通过流式细胞术进行质量控制痰液分析

摘要

该协议描述了一种将痰液解离为单细胞悬浮液的有效方法，以及随后在标准流式细胞术平台上对细胞亚群的表征。

摘要

痰液广泛用于研究细胞含量和其他微环境特征，以了解肺部的健康，传统上使用基于细胞学的方法进行分析。它的效用有限，因为阅读幻灯片非常耗时，需要高度专业化的人员。此外，广泛的碎片和过多的鳞状上皮细胞（SEC）或脸颊细胞的存在往往使样本不足以诊断。相比之式细胞术允许对细胞群进行高通量表型分析，同时排除碎片和 SEC 。

这里介绍的方案描述了一种将痰液解离成单细胞悬浮液，抗体染色和固定细胞群以及在流式细胞术平台上获取样品的有效方法。这里介绍了一种门控策略，描述了排除碎片，死细胞（包括SEC）和细胞二倍体。此外，这项工作还解释了如何基于分化簇（CD）45阳性和阴性群体分析活的单个痰细胞，以表征造血和上皮谱系亚群。通过识别肺部特异性巨噬细胞作为样本来自肺部而不是唾液的证据，还可以提供质量控制措施。最后，已经证明该方法可以通过提供在三个流式细胞仪上分析的同一患者的痰液图谱应用于不同的细胞术平台;Navios EX，LSR II和Lyric。此外，可以修改该协议以包括感兴趣的其他细胞标记物。这里提出了一种在流式细胞术平台上分析整个痰液样本的方法，该方法使痰液适合于开发肺病的高通量诊断。

引言

流式细胞仪硬件和软件的技术进步使得同时识别许多不同的细胞群成为可能^1，2，^3，4。例如，流式细胞仪在造血细胞研究中的应用使人们对免疫系统²和造血系统的细胞层次结构⁵有了更好的了解，并区分了多种不同血癌的诊断方法^6，7，8。虽然大多数痰细胞起源于造血^9，10，11，但流式细胞术尚未广泛应用于用于诊断目的的痰液分析。然而，一些研究表明，评估痰液（最重要的细胞亚群）中的免疫细胞群可能对诊断和/或监测哮喘和慢性阻塞性肺病（COPD）等疾病有很大帮助^12，13，

研究方案

痰液处理的所有步骤都在带有适当个人防护设备的生物安全柜中进行。

1. 开始痰液解离前的试剂制备

1. 在冰上解冻1%多聚甲醛（PFA），每个样品25 mL，并保持冷藏直至使用。
   注意：PFA通过吸入和皮肤接触而有毒。根据制造商的说明准备固定剂，并在-20°C下冷冻在25 mL等分试样中直至使用。
2. 近似样品的重量并解冻足够的0.1%二硫磷脂醇（DTT）用于步骤2.2，并将其降至37°C。 （DTT等分试样应在使用前储存在-20°C。
3. 携带足够的0.5%N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）至37°C进行步骤2.2。（NAC应每周新鲜一次，并在使用前储存在4°C。

2. 痰液解离

1. 称量痰液样本以确定解离试剂的体积。
   注：如果初始重量为≤3克，则认为样品较小;如果>3克但≤8克，则认为样品为中等;如果>8但≤16克，则样品量大;如果样品重量>16克，则样品量大。小，中，大和超大的适应症将在整个协议中使用。解离和标记所需的试剂量根据痰液样本的大小而不同。
2. 将小样品转移到干净的50 mL锥形管中，将中等样品转移到干净的250 mL塑料一次性瓶中，或将大样品和超大样品转移到干净的500 mL塑料一次性瓶中。加入 1 mL/g 样品重量为 0.5% NAC 和 4 mL/g 样品重量为 0.1% DTT。

结果

该协议是在考虑临床实验室环境的情况下制定的。在协议开发过程中，重点是简单性，效率和可重复性。研究发现，处理痰液中最耗时的步骤是计数细胞。因此，该协议的设置方式使得痰液处理和细胞标记可以独立于细胞计数进行而不会浪费时间。然后，可以在抗体标记孵育期间获得准确的细胞计数，这对于适当稀释样品以进行无障碍运行仍然是必需的。

该协议使用痰液重?.......

讨论

痰液的细胞含量包括种类繁多的宽范围细胞，往往伴有大量碎片³⁷。此外，痰液分析需要质量控制，以确认样本是从肺部而不是口腔收集的³⁸。因此，通过流式细胞术分析痰液并不像血液那样简单，例如，血液释放出更清洁和均匀的细胞悬浮液。该协议已经解决了所有这些问题：提供使用特定尺寸的微球的仪器设置，以确保可以检测到最小和最大的细胞群，门控.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061