JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Успешная трансформация зародышевой линии у травяной совки, Spodoptera frugiperda,была достигнута с помощью мРНК гиперактивной транспоза piggyBac.

Аннотация

Стабильная вставка генетического груза в геномы насекомых с использованием транспонируемых элементов является мощным инструментом для функциональных геномных исследований и разработки стратегий борьбы с генетическими вредителями. Наиболее используемым транспонируемым элементом в трансформации насекомых является piggyBac,а трансформация зародышевой линии на основе piggyBacбыла успешно проведена у модельных насекомых. Тем не менее, по-прежнему сложно использовать эту технологию у немодельных насекомых, которые включают сельскохозяйственных вредителей. В этой статье сообщается о трансформации зародышевой линии глобального сельскохозяйственного вредителя, травяной совки (FAW), Spodoptera frugiperda,с использованием гиперактивной транспоза piggyBac (hyPBase).

В этой работе мРНК hyPBase была получена и использована вместо плазмиды-хелпера в микроинъекциях эмбриона. Это изменение привело к успешному поколению трансгенных FAW. Кроме того, описаны методы скрининга трансгенных животных, быстрого обнаружения трансгенной вставки трансгена на основе ПЦР и определения сайта интеграции на основе термической асимметричной чересстрочной ПЦР (TAIL-PCR). Таким образом, в данной работе представлен протокол получения трансгенного FAW, который облегчит трансгенез на основе piggyBacу FAW и других чешуекрылых насекомых.

Введение

Травяная совка (FAW), Spodoptera frugiperda,является родной для тропических и субтропических регионов Америки. В настоящее время это разрушительное насекомое травоядное животное в более чем 100 странах мира1. Личинки FAW питаются более чем 350 растениями-хозяевами, включая некоторые важные основные продовольственные культуры2. Сильная миграционная способность взрослых особей FAW способствует его недавнему быстрому распространению из Северной и Южной Америки в другие места1,2. В результате это насекомое в настоящее время угрожает продовольственной безопасности на международном уровне. Применение новых технологий может способствовать проведению углубленных исследований в FAW и обеспечить новые стратегии борьбы с этим вредителем.

Трансформация зародышевой линии насекомых была использована для изучения функции генов и генерации трансгенных насекомых для использования в генетическом контроле3,4. Среди различных методов, используемых для достижения генетической трансформации у насекомых, метод на основе элементов piggyBac является наиболее используемым методом5. Однако из-за низкой скорости транспозиции по-прежнему сложно проводить трансгенез у немодельных насекомых. Недавно была разработана гиперактивная версия транспозазы piggyBac (hyPBase)6,7. Трансформация зародышевой линии была достигнута в FAW недавно8,что является первым отчетом, в котором используется hyPBase у чешуекрылых насекомых. В этом отчете описана подробная информация об использовании мРНК hyPBase для генерации трансгенного FAW. Метод, описанный здесь, может быть применен для достижения трансформации других чешуекрылых насекомых.

протокол

1. In vitro синтез мРНК hyPBase

ПРИМЕЧАНИЕ: Полная кодирующая последовательность последовательности hyPBase была синтезирована и вставлена в вектор pTD1-Cas9 (см. Таблицу материалов)для получения конструкции pTD1-hyPBase, которая содержит экспрессирующую hyPBase кассету, промотор T7: polyhedrin-5' UTR: hyPBase: polyhedrin-3' UTR: poly (A). Полная последовательность конструкции pTD1-hyPBase приведена в Дополнительном материале.

