Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة لعدم ربط البلغم بتعليق خلية واحدة والتوصيف اللاحق للمجموعات الفرعية الخلوية على منصات قياس التدفق الخلوي القياسية.

Abstract

يتم تحليل البلغم ، الذي يستخدم على نطاق واسع لدراسة المحتوى الخلوي والميزات الأخرى للبيئة الدقيقة لفهم صحة الرئة ، تقليديا باستخدام منهجيات قائمة على علم الخلايا. فائدته محدودة لأن قراءة الشرائح تستغرق وقتا طويلا وتتطلب موظفين متخصصين للغاية. وعلاوة على ذلك، فإن الحطام الواسع النطاق ووجود عدد كبير جدا من الخلايا الظهارية الحرشفية ، أو خلايا الخد ، غالبا ما يجعل العينة غير كافية للتشخيص. وعلى النقيض من ذلك، يسمح قياس التدفق الخلوي بطباعة الخلايا ذات الإنتاجية العالية مع استبعاد الحطام ومركبات الكربون المستدامة في نفس الوقت.

يصف البروتوكول المعروض هنا طريقة فعالة لتفكيك البلغم إلى تعليق خلية واحدة ، وصمة عار الأجسام المضادة وإصلاح المجموعات الخلوية ، والحصول على عينات على منصة قياس التدفق الخلوي. استراتيجية gating التي تصف استبعاد الحطام والخلايا الميتة (بما في ذلك الشركات الصغيرة والمتوسطة) ومزدوجات الخلية معروضة هنا. علاوة على ذلك ، يشرح هذا العمل أيضا كيفية تحليل خلايا البلغم الواحدة القابلة للتطبيق استنادا إلى مجموعة من التمايز (CD)45 مجموعات سكانية إيجابية وسلبية لتوصيف مجموعات فرعية من النسب الدموي والظهاري. كما يتم توفير مقياس لمراقبة الجودة من خلال تحديد الضامة الخاصة بالرئة كدليل على أن العينة مشتقة من الرئة وليست لعابا. وأخيرا، فقد ثبت أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها على منصات مختلفة من خلال توفير ملامح البلغم من نفس المريض تحليلها على ثلاثة مقاييس تدفق الخلايا. نافيوس EX، LSR الثاني، ولريك. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول ليشمل علامات خلوية إضافية ذات أهمية. يتم تقديم طريقة لتحليل عينة البلغم بأكملها على منصة قياس التدفق الخلوي هنا التي تجعل البلغم قابلا لتطوير تشخيص عالي الإنتاجية لمرض الرئة.

Introduction

وقد أتاحت التطورات التقنية في أجهزة وبرامج مقاييس التدفق الخلوي تحديد العديد من مجموعات الخلايا المتميزة في وقت واحد1,2,3,4. على سبيل المثال، أدى استخدام مقياس التدفق الخلوي في أبحاث الخلايا الدموية إلى فهم أفضل بكثير للجهاز المناعي2 والتسلسل الهرمي الخلوي للنظام الدموي(5)، فضلا عن التمييز التشخيصي للعديد من أنواع سرطان الدم المختلفة6,7,8. على الرغم من أن معظم خلايا البلغم هي من أصل دموي9,10,11, لم يتم تطبيق قياس التدفق الخلوي على نطاق واسع لتحليل البلغم لأغراض التشخيص. ومع ذلك، تشير العديد من الدراسات إلى أن تقييم مجموعات الخلايا المناعية في البلغم (أهم مجموعة فرعية من الخلايا) قد يكون عونا كبيرا في تشخيص و/أو مراقبة أمراض مثل الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)12,13,14,15. وعلاوة على ذلك، فإن وجود علامات خاصة بالظهارية التي يمكن استخدامها في قياس التدفق الخلوي يسمح باستجواب المجموعة الفرعية التالية الأكثر أهمية من الخلايا في البلغم، خلايا ظهارية الرئة.

بالإضافة إلى القدرة على تحليل العديد من مجموعات الخلايا المتميزة من أصول أنسجة مختلفة ، يمكن لقياس التدفق أن يقيم أعدادا كبيرة من الخلايا في فترة قصيرة نسبيا. وبالمقارنة، فإن أنواع التحليلات المستندة إلى الشرائح والسيكلوتية كثيرا ما تتطلب موظفين و/أو معدات عالية التخصص. يمكن أن تكون هذه التحليلات كثيفة العمالة ، مما يؤدي إلى تحليل نسبة فقط من عينة البلغم16.

