가을 육군벌레, 스포드옵테라 검소한에서 활동적인 피기박 트랜스포사스 중재 된 세균라인 변환

요약

가을 군벌레, 스포드옵테라 검거르다에서성공적인 생식선 변환은, 활동적인 돼지박 트랜스포사제의 mRNA를 사용하여 달성되었다.

초록

유전적 화물을 변형 가능한 원소를 사용하여 곤충 게놈에 안정적으로 삽입하는 것은 기능성 게놈 연구및 유전자 해충 관리 전략을 개발하기 위한 강력한 도구입니다. 곤충 변환에서 가장 많이 사용되는 형질 전환 요소는 돼지 박이며, 돼지 박기반 의 생식선 변환은 성공적으로 모델 곤충에서 수행되었습니다. 그러나, 농업 해충을 포함 하는 비 모델 곤충에이 기술을 채택 하는 여전히 도전. 이 논문은 전 세계 농업 해충, 가을 군벌레 (FAW), 스포드 옵테라 검거르다,활동적인 돼지 박 트랜스포사아제 (hyPBase)를 사용하여 생식선 변환에 보고합니다.

이 작품에서 hyPBase mRNA는 배아 미세 주입에서 도우미 플라스미드 대신 에 생산및 사용되었습니다. 이러한 변화는 트랜스제닉 FAW의 성공적인 세대로 이어졌습니다. 더욱이, 형질전환동물의 선별 방법, PCR 계의 신속한 트랜스진 삽입 및 열 비대칭 인터레이스 PCR(TAIL-PCR) 기반의 통합 부위의 결정도 설명된다. 따라서, 이 논문은 FAW 및 그밖 lepidopteran 곤충에 있는 돼지박기지를 둔 전염을 촉진할 환생 FAW를 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

서문

가을 군벌레 (FAW), Spodoptera 검소한다,미국의 열대 및 아열대 지역 출신이다. 현재, 이것은 전 세계 100 개 이상의 국가에서 파괴적인 곤충 초식^{동물입니다 1.} FAW 애벌레는 몇 가지 중요한 주식 작물 을 포함하여 350 개 이상의 호스트 식물에 사료^2. FAW 성인의 강력한 이주 능력은 최근 미대륙에서 다른 장소로 급속한 확산에 기여^1,2. 그 결과, 이 곤충은 현재 국제적으로 식량 안보를 위협하고 있습니다. 새로운 기술을 적용하면 FAW의 고급 연구를 용이하게하고이 해충을 관리하는 새로운 전략을 제공 할 수 있습니다.

곤충 생식선 변환유전자 기능을 연구하고 유전자 제어^3,4에사용하기 위해 형질전환 곤충을 생성하는 데 사용되어 왔다. 곤충의 유전적 변화를 달성하는 데 사용되는 다양한 방법 중, 돼지박 원소 기반 방법은 가장 많이 사용되는 방법^5이다. 그러나, 전치의 낮은 비율로 인해, 비 모델 곤충에서 전염을 수행하는 것은 여전히 도전이다. 최근에는 피기박 트랜스포사아제(hyPBase)의 활동적인 버전이^6,7로개발되었다. Germline 변환은 최근 FAW에서 달성되었다^8,이는 lepidopteran 곤충에 hyPBase를 사용하는 첫 번째 보고서입니다. 본 보고서에서, 형질전환 FAW 생성에 hyPBase mRNA를 채용에 대한 자세한 정보가 설명된다. 여기에 설명된 방법은 다른 lepidopteran 곤충의 변환을 달성하기 위해 적용될 수 있었다.

프로토콜

1. hyPBase mRNA의 체외 합성

참고: hyPBase 서열의 전체 코딩 시퀀스는 합성 및 pTD1-Cas9 벡터에 삽입되었다 (재료의 표참조) hyPBase 표현 카세트를 포함하는 pTD1-hyPBase 구조를 생산, T7 프로모터 : 폴리 헤드린 -5'UTR : hyPBase : 폴리 히프린 - 3'UTR. pTD1-hyPBase 구조의 전체 시퀀스는 보충 재료에제공됩니다.

1. 체외 합성을 위한 템플릿 준비
   1. PCR 반응을 수행하여 전방 프라이머, 5'-atgcgggtgaaataccgcacaggcg-3', 역프라이머 5'-tagaggccaaggttatgctag-3', 고충실도 폴리머라제 및 pTD1-hyPBase 플라미드를 사용하여 하이PBase 표현 카세트를 증폭시한다.
      참고: PCR 반응(50 μL의 최종 부피)에는 10x 반응 버퍼의 5.0 μL이 포함되어 있습니다. 4.0 μL 의 10 mM 데옥시뉴클레오사이드 삼중산염(dNTP), 플라스미드 1.0 μL(50μg/μL), 고충실도 폴리머라제 1.0 μL, 10μM 의 전방 및 역프라이머 각각 1.0 μL, 뉴클레아스 프리 워터 33 μL. 설정은 다음과 같이: 3 분 동안 95 °C의 초기 인큐베이션, 10 초에 대한 98 °C의 35 사이클, 15 초에 대한 60 °C, 2 분 동안 68 °C.
   2. 신선한 트리세테이트 에틸렌디아민 테트라아세산(TAE) 완충제에서 120V의 1% 아가로즈 젤로 PCR 제품을 30분 간 확인하고 젤 추출 키트로 제품을 정화합니다.
      참고 : PCR 제품 정화 키트를 사용하지 마십시오. pTD1-hyPBase 플라스미드의 미량조차도 체외 합성의 효율을 크게 감소시다.
2. 상용 키트를 이용한 hyPBase mRNA의 체외 합성
   1. 냉동 시약을 완전히 해동하고, 효소와 2배 NTP/CAP 용액을 얼음 위에 보관하고, 해동된 10x 반응 버퍼를 실온에서 남깁니다.
   2. 다음 구성 요소를 추가하여 실온에서 반응을 조립 : 2x NTP / CAP 용액 : 10 μL; 10x 반응 버퍼: 2 μL; 템플릿 DNA: 0.1-0.2 μg; 효소 혼합: 2 μL; 20 μL에 핵이없는 물.
   3. 혼합물을 위아래로 부드럽게 파이프팅하여 시약을 37°C에서 2-4h로 부드럽게 섞는다.
3. 염화리튬 강수량에 의한 합성 mRNA 의 회수
   1. LiCl 침전액의 30 μL을 추가하고 튜브를 가볍게 섞은 다음 -20 °C에서 ≥ 30 분 동안 유지하십시오.
   2. 최대 속도로 15분 동안 4°C의 원심분리기는 상체를 조심스럽게 제거합니다.
   3. 펠릿을 70% 에탄올 1mL로 한 번 씻고, 재원심분리기를 조심스럽게 제거합니다.
   4. 실온에서 펠릿을 1-2분 동안 건조한 다음, 20-40 μL의 뉴클레아제 없는 물로 펠릿을 다시 분리한다.
   5. 핵이 없는 물의 9μL로 mRNA 용액 1μL을 희석시하십시오. 2 μL을 사용하여 mRNA 농도를 결정하고 8 μL을 사용하여 신선한 TAE 버퍼에서 100 V에서 1% 아가로즈 젤에서 mRNA 품질을 확인하십시오.
   6. mRNA 용액을 알리쿼트하고 최대 1년 동안 -70°C에서 냉동 보관하십시오.
      참고 : mRNA 펠릿을 완전히 건조시키지 마십시오. 물에 녹는 것이 더 어려울 수 있습니다.

2. 미세 주입

1. 계란 컬렉션
   1. 15cm x 15cm x 10cm 상자에 12개의 수컷 강아지와 12개의 암컷 강아지를 놓습니다. 종이 타월로 상자를 덮습니다. 성인에게 먹이를 주기 위해 10% 자당 용액을 상자에 놓습니다.
   2. 2일째에 포스트 백과사전, 하룻밤 강렬한 빛에 성인을 노출.
   3. 3일째에는 성인을 2.1.2단계에서 어두운 곳으로 옮기는다. 배반 후 2 시간 이내에 배아를 수집합니다.
   4. 신선한 달걀을 얼음 위에 보관한 종이 타월 조각에 물 방울을 넣습니다. 계란을 미세한 브러시로 유리 슬라이드에 부드럽게 옮기고 유리 슬라이드에 하나씩 정렬합니다. 마이크로 주입하기 전에 유리 슬라이드를 얼음 위에 정렬 된 계란과 함께 유지하십시오.
2. 미세 주입 설정
   1. 형질 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP)-표현 플라스미드 (200 ng/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hyPBase mRNA (200 ng/μL), 및 멸균 증류수를 계란에 주입하여 자동화 된 미세 주입기의 보상 압력을 사용하여 (재료의 표참조).
   2. 주입된 계란을 27± 1°C, 60± 10% 상대 습도에서 부화할 때까지 보관하십시오.
   3. 부화유를 인공 식단에 먹이고, 각 애벌레를^3rd instar 초반에 작은 컵 한 잔으로 옮기고(길이가 6mm, 바디 컬러는 검게 변합니다).

3. 형광 검사 및 유전 횡단

1. 35cm x 35cm x 35cm 케이지에 새끼를 모으고 ~ 150 개의 암컷 강아지와 ~ 150 개의 수컷 강아지를 배치하십시오. 계란을 수집하기 위해 케이지에 종이 타월 (~ 30cm x 15cm)의 여러 조각을 걸어.
2. 매일 달걀로 종이 타월을 수집하고, 27 ± 1 °C, 60 ± 10 % 상대 습도에서 부화 될 때까지 보관하십시오.
3. 신산 유충을 4°C에서 5분 동안 보관한 다음 얼음 냉판으로 옮긴다.
4. 형광 스테레오 현미경으로 고정 된 신생아 애벌레를 검사하십시오. EGFP 양성 신생아를 선택하고, 27± 1°C에서 ~2주 만에 푸팔 단계로 올리고, 복부 세그먼트의 표현형 차이에 따라 성별에 따라 분리한다.
   참고 : 여성 강아지는 여덟 번째 복부 세그먼트에 슬릿 같은 생식기 개구부와 생식기 개구부를 향해 휘어진 아홉 번째 및 열 번째 세그먼트의 세팔릭 마진을 가지고 있습니다. 남성 강아지의 생식기 개구부는 아홉 번째 복부 세그먼트에 약간의 고도가 있습니다.
5. EGFP 양성 강아지와 이성의 야생 형 강아지를 남성에 놓습니다 : 케이지에 1:1의 여성 비율. 다음 세대를 생산하기 위해 EGFP 를 표현하는 성인을 Sib-cross.