  1. Подготовка шаблона для синтеза in vitro
    1. Выполните реакцию ПЦР для усиления экспрессирующей hyPBase кассеты с использованием прямого праймера, 5'-atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', и обратного праймера 5'-tagaggccccaaggggttatgctag-3', высокоточной полимеразы и плазмиды pTD1-hyPBase в качестве шаблона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция ПЦР (конечный объем 50 мкл) содержит 5,0 мкл 10x реакционного буфера, 4,0 мкл дезоксинуклеозидтрифосфата (dNTP), 1,0 мкл плазмиды (50 мкг/мкл), 1,0 мкл высокоточной полимеразы, 1,0 мкл каждого из 10 мкМ прямых и обратных праймеров и 33 мкл воды без нуклеазы. Настройки были следующими: начальная инкубация 95 °C в течение 3 мин, затем 35 циклов 98 °C в течение 10 с, 60 °C в течение 15 с и 68 °C в течение 2 мин.
    2. Проверьте продукт ПЦР на 1% агарозном геле при 120 В в свежем буфере трис-ацетат-этилендиаминовой тетрауксусной кислоты (TAE) в течение 30 мин и очистите продукт с помощью набора для экстракции геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте комплект для очистки продукта ПЦР. Даже следовое количество плазмиды pTD1-hyPBase значительно снижает эффективность синтеза in vitro.
  2. Синтез in vitro мРНК hyPBase с использованием коммерческого набора
    1. Полностью разморозьте замороженные реагенты, держите фермент и 2x раствор NTP/CAP на льду и оставьте размороженный 10x реакционный буфер при комнатной температуре.
    2. Соберите реакцию при комнатной температуре, добавив следующие компоненты: 2x раствор NTP/CAP: 10 мкл; 10x Реакционный буфер: 2 мкл; ДНК шаблона: 0,1-0,2 мкг; Ферментная смесь: 2 мкл; Вода без нуклеаз до 20 мкл.
    3. Тщательно перемешайте реагенты, осторожно пипетируя смесь вверх и вниз и инкубируйте при 37 °C в течение 2-4 ч.
  3. Восстановление синтезированной мРНК путем осаждения хлорида лития
    1. Добавьте 30 мкл раствора для осаждения LiCl, тщательно перемешайте, щелкнув пробиркой, а затем держите при -20 °C в течение ≥ 30 мин.
    2. Центрифугу при 4 °C в течение 15 мин на максимальной скорости и аккуратно извлеките надосадочную кислоту.
    3. Вымойте гранулу один раз с 1 мл 70% этанола, повторно центрифугируйте и осторожно удалите супернатант.
    4. Высушите гранулу при комнатной температуре в течение 1-2 мин, а затем повторно суспендируйте гранулу 20-40 мкл воды без нуклеазы.
    5. Разбавить 1 мкл раствора мРНК 9 мкл воды без нуклеазы. Возьмите 2 мкл для определения концентрации мРНК и используйте 8 мкл для проверки качества мРНК на 1% агарозном геле при 100 В в свежем буфере TAE в течение 40 мин.
    6. Аликвот раствор мРНК и хранят замороженным при -70 °C до одного года.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не следует полностью сушить гранулы мРНК; может быть сложнее растворить его в воде.

2. Микроинъекция

  1. Коллекция яиц
    1. Поместите 12 самцов куколок и 12 самок куколок в коробку размером 15 см х 15 см х 10 см. Накройте коробку бумажным полотенцем. Поместите 10% раствор сахарозы в коробку для кормления взрослых.
    2. На 2 день после эклозии подвергайте взрослых интенсивному свету в течение ночи.
    3. На 3 день после эклозии переведите взрослых с шага 2.1.2 в темное место. Соберите эмбрионы в течение 2 ч после яйцекладки.
    4. Добавьте капли воды на лист бумажного полотенца со свежими яйцами, хранящимися в чашке Петри на льду. Аккуратно переложите яйца на стеклянную горку тонкой кистью и выровняйте их по одному на стеклянной горке. Держите стеклянные горки с выровненными яйцами на льду перед микроинъекцией.
  2. Установка микроинъекции
    1. Вводят в яйца смесь трансгенной усиленной зеленой флуоресцентной плазмиды (EGFP)-экспрессирующей плазмиды (200 нг/мкл), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, мРНК hyPBase (200 нг/мкл) и стерильной дистиллированной воды, используя компенсационное давление автоматизированного микроинжектора (см. Таблицу материалов).
    2. Держите введенные яйца при температуре 27 ± 1 °C, 60 ± 10% относительной влажности до вылупления.
    3. Кормите вылупившихся личинок на искусственной диете, и переведите каждую личинку в одну маленькую чашку на ранней3-й стадии звезды (~ 6 мм в длину, и цвет тела становится черным).

3. Флуоресцентный скрининг и генетическое скрещивание

  1. Соберите куколок и поместите ~150 самок куколок и ~150 самцов куколок в клетку размером 35 см х 35 см х 35 см. Повесьте несколько кусочков бумажных полотенец (~30 см х 15 см) в клетку, чтобы собрать яйца.
  2. Ежедневно собирайте бумажные полотенца с яйцами и держите яйца при температуре 27 ± 1 °C, 60 ± относительной влажности 10% до вылупления.
  3. Держите новорожденных личинок при 4 °C в течение 5 минут, чтобы обездвижить их, а затем переложите их на ледяную пластину.
  4. Скрининг обездвиженных личинок новорожденных под флуоресцентным стереомикроскопом. Выберите EGFP-положительных новорожденных, поднимите их до стадии куколки через ~ 2 недели при 27 ± 1 ° C и разделите их по полу в соответствии с различиями фенотипов в вентральных сегментах брюшной полости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Самка куколки имеет щелевидное генитальное отверстие на восьмом брюшном сегменте и головные края девятого и десятого сегментов, изогнутые к генитальному отверстию. Генитальное отверстие самца куколки имеет небольшое возвышение на девятом брюшном сегменте.
  5. Поместите EGFP-положительных куколок и куколок противоположного пола дикого типа в самца: соотношение самок 1:1 в клетку. Сиб-скрещивает EGFP-экспрессирующих взрослых особей, чтобы произвести следующие поколения.

4. ПЦР-обнаружение трансгенной вставки

  1. Извлеките геномную ДНК из диких и EGFP-положительных отдельных личинок, используя любой коммерческий набор для экстракции геномной ДНК в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Выполнить реакцию ПЦР с использованием геномной ДНК в качестве шаблона; передняя грунтовка, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3', расположенная в области промоутера ie1; и обратный праймер, 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3', расположенный в области EGFP вектора преобразования.
  3. Настройте каждую реакцию ПЦР (конечный объем 40 мкл) на содержание 20 мкл полимеразной смеси, 1,0 мкл геномной ДНК (40 мкг/мкл), 1,0 мкл каждого из 10 мкМ прямых и обратных праймеров и 17 мкл воды без нуклеаз. Используйте следующие настройки: начальная инкубация 95 °C в течение 3 мин, затем 35 циклов 95 °C в течение 20 с, 56 °C в течение 20 с и 68 °C в течение 40 с установок.
  4. Проверьте продукты ПЦР на 1% агарозном геле при 120 В в течение 30 мин.

5. Определение места трансгенной вставки

  1. Выполнить высокоэффективную TAIL-PCR с использованием геномной ДНК в качестве шаблона для определения места интеграции трансгенной вставки в EGFP-положительных насекомых.
    1. Выполняйте реакции ПЦР, следуя шагам, описанным в другом месте9.
      1. Используйте три праймера, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', и P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgct-3', которые специфичны для вектора piggyBac, в 3 раундах реакции ПЦР соответственно.
  2. Последовательность конечных продуктов ПЦР для определения места интеграции.

Результаты

Конструкция для экспрессии hyPBase-содержащего промотора T7: многогранника-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: поли(A) сигнал генерировали(рисунок 1A)и усиливали в виде ~2,2 кб ПЦР-фрагмента для синтеза мРНК hyPBase in vitro (рисунок 1B). Затем мРНК hyPBase продуцировали и подвергали эл?...

Обсуждение

Низкая скорость транспозиции и сложность доставки трансгенных компонентов в свежие эмбрионы ограничивают успех трансформации зародышевой линии у многих немодельных насекомых, особенно у чешуекрылых. Для увеличения скорости трансформации зародышевой линии была разработана гиперак?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Исследование, о котором сообщается, поддерживается Национальным научным фондом I / UCRC, Центром технологий управления членистоногими в рамках гранта No IIP-1821936 и отраслевыми партнерами, конкурентным грантом Инициативы по исследованиям в области сельского хозяйства и продовольствия No 2019-67013-29351 и Национальным институтом продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США (2019-67013-29351 и 2353057000).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5" Dental Cotton RollsPlastCare USA8542025591REARING
1 oz Souffle Cup LidsDARTPL1N
1 oz Souffle CupsDARTP100NREARING
48 oz Plastic Deli ContainersGenpackAD48REARING
Add-on Filter Set (Green)NightSea LLCSFA-BLFS-GRSCREENING
Borosilicate GlassSutter InstrumentsBF100-50-10INJECTION
Borosilicate GlassSUTTER INSTRUMENTBF-100-50-10
Dissecting ScopeNikonSMZ745TSCREENING
Featherweight ForcepsBioQuip4750REARING
Gutter GuardThermWell ProductsVX620REARING
Inverted MicroscopeOlympusIX71INJECTION
MicroinjectorNarishigeIM-300INJECTION
Micropipette PullerSutter InstrumentsP-1000INJECTION
Microscope SlidesVWR16004-22INJECTION
NightSea Full SystemNightSea LLCSFA-RB-DIMSCREENING
Nitrogen GasAWG/Scott-GrossNI 225INJECTION
Paper TowelsBounty 43217-45074REARING
Spodoptera frugiperda Artificial DietSouthland Products, IncN/A [Request Species/Quantity]REARING
Spodoptera frugiperda EggsBenzon Research, IncN/A [Request Species/Quantity]REARING
Taq MasterMixpolymerase mixture

Ссылки

  1. Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
  2. Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
  3. Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
  4. Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
  5. Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
  6. Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
  7. Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
  8. Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
  9. Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
  10. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  11. Xu, H., O'Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
  12. Wu, S. C. -. Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  13. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
  14. Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
  15. Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

175PiggyBacSpodoptera frugiperda

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены