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Resumen

Este protocolo describe un método eficiente para disociar el esputo en una suspensión de una sola célula y la posterior caracterización de subconjuntos celulares en plataformas citométricas de flujo estándar.

Resumen

El esputo, ampliamente utilizado para estudiar el contenido celular y otras características microambientales para comprender la salud del pulmón, se analiza tradicionalmente utilizando metodologías basadas en citología. Su utilidad es limitada porque la lectura de las diapositivas requiere mucho tiempo y requiere personal altamente especializado. Además, los desechos extensos y la presencia de demasiadas células epiteliales escamosas (SEC), o células de la mejilla, a menudo hacen que una muestra sea inadecuada para el diagnóstico. Por el contrario, la citometría de flujo permite el fenotipado de alto rendimiento de las poblaciones celulares, al tiempo que excluye los desechos y las SEC.

El protocolo presentado aquí describe un método eficiente para disociar el esputo en una suspensión de una sola célula, teñir y fijar poblaciones celulares, y adquirir muestras en una plataforma citométrica de flujo. Aquí se presenta una estrategia de cierre que describe la exclusión de escombros, células muertas (incluidas las SEC) y dobletes celulares. Además, este trabajo también explica cómo analizar células viables de esputo único basadas en un grupo de poblaciones positivas y negativas de diferenciación (CD)45 para caracterizar subconjuntos de linaje hematopoyético y epitelial. También se proporciona una medida de control de calidad mediante la identificación de macrófagos específicos del pulmón como evidencia de que una muestra se deriva del pulmón y no es saliva. Finalmente, se ha demostrado que este método se puede aplicar a diferentes plataformas citométricas proporcionando perfiles de esputo de un mismo paciente analizados en tres citómetros de flujo; Navios EX, LSR II y Lyric. Además, este protocolo se puede modificar para incluir marcadores celulares adicionales de interés. Aquí se presenta un método para analizar una muestra completa de esputo en una plataforma citométrica de flujo que hace que el esputo sea susceptible de desarrollar diagnósticos de alto rendimiento de enfermedad pulmonar.

Introducción

Los avances técnicos en el hardware y el software de los citómetros de flujo han permitido identificar muchas poblaciones celulares distintas simultáneamente1,2,3,4. La utilización del citómetro de flujo en la investigación de células hematopoyéticas, por ejemplo, ha llevado a una comprensión mucho mejor del sistema inmune2 y la jerarquía celular del sistema hematopoyético5, así como a la distinción diagnóstica de una multitud de cánceres sanguíneos diferentes6,7,8. Aunque la mayoría de las células de esputo son de origen hematopoyético9,10,11, la citometría de flujo no se ha aplicado ampliamente al análisis de esputo con fines diagnósticos. Sin embargo, varios estudios sugieren que la evaluación de las poblaciones de células inmunes en el esputo (el subconjunto más significativo de células) puede ser de gran ayuda en el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades como el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)12,13,14,15. Además, la existencia de marcadores epiteliales específicos que pueden ser utilizados en citometría de flujo permite el interrogatorio del siguiente subconjunto más significativo de células en esputo, células epiteliales pulmonares.

Además de la capacidad de analizar muchas poblaciones celulares distintas de diferentes orígenes tisulares, un citómetro de flujo puede evaluar un gran número de células en un período relativamente corto. En comparación, los tipos de análisis citológicos basados en diapositivas a menudo requieren personal y / o equipo altamente especializado. Estos análisis pueden ser intensivos en mano de obra, lo que lleva a que solo se analice una proporción de la muestra de esputo16.

Tres cuestiones críticas limitan el uso generalizado del esputo en la citometría de flujo. La primera cuestión se refiere a la recogida de esputo. El esputo se recoge a través de una tos que expulsa el moco de los pulmones a la cavidad oral, escupiendo posteriormente en una taza de recolección. Dado que el moco viaja a través de la cavidad oral, existe una alta probabilidad de contaminación por SEC. Esta contaminación complica el análisis de la muestra, pero el problema se rectifica fácilmente en una plataforma citométrica de flujo, como se muestra en este estudio.