4. 형질 전환 삽입의 PCR 검출

1. 제조 업체의 지시에 따라 모든 상업적게놈 DNA 추출 키트를 사용 하 여 야생 형 및 EGFP 양성 개별 애벌레에서 게놈 DNA를 추출.
2. 유전체 DNA를 템플릿으로 사용하여 PCR 반응을 수행; ie1 프로모터 지역에 위치한 5'-acgtacgctcctccgttccgttc-3' 전방 프라이머; 및 역프라이머, 5'-aagcactgcacgccgtaggtcag-3' 변환 벡터의 EGFP 영역에 위치.
3. 각 PCR 반응(40 μL의 최종 부피)을 설정하여 폴리머라제 혼합물의 20 μL, 게놈 DNA 1.0 μL(40 μg/μL), 10μM 의 전방 및 역프라이머 각각 1.0 μL, 뉴클레아제 없는 물의 17μL을 포함한다. 다음 설정을 사용하십시오: 3분 동안 95°C의 초기 인큐베이션, 20s용 95°C의 35사이클, 20s용 56°C, 40s 설정의 경우 68°C가 뒤따릅니다.
4. PCR 제품을 1% 아가로즈 젤120 V에서 30분 동안 확인하십시오.

5. 형질전환 삽입 부위의 결정

1. EGFP 양성 곤충에서 트랜스진 삽입의 통합 부위를 결정하기 위해 유전체 DNA를 템플릿으로 사용하여 고효율 TAIL-PCR을 수행한다.
   1. 다른 곳에서 설명된 단계^9다음에PCR 반응을 수행한다.
      1. P1: 5'-atcagtgacactctaccgcattgaagcacgcc-3', P2: 5'tcacgggagctccagcggcgactg-3', 및 P3: 5'atgttaatgcgcgcgacggacgcgct-3', p3: 5'-atgttaatgcgcgacggacgcgct-3'를 사용 하 여, p1, p1의 반응에 특정, 3'.
2. 최종 PCR 제품을 시퀀스하여 통합 사이트를 결정합니다.

결과

hyPBase 함유 T7 프로모터의 발현을 위한 구조: 폴리히드린-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: 폴리헤드론-3'UTR: 폴리(A) 신호가 생성되었다(도1A)및 hyPBase mRNA 생체외(도 1B)를합성하기 위해 ~2.2kb PCR 단편으로 증폭되었다. 이어서, hyPBase mRNA가 생성되고 아가로즈 겔 전기포광을 하였다. 예상 크기의 mRNA(~1.1kb 대역)는 1% 아가로즈겔(도 1C)에서

토론

트랜스제닉 성분을 신선한 배아로 전달하는 낮은 비율과 트랜스제너란을 신선한 배아로 전달하는 어려움은 많은 비모델 곤충, 특히 질서, Lepidoptera의 생식선 변환의 성공을 제한합니다. 세균선 변환 속도를 높이기 위해 가장 널리 사용되는 피기박 트랜스포사아제(hyPBase)의 활동적인 버전이^7,10을개발하였다. 현재까지, lepidopteran 곤충의 성공적인 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5" Dental Cotton Rolls	PlastCare USA	8542025591	REARING
1 oz Souffle Cup Lids	DART	PL1N
1 oz Souffle Cups	DART	P100N	REARING
48 oz Plastic Deli Containers	Genpack	AD48	REARING
Add-on Filter Set (Green)	NightSea LLC	SFA-BLFS-GR	SCREENING
Borosilicate Glass	Sutter Instruments	BF100-50-10	INJECTION
Borosilicate Glass	SUTTER INSTRUMENT	BF-100-50-10
Dissecting Scope	Nikon	SMZ745T	SCREENING
Featherweight Forceps	BioQuip	4750	REARING
Gutter Guard	ThermWell Products	VX620	REARING
Inverted Microscope	Olympus	IX71	INJECTION
Microinjector	Narishige	IM-300	INJECTION
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	INJECTION
Microscope Slides	VWR	16004-22	INJECTION
NightSea Full System	NightSea LLC	SFA-RB-DIM	SCREENING
Nitrogen Gas	AWG/Scott-Gross	NI 225	INJECTION
Paper Towels	Bounty	43217-45074	REARING
Spodoptera frugiperda Artificial Diet	Southland Products, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Spodoptera frugiperda Eggs	Benzon Research, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Taq MasterMix			polymerase mixture