تحد ثلاث قضايا حرجة من الاستخدام الواسع النطاق للسبيتوم في قياس التدفق الخلوي. تتعلق المشكلة الأولى بمجموعة البلغم. يتم جمع البلغم من خلال سعال النفخ الذي يطرد المخاط من الرئتين إلى تجويف الفم ، ويبصق لاحقا في كوب جمع. منذ المخاط يسافر من خلال تجويف الفم، وهناك فرصة كبيرة للتلوث SEC. هذا التلوث يعقد تحليل العينة ، ولكن يتم تصحيح المشكلة بسهولة على منصة قياس التدفق الخلوي ، كما هو موضح في هذه الدراسة.

ليس كل شخص يمكن أن تنتج البلغم تلقائيا; لذلك ، تم تطوير العديد من الأجهزة للمساعدة في جمع البلغم بطريقة غير الغازية17. البخاخات هو واحد من هذه الأجهزة، وقد ثبت لإنتاج عينات البلغم موثوق بها18,19,20. على الرغم من أن البخاخات هي وسيلة فعالة جدا لجمع البلغم غير الغازية ، إلا أن استخدامه لا يزال يتطلب إعدادا في منشأة طبية مع موظفين متخصصين21. في المقابل، يمكن استخدام الأجهزة المحمولة مثل الناي الرئة22,23,24 و acapella16,25 في المنزل لأنها سهلة الاستخدام للغاية. هذه الأجهزة مساعدة على حد سواء آمنة وفعالة من حيث التكلفة.

بالنسبة لنا، أعطى أكابيلا نتائج أفضل باستمرار من الناي الرئة16، وبالتالي، تم اختيار جهاز أكابيلا لمجموعات البلغم. تم تحديد عينة جمع لمدة 3 أيام لأن الغرض الأساسي لاستخدام البلغم هو تطوير اختبار الكشف عن سرطان الرئة16. وقد تبين أن عينة لمدة 3 أيام يزيد من احتمال الكشف عن سرطان الرئة مقارنة مع عينة 1-أو 2-يوم26,27,28. ومع ذلك، قد تكون أساليب أخرى لجمع البلغم الأفضل لأغراض مختلفة. إذا تم استخدام طريقة مختلفة لجمع البلغم من تلك الموصوفة هنا ، فمن المستحسن أن تثن بعناية كل الأجسام المضادة أو الصبغة المستخدمة لتحليل تدفق القياسات الخلوية ؛ تتوفر بيانات قليلة جدا حول كيفية تأثير طرق جمع البلغم المختلفة على البروتينات المستهدفة لقياس التدفق الخلوي.

القضية الثانية التي تقلل من الحماس لاستخدام البلغم للتشخيص ، تتعلق في المقام الأول بتدفق قياس الخلايا ، هو رقم الخلية. المشكلة هي جمع خلايا كافية قابلة للحياة لتحليل موثوق بها. أظهرت دراستان أن عينات البلغم التي تم جمعها بطرق غير جراحية ، بمساعدة جهاز مساعدة ، تحتوي على ما يكفي من الخلايا القابلة للحياة التي يمكن استخدامها في التشخيص السريري أو الدراسات البحثية16،24. ومع ذلك، لم تتناول أي من هاتين الدراستين مسألة أرقام الخلايا المتعلقة ب قياس التدفق الخلوي.

بالنسبة للدراسات التي تشكل الأساس لهذا البروتوكول، تم جمع عينات البلغم من المشاركين المعرضين لخطر كبير للإصابة بسرطان الرئة باتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية المعتمدة لكل موقع دراسة. تم تعريف المشاركين المعرضين لخطر كبير على أنه بين 55-75 سنة ، بعد أن دخنوا 30 عاما ولم يقلعوا عن التدخين خلال السنوات ال 15 الماضية. وقد تبين للمرضى كيفية استخدام جهاز أكابيلا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة29 وجمع البلغم لمدة ثلاثة أيام متتالية في المنزل. تم الاحتفاظ بالعينة في الثلاجة حتى المجموعة الأخيرة. وفي يوم الجمع الأخير، شحنت العينة إلى المختبر طوال الليل مع حزمة باردة مجمدة. وقد عولجت العينات لتصبح تعليقا لزنزانة واحدة في اليوم الذي وردت فيه. مع هذه الطريقة لجمع البلغم، يتم الحصول على أكثر من ما يكفي من الخلايا القابلة للحياة لتحليل التدفق الخلوي موثوق بها.

