PiggyActivoBac Transformación de la línea germinal mediada por transposasa en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda

Resumen

La transformación exitosa de la línea germinal en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda,se logró utilizando ARNm de la transposasa hiperactiva piggyBac.

Resumen

La inserción estable de carga genética en los genomas de insectos utilizando elementos transponibles es una herramienta poderosa para estudios genómicos funcionales y el desarrollo de estrategias genéticas de manejo de plagas. El elemento transponible más utilizado en la transformación de insectos es piggyBac,y la transformación de la línea germinal basada en piggyBacse ha llevado a cabo con éxito en insectos modelo. Sin embargo, todavía es un desafío emplear esta tecnología en insectos no modelo que incluyen plagas agrícolas. Este artículo informa sobre la transformación de la línea germinal de una plaga agrícola global, el gusano cogollero (FAW), Spodoptera frugiperda,utilizando la transponasa hiperactiva piggyBac (hyPBase).

En este trabajo, el ARNm hyPBase fue producido y utilizado en lugar del plásmido ayudante en microinyecciones embrionarias. Este cambio condujo a la generación exitosa de FAW transgénicos. Además, también se describen los métodos de cribado de animales transgénicos, la detección rápida basada en PCR de la inserción de transgenes y la determinación del sitio de integración basada en PCR entrelazada asimétrica térmica (TAIL-PCR). Por lo tanto, este trabajo presenta un protocolo para producir FAW transgénico, que facilitará la transgénesis basada en piggyBacen FAW y otros insectos lepidópteros.

Introducción

El gusano cogollero (FAW), Spodoptera frugiperda,es originario de las regiones tropicales y subtropicales de América. Actualmente, este es un insecto herbívoro devastador en más de 100 países en todo el mundo¹. Las larvas de FAW se alimentan de más de 350 plantas huésped, incluidos algunos cultivos alimentarios básicos importantes². La fuerte capacidad de migración de los adultos FAW contribuye a su reciente y rápida propagación desde las Américas a otros lugares^1,2. Como resultado, este insecto ahora está amenazando la seguridad alimentaria a nivel internacional. La aplicación de nuevas tecnologías puede facilitar estudios avanzados en FAW y proporcionar estrategias novedosas para controlar esta plaga.

La transformación de la línea germinal de insectos se ha utilizado para estudiar la función de los genes y generar insectos transgénicos para su uso en el control genético^3,4. Entre los diversos métodos utilizados para lograr la transformación genética en insectos, el método basado en elementos piggyBac es el método más utilizado⁵. Sin embargo, debido a la baja tasa de transposición, sigue siendo difícil llevar a cabo la transgénesis en insectos no modelo. Recientemente, se desarrolló una versión hiperactiva de la transposasa piggyBac (hyPBase)^6,7. La transformación de la línea germinal se logró en FAW recientemente^8,que es el primer informe que utilizó la hyPBase en insectos lepidópteros. En este informe, se describe información detallada sobre el empleo de ARNm de hyPBase en la generación de FAW transgénicos. El método descrito aquí podría aplicarse para lograr la transformación de otros insectos lepidópteros.

Protocolo

1. Síntesis in vitro de arNm hyPBase

NOTA: La secuencia codificante completa de la secuencia hyPBase se sintetizó e insertó en un vector pTD1-Cas9 (consulte la Tabla de materiales)para producir la construcción pTD1-hyPBase, que contiene un casete que expresa hyPBase, promotor T7: poliedrín-5' UTR: hyPBase: poliedrín-3' UTR: poli (A). La secuencia completa de la construcción pTD1-hyPBase se proporciona en el Material suplementario.

1. Preparación de la plantilla para síntesis in vitro
   1. Realice una reacción de PCR para amplificar el cassette que expresa hyPBase utilizando una imprimación hacia adelante, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', y una imprimación inversa 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', polimerasa de alta fidelidad y plásmido pTD1-hyPBase como plantilla.
      NOTA: La reacción de PCR (volumen final de 50 μL) contiene 5,0 μL de tampón de reacción 10x, 4,0 μL de trifosfato de desoxinucleósido de 10 mM (dNTP), 1,0 μL de plásmido (50 μg/μL), 1,0 μL de polimerasa de alta fidelidad, 1,0 μL cada uno de 10 μM de cebadores hacia adelante y hacia atrás, y 33 μL de agua libre de nucleasa. Los ajustes fueron los siguientes: una incubación inicial de 95 °C durante 3 min, seguida de 35 ciclos de 98 °C durante 10 s, 60 °C durante 15 s y 68 °C durante 2 min.
   2. Revise el producto de PCR en un gel de agarosa al 1% a 120 V en tampón fresco de ácido tetraacético tris-acetato-etilendiamina (TAE) durante 30 minutos y purifique el producto con el kit de extracción de gel.
      NOTA: No utilice el kit de purificación del producto PCR. Incluso una pequeña cantidad del plásmido pTD1-hyPBase disminuye significativamente la eficiencia de la síntesis in vitro.
2. Síntesis in vitro de arNm hyPBase utilizando un kit comercial
   1. Descongele completamente los reactivos congelados, mantenga la enzima y 2 veces la solución NTP / CAP en hielo y deje el tampón de reacción 10x descongelado a temperatura ambiente.
   2. Montar la reacción a temperatura ambiente añadiendo los siguientes componentes: 2x solución NTP/CAP: 10 μL; 10x Tampón de reacción: 2 μL; ADN de plantilla: 0.1-0.2 μg; Mezcla de enzimas: 2 μL; Agua libre de nucleasas a 20 μL.
   3. Mezcle bien los reactivos canalizando suavemente la mezcla hacia arriba y hacia abajo e incube a 37 °C durante 2-4 h.
3. Recuperación de ARNm sintetizado por precipitación de cloruro de litio
   1. Agregue 30 μL de solución de precipitación de LiCl, mezcle bien moviendo el tubo y luego manténgalo a -20 ° C durante ≥ 30 min.
   2. Centrifugar a 4 °C durante 15 min a la velocidad máxima, y retirar con cuidado el sobrenadante.
   3. Lave el pellet una vez con 1 ml de etanol al 70%, vuelva a centrifugar y retire el sobrenadante con cuidado.
   4. Seque el pellet a temperatura ambiente durante 1-2 min, y luego vuelva a suspender el pellet con 20-40 μL de agua libre de nucleasas.
   5. Diluir 1 μL de solución de ARNm con 9 μL de agua libre de nucleasas. Tome 2 μL para determinar la concentración de ARNm y use 8 μL para verificar la calidad del ARNm en un gel de agarosa al 1% a 100 V en tampón TAE fresco durante 40 min.
   6. Alícuota la solución de ARNm y guárdala congelada a -70 °C durante un máximo de un año.
      NOTA: No seque completamente el gránulo de ARNm; puede ser más difícil disolverlo en agua.

2. Microinyección

1. Colección de huevos
   1. Coloque 12 pupas macho y 12 pupas hembra en una caja de 15 cm x 15 cm x 10 cm. Cubra la caja con una toalla de papel. Coloque una solución de sacarosa al 10% en la caja para alimentar a los adultos.
   2. El día 2 después de la eclosión, exponga a los adultos a una luz intensa durante la noche.
   3. En el día 3 después de la eclosión, transfiera a los adultos del paso 2.1.2 a un lugar oscuro. Recoger los embriones dentro de las 2 h posteriores a la oviposición.
   4. Agregue gotas de agua al pedazo de una toalla de papel con huevos frescos guardados en una placa de Petri sobre hielo. Transfiera los huevos suavemente a un portaobjetos de vidrio con un cepillo fino y alinearlos uno por uno en un portaobjetos de vidrio. Mantenga los portaobjetos de vidrio con los huevos alineados en hielo antes de la microinyección.
2. Configuración de microinyección
   1. Inyecte una mezcla de un plásmido transgénico que expresa la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) (200 ng / μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, ARNm hyPBase (200 ng / μL) y agua destilada estéril en los huevos, utilizando la presión de compensación del microinyector automatizado (consulte la Tabla de materiales).
   2. Mantenga los huevos inyectados a 27 ± 1 °C, 60 ± 10% de humedad relativa hasta la eclosión.
   3. Alimente a las larvas eclosionadas con una dieta artificial y transfiera cada larva a una taza pequeña a principios de la^3ª etapa instar (~ 6 mm de longitud, y el color del cuerpo se vuelve negro).

3. Cribado de fluorescencia y cruce genético

1. Recoge las pupas y coloca ~150 pupas hembra y ~150 pupas macho en una jaula de 35 cm x 35 cm x 35 cm. Cuelgue varios trozos de toallas de papel (~ 30 cm x 15 cm) en la jaula para recoger los huevos.
2. Recoja las toallas de papel con huevos diariamente y mantenga los huevos a 27 ± 1 ° C, 60 ± 10% de humedad relativa hasta la eclosión.
3. Mantenga las larvas neonatas a 4 °C durante 5 minutos para inmovilizarlas y luego transfiéralas a una placa helada.
4. Examinar las larvas neonoliadas inmovilizadas bajo un estereomicroscopio de fluorescencia. Seleccione los neonatos EGFP positivos, elévelos a la etapa pupal en ~ 2 semanas a 27 ± 1 ° C, y sepárelos por sexo de acuerdo con las diferencias de fenotipo en los segmentos ventrales del abdomen.
   NOTA: La pupa hembra tiene una abertura genital en forma de hendidura en el octavo segmento abdominal y los márgenes cefálicos del noveno y décimo segmento que se curvan hacia la abertura genital. La abertura genital de la pupa masculina tiene una ligera elevación en el noveno segmento abdominal.
5. Coloque las pupas EGFP positivas y las pupas de tipo salvaje del sexo opuesto en una proporción macho:hembra de 1:1 en una jaula. Sib-cruza los adultos que expresan EGFP para producir las siguientes generaciones.

4. Detección por PCR de inserción transgénica

1. Extraiga ADN genómico de las larvas individuales de tipo silvestre y EGFP positivo utilizando cualquier kit de extracción de ADN genómico comercial siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Realizar una reacción de PCR utilizando el ADN genómico como plantilla; una cartilla delantera, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3' situada en la región promotora ie1; y un cebador inverso, 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3' situado en la región EGFP del vector de transformación.
3. Configure cada reacción de PCR (volumen final de 40 μL) para que contenga 20 μL de la mezcla de polimerasa, 1,0 μL de ADN genómico (40 μg/μL), 1,0 μL cada uno de los cebadores de 10 μM hacia adelante y hacia atrás, y 17 μL de agua libre de nucleasas. Utilice los siguientes ajustes: una incubación inicial de 95 °C durante 3 min, seguida de 35 ciclos de 95 °C durante 20 s, 56 °C durante 20 s y 68 °C durante 40 s.
4. Revise los productos de PCR en un gel de agarosa al 1% a 120 V durante 30 min.

5. Determinación del sitio de inserción transgénica

1. Realizar TAIL-PCR de alta eficiencia utilizando ADN genómico como plantilla para determinar el sitio de integración de la inserción de transgenes en los insectos EGFP-positivos.
   1. Realizar las reacciones de PCR siguiendo los pasos descritos en otra parte⁹.
      1. Utilice tres cebadores, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', y P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgct-3', que son específicos del vector piggyBac, en las 3 rondas de reacción de PCR, respectivamente.
2. Secuenciar los productos finales de PCR para determinar el sitio de integración.

Resultados

Un constructo para la expresión del promotor T7 que contiene hyPBase: poliedrín-5'UTR: hyPBase: poliedrín-3'UTR: se generó una señal poli (A)(Figura 1A)y se amplificó como un fragmento de PCR de ~2,2 kb para sintetizar el ARNm de hyPBase in vitro (Figura 1B). Luego, se produjo el ARNm hyPBase y se sometió a electroforesis en gel de agarosa. El ARNm del tamaño esperado (~1.1 kb banda) se detectó en un gel de agarosa al 1%(Fi...

Discusión

La baja tasa de transposición y la dificultad de administrar componentes transgénicos en embriones frescos limitan el éxito de la transformación de la línea germinal en muchos insectos no modelo, especialmente aquellos de orden, Lepidoptera. Para aumentar la tasa de transformación de la línea germinal, se desarrolló una versión hiperactiva de la transposasa piggyBac más utilizada (hyPBase)^7,10. Hasta la fecha, la transformación exitosa de la l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5" Dental Cotton Rolls	PlastCare USA	8542025591	REARING
1 oz Souffle Cup Lids	DART	PL1N
1 oz Souffle Cups	DART	P100N	REARING
48 oz Plastic Deli Containers	Genpack	AD48	REARING
Add-on Filter Set (Green)	NightSea LLC	SFA-BLFS-GR	SCREENING
Borosilicate Glass	Sutter Instruments	BF100-50-10	INJECTION
Borosilicate Glass	SUTTER INSTRUMENT	BF-100-50-10
Dissecting Scope	Nikon	SMZ745T	SCREENING
Featherweight Forceps	BioQuip	4750	REARING
Gutter Guard	ThermWell Products	VX620	REARING
Inverted Microscope	Olympus	IX71	INJECTION
Microinjector	Narishige	IM-300	INJECTION
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	INJECTION
Microscope Slides	VWR	16004-22	INJECTION
NightSea Full System	NightSea LLC	SFA-RB-DIM	SCREENING
Nitrogen Gas	AWG/Scott-Gross	NI 225	INJECTION
Paper Towels	Bounty	43217-45074	REARING
Spodoptera frugiperda Artificial Diet	Southland Products, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Spodoptera frugiperda Eggs	Benzon Research, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Taq MasterMix			polymerase mixture