Análisis de esputo de calidad controlada por citometría de flujo

Resumen

Este protocolo describe un método eficiente para disociar el esputo en una suspensión de una sola célula y la posterior caracterización de subconjuntos celulares en plataformas citométricas de flujo estándar.

Resumen

El esputo, ampliamente utilizado para estudiar el contenido celular y otras características microambientales para comprender la salud del pulmón, se analiza tradicionalmente utilizando metodologías basadas en citología. Su utilidad es limitada porque la lectura de las diapositivas requiere mucho tiempo y requiere personal altamente especializado. Además, los desechos extensos y la presencia de demasiadas células epiteliales escamosas (SEC), o células de la mejilla, a menudo hacen que una muestra sea inadecuada para el diagnóstico. Por el contrario, la citometría de flujo permite el fenotipado de alto rendimiento de las poblaciones celulares, al tiempo que excluye los desechos y las SEC.

El protocolo presentado aquí describe un método eficiente para disociar el esputo en una suspensión de una sola célula, teñir y fijar poblaciones celulares, y adquirir muestras en una plataforma citométrica de flujo. Aquí se presenta una estrategia de cierre que describe la exclusión de escombros, células muertas (incluidas las SEC) y dobletes celulares. Además, este trabajo también explica cómo analizar células viables de esputo único basadas en un grupo de poblaciones positivas y negativas de diferenciación (CD)45 para caracterizar subconjuntos de linaje hematopoyético y epitelial. También se proporciona una medida de control de calidad mediante la identificación de macrófagos específicos del pulmón como evidencia de que una muestra se deriva del pulmón y no es saliva. Finalmente, se ha demostrado que este método se puede aplicar a diferentes plataformas citométricas proporcionando perfiles de esputo de un mismo paciente analizados en tres citómetros de flujo; Navios EX, LSR II y Lyric. Además, este protocolo se puede modificar para incluir marcadores celulares adicionales de interés. Aquí se presenta un método para analizar una muestra completa de esputo en una plataforma citométrica de flujo que hace que el esputo sea susceptible de desarrollar diagnósticos de alto rendimiento de enfermedad pulmonar.

Introducción

Los avances técnicos en el hardware y el software de los citómetros de flujo han permitido identificar muchas poblaciones celulares distintas simultáneamente1,2,3,4. La utilización del citómetro de flujo en la investigación de células hematopoyéticas, por ejemplo, ha llevado a una comprensión mucho mejor del sistema ^inmune2 y la jerarquía celular del sistema hematopoyético5, así como a la distinción diagnóstica de una multitud de cánceres sanguíneos diferentes6,7,8.^....

Protocolo

Todos los pasos del procesamiento del esputo se realizan en un gabinete de seguridad biológica con el equipo de protección personal adecuado.

1. Preparación del reactivo antes de iniciar la disociación del esputo

1. Descongele el 1% de paraformaldehído (PFA), 25 ml por muestra en hielo y manténgalo frío hasta su uso.
   PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico por inhalación y contacto con la piel. Prepare el fijador de acuerdo con las instrucciones del fabricante y congele a -20 °C en alícuotas de 25 ml hasta su uso.
2. Aproximar el peso de la muestra y descongelar suficiente 0,1% de Ditiotreitol (TDT) para el paso 2.2 y llevarlo a 37 °C....

Resultados

Este protocolo se desarrolló teniendo en cuenta un entorno de laboratorio clínico. El enfoque durante el desarrollo del protocolo fue en la simplicidad, la eficiencia y la reproducibilidad. Se encontró que el paso más lento en el procesamiento del esputo era contar las células. Por lo tanto, el protocolo está configurado de tal manera que el procesamiento del esputo y el etiquetado celular se pueden realizar independientemente del recuento de células sin pérdida de tiempo. Luego se puede obtener un recuento celul.......

Discusión

El contenido celular del esputo incluye una gran variedad de células de gran alcance, a menudo acompañadas de una gran cantidad de ^escombros37. Además, el análisis del esputo requiere un control de calidad que confirme que la muestra se recoge del pulmón en lugar de de la cavidad ^oral38. Por lo tanto, no es tan sencillo analizar el esputo por citometría de flujo como lo es para la sangre, por ejemplo, que libera una suspensión celular mucho más limpia y homogénea. .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061