B). לאחר מכן, ה- hyPBase mRNA יוצר ונחשף לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. ה- mRNA בגודל הצפוי (כ- 1.1 kb band) זוהה על ג'ל אגרוז 1% (איור ...

Discussion

השיעור הנמוך של טרנספוזיציה וקושי בהעברת רכיבים מהונדסים לעוברים טריים מגבילים את ההצלחה של טרנספורמציה נבטים בחרקים רבים שאינם מודל, במיוחד אלה מהסדר, לפידופטרה. כדי להגדיל את קצב הטרנספורמציה של חיידקים, גרסה היפראקטיבית של piggyBac transposase הנפוץ ביותר (hyPBase)^{פותחה 7,}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5" Dental Cotton Rolls	PlastCare USA	8542025591	REARING
1 oz Souffle Cup Lids	DART	PL1N
1 oz Souffle Cups	DART	P100N	REARING
48 oz Plastic Deli Containers	Genpack	AD48	REARING
Add-on Filter Set (Green)	NightSea LLC	SFA-BLFS-GR	SCREENING
Borosilicate Glass	Sutter Instruments	BF100-50-10	INJECTION
Borosilicate Glass	SUTTER INSTRUMENT	BF-100-50-10
Dissecting Scope	Nikon	SMZ745T	SCREENING
Featherweight Forceps	BioQuip	4750	REARING
Gutter Guard	ThermWell Products	VX620	REARING
Inverted Microscope	Olympus	IX71	INJECTION
Microinjector	Narishige	IM-300	INJECTION
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	INJECTION
Microscope Slides	VWR	16004-22	INJECTION
NightSea Full System	NightSea LLC	SFA-RB-DIM	SCREENING
Nitrogen Gas	AWG/Scott-Gross	NI 225	INJECTION
Paper Towels	Bounty	43217-45074	REARING
Spodoptera frugiperda Artificial Diet	Southland Products, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Spodoptera frugiperda Eggs	Benzon Research, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Taq MasterMix			polymerase mixture