No todo el mundo puede producir esputo espontáneamente; por lo tanto, se han desarrollado varios dispositivos para ayudar con la recolección de esputo de manera no invasiva17. El nebulizador es uno de esos dispositivos y se ha demostrado que produce muestras de esputo confiables18,19,20. Aunque el nebulizador es una forma muy efectiva de recolectar esputo de manera no invasiva, su uso aún requiere un ajuste en un centro médico con personal especializado21. Por el contrario, los dispositivos portátiles como la flauta pulmonar22,23,24 y la acapella16,25 se pueden utilizar en casa ya que son muy fáciles de usar. Estos dispositivos de asistencia son seguros y rentables.

Para nosotros, la acapella dio consistentemente mejores resultados que la flauta pulmonar16, y por lo tanto, el dispositivo de acapella ha sido elegido para las colecciones de esputo. Se decidió una muestra de recolección de 3 días porque el propósito principal del uso de esputo es desarrollar una prueba de detección de cáncer de pulmón16. Se ha demostrado que una muestra de 3 días aumenta la probabilidad de detección de cáncer de pulmón en comparación con una muestra de 1 o 2 días26,27,28. Sin embargo, otros métodos de recolección de esputo pueden ser preferibles para diferentes propósitos. Si se utiliza un método de recolección de esputo diferente al descrito aquí, se recomienda valorar cuidadosamente cada anticuerpo o colorante utilizado para el análisis citométrico de flujo; hay muy pocos datos disponibles sobre cómo los diferentes métodos de recolección de esputo afectan a las proteínas objetivo para la citometría de flujo.

El segundo problema que amortigua el entusiasmo por el uso de esputo para el diagnóstico, principalmente relacionado con la citometría de flujo, es el número de células. El problema es la recolección de suficientes células viables para un análisis confiable. Dos estudios demostraron que las muestras de esputo recolectadas por métodos no invasivos, con la ayuda de un dispositivo de asistencia, contienen suficientes células viables que pueden ser utilizadas en diagnósticos clínicos o estudios de investigación16,24. Sin embargo, ninguno de estos estudios abordó la cuestión del número de células con respecto a la citometría de flujo.

Para los estudios que forman la base de este protocolo, se recolectaron muestras de esputo de participantes con alto riesgo de desarrollar cáncer de pulmón siguiendo las pautas institucionales aprobadas para cada sitio de estudio. Los participantes de alto riesgo se definieron como entre 55 y 75 años, haber fumado 30 paquetes-año y no haber dejado de fumar en los últimos 15 años. A los pacientes se les mostró cómo usar el dispositivo de acapella de acuerdo con las instrucciones del fabricante29 y recogieron esputo durante tres días consecutivos en casa. La muestra se mantuvo en el refrigerador hasta la última recolección. El último día de recolección, la muestra se envió al laboratorio durante la noche con una compresa fría congelada. Las muestras se procesaron en una suspensión de una sola célula el día en que se recibieron. Con este método de recolección de esputo, se obtienen células viables más que suficientes para un análisis citométrico de flujo confiable.

Por último, y relacionado con el problema anterior del número de células, está la cuestión de cómo liberar las células de esputo de su entorno mucinoso. ¿Cómo se pueden mantener las células viables y crear una suspensión de una sola célula que no obstruya el citómetro de flujo? Basado en el trabajo inicial de Pizzichini et al.30 y Miller et al.31, este protocolo describe un método fácil y confiable para el procesamiento del esputo en una suspensión de una sola célula que es adecuada para el análisis citométrico de flujo. Este método ha utilizado pautas bien establecidas en citometría de flujo32,33,34 para desarrollar una estrategia eficiente de etiquetado de anticuerpos para identificar células hematopoyéticas y epiteliales en el esputo y proporcionar configuraciones de instrumentos, medidas de control de calidad y pautas de análisis que estandarizan el análisis de esputo en una plataforma citométrica de flujo.

Protocolo

Todos los pasos del procesamiento del esputo se realizan en un gabinete de seguridad biológica con el equipo de protección personal adecuado.

1. Preparación del reactivo antes de iniciar la disociación del esputo

  1. Descongele el 1% de paraformaldehído (PFA), 25 ml por muestra en hielo y manténgalo frío hasta su uso.
    PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico por inhalación y contacto con la piel. Prepare el fijador de acuerdo con las instrucciones del fabricante y congele a -20 °C en alícuotas de 25 ml hasta su uso.
  2. Aproximar el peso de la muestra y descongelar suficiente 0,1% de Ditiotreitol (TDT) para el paso 2.2 y llevarlo a 37 °C. (Las alícuotas de TDT deben almacenarse a -20 °C antes de su uso).
  3. Lleve suficiente 0.5% N-acetil-L-cisteína (NAC) hasta 37 °C para el paso 2.2. (El NAC debe hacerse fresco semanalmente y almacenarse a 4 °C antes de su uso).)

2. Disociación del esputo

  1. Pesar la muestra de esputo para determinar los volúmenes de reactivos de disociación.
    NOTA: Una muestra se considera pequeña si el peso inicial es de ≤3 g, mediana si >3 g pero ≤8 g, grande si >8 pero ≤16 g, y extra grande si una muestra pesa >16 g. Las indicaciones pequeñas, medianas, grandes y extragrandes se utilizarán en todo el protocolo. La cantidad de reactivos necesarios para la disociación y el etiquetado difiere según el tamaño de la muestra de esputo.
  2. Transfiera una muestra pequeña a un tubo cónico limpio de 50 ml, una muestra mediana a una botella desechable de plástico limpia de 250 ml, o una muestra grande y extra grande a una botella desechable de plástico limpia de 500 ml. Añadir 1 ml/g de peso muestral de 0,5% de NAC y 4 ml/g de peso muestral de 0,1% de TDT.
  3. Vórtice a velocidad máxima (durante 15 s), y luego roca a temperatura ambiente (a velocidad máxima) durante 15 min.
  4. Diluir la muestra con cuatro volúmenes de Solución Salina Equilibrada de Hank (HBSS) (basado en el volumen total de la muestra + reactivos) para neutralizar el NAC y la TDT; vórtice rápidamente a la velocidad máxima y roca a temperatura ambiente durante 5 minutos a la velocidad máxima.
  5. Filtre la suspensión celular a través de coladores celulares de malla de nylon de 100 μm en uno o más tubos de centrífuga cónica de 50 ml para crear una suspensión de una sola celda.
  6. Centrifugar las células a 800 x g durante 10 min a 4 °C. Aspire el sobrenadante, combine todos los gránulos en un tubo cónico de 15 ml y luego lave los gránulos con HBSS utilizando las mismas condiciones.
  7. Resuspend el pellet celular en un volumen de tampón determinado por el peso inicial de la muestra de esputo.
    NOTA: Una pequeña muestra se resuspende en 250 μL de HBSS. Una muestra mediana se resuspende en 760 μL de HBSS. Las muestras grandes y extragrandes se resuspenden en 1460 μL de HBSS.
  8. Tome una alícuota de la suspensión celular para un recuento de células vivas / muertas usando Trypan Blue.
    NOTA: Para una muestra pequeña, utilice 5 μL. Para una muestra mediana, grande o extragrande, use 10 μL. Diluya 1:10 con HBSS.
    1. Mezclar 10 μL de la dilución de esputo con 30 μL de Trypan Blue al 0,4% para lograr una dilución final de la muestra de 1:40. Cargue en las cámaras de conteo de un hemocitómetro para un recuento de células.
      NOTA: Puede ser necesario ajustar la dilución final si los números de células son demasiado bajos o demasiado altos para lograr un recuento preciso. Consulte a Guiot et al.20 para distinguir correctamente las células de esputo de las SEC y los desechos se recomienda encarecidamente aquí. Esto es esencial para un recuento preciso de células.
  9. De la muestra extra grande, retire 50 x 106 células del total y agréguelas a un nuevo tubo con suficiente HBSS añadido para crear un volumen total de 1700 μL.
    NOTA: Considere que se trata de un ejemplo grande para el resto del protocolo. Las muestras sobrantes pueden desecharse o utilizarse para otros fines.

3. Tinción de colorantes de anticuerpos y viabilidad

  1. Elección de anticuerpos y colorantes de tinción
    NOTA: La Tabla 1 muestra los anticuerpos y el colorante de viabilidad que se utilizan en este protocolo y las poblaciones celulares que identifican.
    1. Etiquete los tubos que contienen las celdas de esputo (consulte la Tabla 2 para las etiquetas).
    2. Utilice tubos de citometría de flujo de 5 ml (compatibles con el citómetro de flujo utilizado) para el tubo de muestra con las células no teñidas y el tubo con el control de isotipo. Use tubos cónicos de 15 ml para las muestras de sangre y tubos epiteliales.
      NOTA: Estas muestras se transferirán a tubos de citometría de flujo después de la tinción y fijación de anticuerpos.
  2. Etiquete los tubos de compensación (Tabla 3).
    NOTA: Utilice tubos de citometría de flujo de 5 ml compatibles con el citómetro de flujo que se está utilizando.
  3. Agregue la cantidad de HBSS, anticuerpo y/o colorante a cada uno de los tubos de células de esputo y tubos de compensación como se indica en la Tabla 2 y la Tabla 3, respectivamente.
    NOTA: Agregue tampón (HBBS), anticuerpos y colorante a todos los tubos antes de agregar células o perlas de compensación para garantizar que el tiempo de tinción de todos los tubos sea consistente.
  4. Agregue las cantidades de volumen de células de esputo enumeradas en la Tabla 2 a los tubos de ensayo.
  5. Agregue cuentas de compensación a los tubos de compensación como se enumera en la Tabla 3.
  6. Incubar todos los tubos (tubos de ensayo y compensación) sobre hielo, protegidos de la luz, durante 35 min. Luego, llene los tubos con HBSS helado y centrífuga a 4 °C durante 10 min a 800 x g.
  7. Para los tubos de compensación, aspire el sobrenadante lo más cerca posible de los gránulos y mueva los gránulos para aflojarlos.
  8. Agregue 0,5 ml de HBSS frío a los tubos de compensación, guárdelos en el hielo a 4 °C y protéjalos de la luz hasta que sea necesario para el análisis de citometría de flujo.
  9. Aspire el sobrenadante del isotipo, la sangre y los tubos epiteliales no manchados después de la centrifugación (paso 3.6 de la sección de tinción de anticuerpos) y afloje los gránulos moviendo los tubos.

4. Fijación con paraformaldehído al 1% (PFA)

  1. Agregue PFA frío al 1% (que ya debería descongelarse) a los tubos no manchados, isotipo, sangre y epiteliales; 2 mL a los tubos no teñidos e isotipos, y 10 mL a los tubos sanguíneos y epiteliales.
  2. Incubar los tubos sobre hielo, protegidos de la luz durante 1 h. Vórtice rápidamente a máxima velocidad después de 30 min.
  3. Llene los tubos con HBSS helado. Luego, tubos de centrífuga a 4 °C durante 10 min a 1600 x g.
  4. Aspire la mayor cantidad posible de sobrenadante sin perturbar la bolita celular y mueva el tubo con los dedos para aflojar las células.
  5. Añadir 200 μL de HBSS frío a los tubos no teñidos e isotipos.
  6. Calcule el volumen de HBSS para la resuspensión de la sangre y el tubo epitelial de acuerdo con el recuento total de células.
    NOTA: Volumen de resuspensión = 0,15 x [recuento total de células (paso 8 de disociación del esputo) / 106]. Utilice 50 x 106 como recuento de celdas para una muestra extra grande.
  7. Almacene todas las muestras y tubos de compensación, protegidos de la luz en el hielo a 4 °C hasta que se realice el análisis de citometría de flujo.
    NOTA: Este protocolo no se ha probado para su almacenamiento durante más de 24 h.

5. Adquisición de datos en el citómetro de flujo

  1. Aplique los procedimientos de arranque apropiados para el citómetro de flujo que se está utilizando.
    NOTA: Esta sección del protocolo asume que la persona que opera el citómetro de flujo está capacitada en el uso del instrumento disponible para ellos, especialmente en lo que respecta a los procedimientos diarios, incluida la verificación de la estabilidad de los sistemas ópticos y fluídicos, las técnicas para estandarizar la dispersión de la luz y la intensidad de fluorescencia, así como el cálculo y la aplicación de la matriz de compensación correcta.
  2. Utilice la mezcla de cuentas del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) para asegurarse de que los voltajes de dispersión hacia adelante y de dispersión lateral estén configurados para colocar las cuentas NIST para abarcar toda la parcela sin colocar las cuentas demasiado cerca de los ejes.
    NOTA: Este paso es crucial para garantizar que los desechos menores de 5 μm puedan eliminarse mediante el análisis posterior a la adquisición. Dependiendo del citómetro de flujo utilizado, tenga en cuenta que las cuentas más pequeñas no se excluyen con el umbral (cuando se usa el LSR II o el Lyric) o con el discriminador alto (usando el citómetro de flujo Navios EX). Para el Navios EX, se utilizó una ganancia de 2 para la dispersión delantera y lateral, un voltaje de 236 para la dispersión hacia adelante y 250 para la dispersión lateral. Para el LSR II, se utilizó un voltaje de dispersión directa de 165 y un voltaje de dispersión lateral de 190.
  3. Establezca el caudal en medio (LSR II) o alto (Navios EX).
    NOTA: El caudal medio o alto para la mayoría de los instrumentos se puede utilizar para adquirir los tubos de esputo. Es importante tener en cuenta que el uso de un caudal demasiado lento o demasiado diluido de la muestra puede provocar que las células se asienten, lo que resulta en un aumento del vórtice que no se desea. Por lo tanto, adherirse al volumen de resuspensión calculado en el paso 4.6 debería dar como resultado una densidad celular que se puede adquirir rápidamente pero no obstruir la máquina.
  4. Ajuste los voltajes para cada parámetro utilizado para los parámetros de dispersión y fluorescentes para colocar las poblaciones celulares en la escala. Utilice las figuras con la estrategia de cierre como guía sobre cómo ajustar los voltajes en consecuencia.
    NOTA: Asegúrese de que todos los parámetros necesarios se seleccionan en la ventana de selección de parámetros antes de la adquisición o que no se adquirirán los datos.
  5. Adquiera datos para la muestra de esputo no teñida primero, seguida de la muestra teñida con isotipo, y luego el tubo sanguíneo y el tubo epitelial.
    NOTA: Si la suspensión celular está demasiado concentrada para permitir que el citómetro de flujo haga funcionar las muestras sin obstruirse, las muestras pueden diluirse aún más con HBSS.

Resultados

Este protocolo se desarrolló teniendo en cuenta un entorno de laboratorio clínico. El enfoque durante el desarrollo del protocolo fue en la simplicidad, la eficiencia y la reproducibilidad. Se encontró que el paso más lento en el procesamiento del esputo era contar las células. Por lo tanto, el protocolo está configurado de tal manera que el procesamiento del esputo y el etiquetado celular se pueden realizar independientemente del recuento de células sin pérdida de tiempo. Luego se puede obtener un recuento celul...

Discusión

El contenido celular del esputo incluye una gran variedad de células de gran alcance, a menudo acompañadas de una gran cantidad de escombros37. Además, el análisis del esputo requiere un control de calidad que confirme que la muestra se recoge del pulmón en lugar de de la cavidad oral38. Por lo tanto, no es tan sencillo analizar el esputo por citometría de flujo como lo es para la sangre, por ejemplo, que libera una suspensión celular mucho más limpia y homogénea. ...

Divulgaciones

Todos los autores son empleados pasados o actuales de bioAffinity Technologies.

Agradecimientos

Queremos agradecer a David Rodríguez por su ayuda con la preparación de la figura. Las muestras de esputo se ejecutaron en el BD LSR II en el UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, con el apoyo de UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC en UT Health) y UL1 TR001120 (subvención de CTSA).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Paraformaldehyde Flow-FixPolysciences25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360Fisher Scientific08-771-19
3 M NaOHEMDSX0593-1
50 mL conical falcon tubeFisher Scientific14-432-22
Alexa488 anti-human CD19BioLegend302219
Alexa488 anti-human CD3BioLegend300415
Alexa488 anti-human cytokeratinBioLegend628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 IsotypeBioLegend400129
BV510 anti-human CD45BioLegend304036
CD66b FITC isotypeBD Biosciences555748
CompBead Plus Compensation BeadsBD Biosciences560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mLFisher Scientific09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mLFisher Scientific09-761-10
CS&T beadsBD Biosciences655051
DTTFisher ScientificBP172-5
FITC anti-human CD66bGeneTexGTX75907
Fixable Viability StainBD Biosciences564406
FlowCheckBeckman CoulterA69183
FlowSetBeckman CoulterA69184
HBSSFisher Scientific14-175-095
NACSigma-AldrichA9165
NIST Beads, 05 μMPolysciences64080
NIST Beads, 20 μMPolysciences64160
NIST Beads, 30 μMPolysciences64170
PE anti-human CD45BioLegend304039
PE-CF594 anti-human EpCAMBD Biosciences565399
PE-CF594 CD206/EpCAM IsotypeBD Biosciences562292
PE-CR594 anti-human CD206BD Biosciences564063
Sodium citrate dihydrateEMDSX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%Fisher Scientific15250061

Referencias

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