وأخيرا، والمتعلقة المشكلة رقم الخلية السابقة، هو السؤال عن كيفية تحرير خلايا البلغم من بيئتها mucinous. كيف يمكن الحفاظ على الخلايا قابلة للحياة وخلق تعليق خلية واحدة لا تسد مقياس التدفق الخلوي؟ استنادا إلى العمل الأولي من قبل Pizzichini et al.30 و Miller et al.31 ، يصف هذا البروتوكول طريقة سهلة وموثوقة لمعالجة البلغم في تعليق خلية واحدة مناسبة لتحليل التدفق الخلوي. وقد استخدمت هذه الطريقة مبادئ توجيهية راسخة في تدفق الخلايا32,33,34 لوضع استراتيجية فعالة لوضع العلامات على الأجسام المضادة لتحديد الخلايا الدموية والظهارية في البلغم وتوفير إعدادات الأداة، وتدابير مراقبة الجودة، والمبادئ التوجيهية للتحليل توحيد تحليل البلغم على منصة تدفق الخلايا.

Protocol

يتم تنفيذ جميع خطوات معالجة البلغم في خزانة السلامة البيولوجية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.

1. إعداد الكاشف قبل البدء في تفكك البلغم

  1. إذابة 1٪ بارافورمالديهايد (PFA)، 25 مل لكل عينة على الجليد، والحفاظ على البرد حتى الاستخدام.
    تنبيه: PFA سام عن طريق الاستنشاق والاتصال بالبشرة. إعداد المثبت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتجميد في -20 درجة مئوية في 25 مل aliquots حتى الاستخدام.
  2. تقريب وزن العينة وذوبان ما يكفي من 0.1٪ Dithiothreitol (DTT) للخطوة 2.2 وبذلك إلى 37 درجة مئوية. (يجب تخزين الاقتباسات من DTT عند -20 درجة مئوية قبل الاستخدام.)
  3. جلب ما يكفي 0.5٪ N-أسيتيل- L-السيستين (NAC) تصل إلى 37 درجة مئوية للخطوة 2.2. (يجب أن يتم إجراء NAC جديدة أسبوعيا وتخزينها في 4 درجة مئوية قبل الاستخدام.)

2. فصافر البلغم

  1. وزن عينة البلغم لتحديد أحجام الكواشف التفكك.
    ملاحظة: تعتبر العينة صغيرة إذا كان الوزن الأولي ≤3 غرام، ومتوسطة إذا كانت >3 غرام ولكن ≤8 غرام، وكبيرة إذا كانت >8 ولكن ≤16 غرام، وكبيرة جدا إذا كانت العينة تزن >16 غرام. سيتم استخدام المؤشرات الصغيرة والمتوسطة والكبيرة والكبيرة للغاية في جميع أنحاء البروتوكول. تختلف كمية الكواشف المطلوبة للتفكك ووضع العلامات وفقا لحجم عينة البلغم.
  2. نقل عينة صغيرة إلى أنبوب نظيف مخروطي 50 مل، عينة متوسطة إلى زجاجة نظيفة 250 مل البلاستيك المتاح، أو عينة كبيرة وكبيرة جدا إلى زجاجة نظيفة 500 مل البلاستيك المتاح. أضف وزن عينة 1 مل/غرام من 0.5٪ NAC و4 مل/غرام وزن عينة 0.1٪ DTT.
  3. دوامة بأقصى سرعة (لمدة 15 s)، ثم الصخور في درجة حرارة الغرفة (بأقصى سرعة) لمدة 15 دقيقة.
  4. تمييع العينة بأربعة مجلدات من محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS) (استنادا إلى الحجم الإجمالي للعينة + الكواشف) لتحييد NAC و DTT؛ دوامة بسرعة بأقصى سرعة والصخور في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في أقصى سرعة.
  5. تصفية تعليق الخلية من خلال 100 ميكرومتر من النايلون شبكة الخلية مصفاة (ق) في واحد أو أكثر من 50 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطي (ق) لإنشاء تعليق خلية واحدة.
  6. طرد الخلايا في 800 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. يستنشق supernatant، والجمع بين جميع الكريات في أنبوب واحد مخروطي 15 مل، ومن ثم غسل الكريات مع HBSS باستخدام نفس الشروط.
  7. Resuspend بيليه الخلية في حجم العازلة التي يحددها الوزن الأولي للعينة البلغم.
    ملاحظة: يتم إعادة إنفاق عينة صغيرة في 250 ميكرولتر من HBSS. يتم إعادة إنفاق عينة متوسطة في 760 ميكرولتر من HBSS. يتم إعادة إنفاق عينات كبيرة وكبيرة جدا في 1460 ميكرولتر من HBSS.
  8. اتخاذ aliquot تعليق الخلية لعدد الخلايا الحية / الميتة باستخدام تريبان الأزرق.
    ملاحظة: لعينة صغيرة، استخدم 5 ميكرولتر. لعينة متوسطة أو كبيرة أو كبيرة جدا، استخدم 10 ميكرولتر. تمييع 1:10 مع HBSS.
    1. مزيج 10 ميكرولتر من تخفيف البلغم مع 30 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان الأزرق لتحقيق تخفيف عينة النهائي من 1:40. تحميل في غرف العد من مقياس الدم لعد الخلايا.
      ملاحظة: قد يكون من الضروري ضبط التخفيف النهائي إذا كانت أرقام الخلايا منخفضة جدا أو عالية جدا لتحقيق عدد دقيق. ينصح بشدة هنا باستشارات Guiot et al.20 للتمييز بشكل صحيح بين خلايا البلغم والحطام. وهذا أمر ضروري لعدد الخلايا دقيقة.
  9. من عينة كبيرة جدا، وإزالة 50 × 106 خلايا من المجموع وإضافة إلى أنبوب جديد مع ما يكفي من HBSS المضافة لخلق حجم إجمالي قدره 1700 ميكرولتر.
    ملاحظة: خذ بعين الاعتبار هذا نموذج كبير لبقية البروتوكول. يمكن التخلص من العينات المتبقية أو استخدامها لأغراض أخرى.

3. الأجسام المضادة وصبغة حيوية تلطيخ

  1. اختيار الأجسام المضادة وصبغ تلطيخ
    ملاحظة: يعرض الجدول 1 الأجسام المضادة وصبغة البقاء المستخدمة في هذا البروتوكول وخلايا الخلايا التي تحددها.
    1. تسمية الأنابيب التي تحتوي على خلايا البلغم (انظر الجدول 2 للتسميات).
    2. استخدام أنابيب قياس الخلايا تدفق 5 مل (متوافقة مع تدفق السيتومتر المستخدمة) للأنبوب عينة مع الخلايا غير الملطخة وأنبوب مع التحكم isotype. استخدام أنابيب مخروطية 15 مل لعينات الدم والأنابيب الظهارية.
      ملاحظة: سيتم نقل هذه العينات لتدفق أنابيب قياس الخلايا بعد تلطيخ الأجسام المضادة والتثبيت.
  2. تسمية أنابيب التعويض (الجدول 3).
    ملاحظة: استخدم أنابيب قياس الخلايا التدفق 5 مل متوافقة مع تدفق الخلايا المستخدمة.
  3. إضافة كمية HBSS والأجسام المضادة و / أو صبغ إلى كل من أنابيب الخلية البلغم وأنابيب التعويض على النحو المبين في الجدول 2 والجدول 3، على التوالي.
    ملاحظة: أضف العازلة (HBBS) والأجسام المضادة، وصبغ لجميع الأنابيب قبل إضافة خلايا أو حبات التعويض لضمان أن جميع أنابيب 'تلطيخ الوقت متسقة.
  4. إضافة كميات حجم الخلية البلغم المسرودة في الجدول 2 إلى أنابيب المقايسة.
  5. إضافة حبات التعويض إلى أنابيب التعويض كما هو مذكور في الجدول 3.
  6. احتضان جميع الأنابيب (أنابيب الفحص والتعويض) على الجليد، محمية من الضوء، لمدة 35 دقيقة. ثم، ملء الأنابيب مع HBSS الباردة الجليد والطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 800 × ز.
  7. لأنابيب التعويض، يستنشق supernatant أقرب إلى الكريات ممكن ونفض الغبار الكريات لتخفيف.
  8. أضف 0.5 مل من HBSS الباردة إلى أنابيب التعويض، وخزنها على الجليد عند 4 درجات مئوية وحمايتها من الضوء حتى الحاجة لتحليل قياس التدفق الخلوي.
  9. يستنشق الناطق الفائق من الأنابيب غير الملطخة ، والدم ، والأنابيب الظهارية بعد الطرد المركزي (الخطوة 3.6 من قسم تلطيخ الأجسام المضادة) وتخفيف الكريات عن طريق النقر على الأنابيب.

4. التثبيت مع 1٪ بارافورمالديهايد (PFA)

  1. إضافة الباردة 1٪ PFA (التي ينبغي إذابة الآن) إلى غير ملطخة، isotype، الدم، والأنابيب الظهارية. 2 مل إلى أنابيب غير ملطخة وisotype، و 10 مل إلى الدم والأنابيب الظهارية.
  2. احتضان الأنابيب على الجليد، محمية من الضوء لمدة ساعة واحدة. دوامة بسرعة بأقصى سرعة بعد 30 دقيقة.
  3. ملء الأنابيب مع HBSS الجليد الباردة. ثم أنابيب الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في 1600 س غ.
  4. يستنشق أكبر قدر ممكن من supernatant دون إزعاج بيليه الخلية ونفض الغبار أنبوب مع الأصابع لتخفيف الخلايا.
  5. إضافة 200 ميكرولتر من HBSS الباردة إلى أنابيب غير ملطخة وisotype.
  6. حساب حجم HBSS لإعادة إنفاق الدم وأنبوب الظهارية وفقا لإجمالي عدد الخلايا.
    ملاحظة: حجم إعادة الإنفاق = 0.15 x [إجمالي عدد الخلايا (الخطوة 8 من فصخ البلغم) / 106]. استخدم 50 × 106 كعدد الخلايا لعينة كبيرة جدا.
  7. تخزين جميع أنابيب العينة والتعويض، محمية من الضوء على الجليد في 4 درجة مئوية حتى يتم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: لم يتم اختبار هذا البروتوكول للتخزين لأكثر من 24 ساعة.

5. الحصول على البيانات على مقياس التدفق الخلوي

  1. تطبيق إجراءات بدء التشغيل المناسبة لقياس التدفق الخلوي المستخدم.
    ملاحظة: يفترض هذا القسم من البروتوكول أن الشخص الذي يشغل مقياس التدفق الخلوي مدرب على استخدام الأداة المتاحة له، ولا سيما فيما يتعلق بالإجراءات اليومية بما في ذلك التحقق من استقرار البصريات وأنظمة السوائل، وتقنيات توحيد تشتت الضوء وكثافة الفلورسينس، فضلا عن حساب وتطبيق مصفوفة التعويض الصحيحة.
  2. استخدام مزيج من المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا (NIST) الخرز لضمان أن يتم تعيين مبعثر إلى الأمام والجهدية مبعثر الجانب لوضع الخرز NIST لتمتد قطعة الأرض بأكملها دون وضع الخرز قريبة جدا من المحاور.
    ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة لضمان إزالة الحطام الذي تقل كميةه عن 5 ميكرومترات عن طريق تحليل ما بعد الاقتناء. اعتمادا على مقياس التدفق الخلوي المستخدم، يجب أن تضع في اعتبارك أن أصغر الخرز لا يتم استبعادها مع العتبة (عند استخدام LSR II أو Lyric) أو مع التمييز العالي (باستخدام مقياس تدفق Navios EX). لS NAVIOS EX، تم استخدام مكسب من 2 للتشتت إلى الأمام والجانب، والجهد من 236 للتشتت إلى الأمام، و 250 للتشتت الجانب. بالنسبة إلى LSR II ، تم استخدام جهد مبعثر أمامي من 165 وجهد جانبي مبعثر من 190.
  3. تعيين معدل التدفق إلى متوسط (LSR II) أو مرتفع (Navios EX).
    ملاحظة: يمكن استخدام معدل التدفق المتوسط أو المرتفع لمعظم الأدوات للحصول على أنابيب البلغم. من المهم ملاحظة أن استخدام بطيء جدا لمعدل التدفق أو تخفيف العينة قد يؤدي إلى استقرار الخلايا ، مما يؤدي إلى زيادة الدوامة التي ليست مرغوبة. ولذلك، فإن الالتزام بحجم إعادة الإنفاق المحسوب في الخطوة 4.6 يجب أن يؤدي إلى كثافة خلوية يمكن الحصول عليها بسرعة ولكن ليس تسد الجهاز.
  4. ضبط الفولتية لكل معلمة تستخدم لمعلمات مبعثر والفلورسنت لوضع السكان الخلية على مقياس. استخدام الأرقام مع استراتيجية gating وارشادات حول كيفية ضبط الفولتية وفقا لذلك.
    ملاحظة: تأكد من تحديد كافة المعلمات المطلوبة في إطار تحديد المعلمة قبل اكتساب أو أن البيانات لن يتم الحصول عليها.
  5. الحصول على بيانات لعينة البلغم غير الملطخة أولا، تليها عينة isotype الملطخة، ومن ثم أنبوب الدم وأنبوب الظهارية.
    ملاحظة: إذا كان تعليق الخلية مركزا جدا بحيث لا يسمح لقياس التدفق الخلوي بتشغيل العينات دون انسداد، فقد يتم تخفيف العينات بشكل أكبر باستخدام HBSS.

النتائج

تم تطوير هذا البروتوكول مع وضع مختبر سريري في الاعتبار. وكان التركيز أثناء وضع البروتوكول على البساطة والكفاءة والقابلية للاستنساخ. ووجد أن الخطوة الأكثر استهلاكا للوقت في معالجة البلغم كانت عد الخلايا. لذلك، يتم إعداد البروتوكول بطريقة يمكن بها معالجة البلغم ووضع العلامات على الخلايا ب...

Discussion

يتضمن المحتوى الخلوي للسبيتوم مجموعة كبيرة ومتنوعة من الخلايا واسعة النطاق ، غالبا ما يرافقها الكثير من الحطام37. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب تحليل البلغم مراقبة الجودة التي تؤكد أن العينة يتم جمعها من الرئة بدلا من تجويف الفم38. لذلك ، فإنه ليس من السهل تحليل البلغم ?...

Disclosures

جميع المؤلفين هم من الموظفين السابقين أو الحاليين من تقنيات bioAffinity.

Acknowledgements

ونود أن نشكر ديفيد رودريغيز على مساعدته في إعداد الرقم. تم تشغيل عينات البلغم على BD LSR II في مرفق الموارد المشتركة لقياس الخلايا في UT Health San Antonio Flow ، بدعم من UT Health و NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) وUL1 TR001120 (منحة CTSA).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Paraformaldehyde Flow-FixPolysciences25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360Fisher Scientific08-771-19
3 M NaOHEMDSX0593-1
50 mL conical falcon tubeFisher Scientific14-432-22
Alexa488 anti-human CD19BioLegend302219
Alexa488 anti-human CD3BioLegend300415
Alexa488 anti-human cytokeratinBioLegend628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 IsotypeBioLegend400129
BV510 anti-human CD45BioLegend304036
CD66b FITC isotypeBD Biosciences555748
CompBead Plus Compensation BeadsBD Biosciences560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mLFisher Scientific09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mLFisher Scientific09-761-10
CS&T beadsBD Biosciences655051
DTTFisher ScientificBP172-5
FITC anti-human CD66bGeneTexGTX75907
Fixable Viability StainBD Biosciences564406
FlowCheckBeckman CoulterA69183
FlowSetBeckman CoulterA69184
HBSSFisher Scientific14-175-095
NACSigma-AldrichA9165
NIST Beads, 05 μMPolysciences64080
NIST Beads, 20 μMPolysciences64160
NIST Beads, 30 μMPolysciences64170
PE anti-human CD45BioLegend304039
PE-CF594 anti-human EpCAMBD Biosciences565399
PE-CF594 CD206/EpCAM IsotypeBD Biosciences562292
PE-CR594 anti-human CD206BD Biosciences564063
Sodium citrate dihydrateEMDSX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%Fisher Scientific15250061

References

  1. Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (7), 705-713 (2010).
  2. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews. Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).
  3. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
  4. Robinson, J. P., Roederer, M. History of science. Flow cytometry strikes gold. Science. 350 (6262), 739-740 (2015).
  5. Orfao, A., et al. Immunophenotypic dissection of normal hematopoiesis. Journal of Immunological Methods. 475, 112684 (2019).
  6. Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
  7. Bento, L. C., et al. The use of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: A review. Frontiers in Oncology. 7, 270 (2017).
  8. Della Porta, M. G., Picone, C. Diagnostic utility of flow cytometry in myelodysplastic syndromes. Mediterranean Journal of Hematology and Infectious Diseases. 9 (1), 2017017 (2017).
  9. Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2), 475-478 (2000).
  10. Spanevello, A., et al. Induced sputum cellularity. Reference values and distribution in normal volunteers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 162 (3), 1172-1174 (2000).
  11. Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
  12. Hastie, A. T., et al. Mixed sputum granulocyte longitudinal impact on lung function in the severe asthma research program. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (7), 882-892 (2021).
  13. Hastie, A. T., et al. Association of sputum and blood eosinophil concentrations with clinical measures of COPD severity: an analysis of the SPIROMICS cohort. The Lancet. Respiratory Medicine. 5 (12), 956-967 (2017).
  14. Kim, J., et al. Innate immune crosstalk in asthmatic airways: Innate lymphoid cells coordinate polarization of lung macrophages. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (5), 1769-1782 (2019).
  15. Bai, Y., Zhou, Q., Fang, Q., Song, L., Chen, K. Inflammatory cytokines and T-Lymphocyte subsets in serum and sputum in patients with bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 25, 2206-2210 (2019).
  16. Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-Carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
  17. Hristara-Papadopoulou, A., Tsanakas, J., Diomou, G., Papadopoulou, O. Current devices of respiratory physiotherapy. Hippokratia. 12 (4), 211-220 (2008).
  18. Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and biochemical analysis of induced sputum from asthmatic and from healthy subjects. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
  19. Alexis, N., Soukup, J., Ghio, A., Becker, S. Sputum phagocytes from healthy individuals are functional and activated: a flow cytometric comparison with cells in bronchoalveolar lavage and peripheral blood. Clinical Immunology. 97 (1), 21-32 (2000).
  20. Guiot, J., et al. Methodology for sputum induction and laboratory processing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56612 (2017).
  21. Paggiaro, P. L., et al. Sputum induction. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 3-8 (2002).
  22. Anjuman, N., Li, N., Guarnera, M., Stass, S. A., Jiang, F. Evaluation of lung flute in sputum samples for molecular analysis of lung cancer. Clinical and Translational Medicine. 2, 15 (2013).
  23. Sethi, S., Yin, J., Anderson, P. K. Lung flute improves symptoms and health status in COPD with chronic bronchitis: A 26 week randomized controlled trial. Clinical and Translational Medicine. 3, 29 (2014).
  24. Su, J., et al. Analysis of lung flute-collected sputum for lung cancer diagnosis. Biomarker Insights. 10, 55-61 (2015).
  25. Naraparaju, S., Vaishali, K., Venkatesan, P., Acharya, V. A comparison of the Acapella and a threshold inspiratory muscle trainer for sputum clearance in bronchiectasis-A pilot study. Physiotherapy Theory and Practice. 26 (6), 353-357 (2010).
  26. Hinson, K. F., Kuper, S. W. The diagnosis of lung cancer by examination of sputum. Thorax. 18, 350-353 (1963).
  27. Johnston, W. W., Bossen, E. H. Ten years of respiratory cytopathology at Duke University Medical Center. I. The cytopathologic diagnosis of lung cancer during the years 1970 to 1974, noting the significance of specimen number and type. Acta Cytologica. 25 (2), 103-107 (1981).
  28. Ng, A. B., Horak, G. C. Factors significant in the diagnostic accuracy of lung cytology in bronchial washing and sputum samples. II. Sputum samples. Acta Cytologica. 27 (4), 397-402 (1983).
  29. . Smiths Medical Videos Available from: https://videos.smiths-medical.com/search?q=acapella&page=1 (2021)
  30. Pizzichini, E., et al. Indices of airway inflammation in induced sputum: reproducibility and validity of cell and fluid-phase measurements. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154 (2), 308-317 (1996).
  31. Miller, H. R., Phipps, P. H., Rossier, E. Reduction of nonspecific fluorescence in respiratory specimens by pretreatment with N-acetylcysteine. Journal of Clinical Microbiology. 24 (3), 470-471 (1986).
  32. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  33. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  34. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
  35. Stewart, C. C., Stewart, S. J. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
  36. Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
  37. Kini, S. R. . Color Atlas of Pulmonary Cytopathology. , (2002).
  38. Papanicolaou Society of Cytopathology Task Force on Standards of Practice. Guidelines of the Papanicolaou Society of Cytopathology for the examination of cytologic specimens obtained from the respiratory tract. Diagnostic Cytopathology. 21 (1), 61-69 (1999).
  39. Holmes, K. L., et al. International Society for the Advancement of Cytometry cell sorter biosafety standards. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 85 (5), 434-453 (2014).
  40. Datta, S., Shah, L., Gilman, R. H., Evans, C. A. Comparison of sputum collection methods for tuberculosis diagnosis: a systematic review and pairwise and network meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (8), 760-771 (2017).
  41. Armstrong-Hough, M., et al. "Something so hard": a mixed-methods study of home sputum collection for tuberculosis contact investigation in Uganda. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease: The Official Journal of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. 22 (10), 1152-1159 (2018).
  42. Freeman, C. M., et al. Design of a multi-center immunophenotyping analysis of peripheral blood, sputum and bronchoalveolar lavage fluid in the Subpopulations and Intermediate Outcome Measures in COPD Study (SPIROMICS). Journal of Translational Medicine. 13, 19 (2015).
  43. Petsky, H. L., Li, A., Chang, A. B. Tailored interventions based on sputum eosinophils versus clinical symptoms for asthma in children and adults. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 8, 005603 (2017).
  44. Hisert, K. B., Liles, W. C., Manicone, A. M. A flow cytometric method for isolating cystic fibrosis airway macrophages from expectorated sputum. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (1), 42-50 (2019).
  45. Duncan, G. A., et al. Microstructural alterations of sputum in cystic fibrosis lung disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (18), 88198 (2016).
  46. Kemp, R. A., Reinders, D. M., Turic, B. Detection of lung cancer by automated sputum cytometry. Journal of Thoracic Oncology: Official Publication of the International Association for the Study of Lung Cancer. 2 (11), 993-1000 (2007).
  47. Blandin Knight, S., et al. Progress and prospects of early detection in lung cancer. Open Biology. 7 (9), (2017).
  48. Gomperts, B. N., Spira, A., Elashoff, D. E., Dubinett, S. M. Lung cancer biomarkers: FISHing in the sputum for risk assessment and early detection. Cancer Prevention Research. 3 (4), 420-423 (2010).
  49. Demoruelle, M. K., et al. Antibody responses to citrullinated and noncitrullinated antigens in the sputum of subjects with rheumatoid arthritis and subjects at risk for development of rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (4), 516-527 (2018).
  50. Wang, K., et al. Differences of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 shedding duration in sputum and nasopharyngeal swab specimens among adult inpatients with coronavirus disease 2019. Chest. 158 (5), 1876-1884 (2020).
  51. Chattopadhyay, P. K., Hogerkorp, C. -. M., Roederer, M. A chromatic explosion: the development and future of multiparameter flow cytometry. Immunology. 125 (4), 441-449 (2008).
  52. Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nature Immunology. 15 (2), 128-135 (2014).
  53. Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
  54. Chattopadhyay, P. K., et al. Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry. Nature Medicine. 12 (8), 972-977 (2006).
  55. Duetz, C., Bachas, C., Westers, T. M., Avan de Loosdrecht, A. A. Computational analysis of flow cytometry data in hematological malignancies: future clinical practice. Current Opinion in Oncology. 32 (2), 162-169 (2020).
  56. Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nature Reviews. Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved