Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, balgamını tek bir hücre süspansiyonuna dağıtmak ve standart akış sitometrik platformlarındaki hücresel alt kümelerin daha sonra karakterizasyonu için etkili bir yöntemi açıklar.

Özet

Akciğerin sağlığını anlamak için hücresel içeriği ve diğer mikroçevronmental özellikleri incelemek için yaygın olarak kullanılan balgam, geleneksel olarak sitoloji tabanlı metodolojiler kullanılarak analiz edilir. Slaytları okumak zaman alıcı olduğundan ve son derece uzmanlaşmış personel gerektirdiğinden, yardımcı programı sınırlıdır. Ayrıca, geniş döküntüler ve çok fazla skuamöz epitel hücresinin (SEC) veya yanak hücrelerinin varlığı, genellikle bir örneği tanı için yetersiz hale getirir. Buna karşılık, akış sitometrisi, hücresel popülasyonların yüksek verimli fenotiplemesine izin verirken aynı zamanda döküntüleri ve DC'leri hariç tutmaktadır.

Burada sunulan protokol, balgamını tek bir hücre süspansiyonuna, antikor lekesine ve hücresel popülasyonları düzeltmeye ve akış sitometrik platformunda örnekler almaya yönelik etkili bir yöntemi açıklar. Enkaz, ölü hücreler (SEC'ler dahil) ve hücre çiftlerinin hariç tutulmasını açıklayan bir gating stratejisi burada sunulmaktadır. Ayrıca, bu çalışma, hematopoetik ve epitel soy alt kümelerini karakterize etmek için bir farklılaşma kümesine (CD)45 pozitif ve negatif popülasyona dayanarak uygulanabilir, tek balgam hücrelerinin nasıl analiz edilip edilecektir. Akciğere özgü makrofajların akciğerden örnek elde edildiğinin ve tükürük olmadığının kanıtı olarak tanımlanmasıyla da bir kalite kontrol önlemi sağlanır. Son olarak, bu yöntemin üç akış sitometresinde analiz edilen aynı hastadan balgam profilleri sağlanarak farklı sitometrik platformlara uygulanabileceği gösterilmiştir; Navios EX, LSR II ve Lirik. Ayrıca, bu protokol ek hücresel ilgi işaretlerini içerecek şekilde değiştirilebilir. Bir akış sitometrik platformunda tüm balgam örneğini analiz etmek için bir yöntem burada sunulmaktadır, bu da balgamını akciğer hastalığının yüksek verimli tanısını geliştirmek için uygun hale getirir.

Giriş

Akış sitometrelerinin donanım ve yazılımındaki teknik gelişmeler, birçok farklı hücre popülasyonunun aynı anda tanımlanmasını mümkün kıldı1,2,3,4. Örneğin, hematopoetik hücre araştırmalarında akış sitometresinin kullanılması, bağışıklık sisteminin çok daha iyi anlaşılmasına yol açmıştır2 ve hematopoetik sistemin hücresel hiyerarşisi5, ayrıca çok sayıda farklı kan kanserinin tanısal ayrımı6,7,8. Balgam hücrelerinin çoğu hematopoetik kökenli olmasına rağmen9,10,11, akış sitometrisi tanı amaçlı balgam analizine yaygın olarak uygulanmamıştır. Bununla birlikte, çeşitli çalışmalar balgamdaki bağışıklık hücresi popülasyonlarının değerlendirilmesinin (hücrelerin en önemli alt kümesi) astım ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) gibi hastalıkların teşhis ve / veya izlenmesinde büyük yardımcı olabileceğini göstermektedir 12,13,14,15. Ayrıca, akış sitometrisinde kullanılabilecek epitel spesifik belirteçlerin varlığı, balgam, akciğer epitel hücrelerindeki aşağıdaki en önemli hücre alt kümesinin sorgulanmasını sağlar.

Farklı doku kökenli birçok farklı hücre popülasyonunun analiz yeteneğine ek olarak, bir akış sitometresi çok sayıda hücreyi nispeten kısa bir sürede değerlendirebilir. Buna karşılık, slayt tabanlı, sitolojik analiz türleri genellikle son derece uzmanlaşmış personel ve / veya ekipman gerektirir. Bu analizler emek yoğun olabilir, bu da balgam örneğinin sadece bir kısmının analiz edilmesine neden olur16.

Üç kritik konu, akış sitometrisinde balgam kullanımının yaygın kullanımını sınırlar. İlk sayı balgam koleksiyonu ile ilgilidir. Balgam, mukusu akciğerlerden ağız boşluğuna dışarı atarak daha sonra bir toplama kabına tüküren bir huff öksürüğü ile toplanır. Mukus ağız boşluğundan geçtiği için SEC kontaminasyonu olasılığı yüksektir. Bu kontaminasyon numune analizini zorlaştırır, ancak sorun bu çalışmada gösterildiği gibi bir akış sitometrik platformunda kolayca düzeltilir.

Herkes kendiliğinden balgam üretemez; bu nedenle, balgam koleksiyonuna invaziv olmayan bir şekilde yardımcı olmak için çeşitli cihazlar geliştirilmiştir17. Nebülizör böyle bir cihazdır ve güvenilir balgam örnekleri ürettiği gösterilmiştir18,19,20. Nebülizör, balgamını invaziv olmayan bir şekilde toplamanın çok etkili bir yolu olmasına rağmen, kullanımı hala uzman personele sahip bir tıbbi tesiste bir ayar gerektirir21. Buna karşılık, akciğer flütü22,23,24 ve acapella16,25 gibi el cihazları çok kullanıcı dostu oldukları için evde kullanılabilir. Bu yardımcı cihazlar hem güvenli hem de uygun maliyetlidir.

Bizim için, acapella akciğer flütü16'dan sürekli olarak daha iyi sonuçlar verdi ve bu nedenle, acapella cihazı balgam koleksiyonları için seçildi. Balgam kullanmanın birincil amacı akciğer kanseri tespit testi geliştirmek olduğu için 3 günlük toplama örneğine karar verildi16. 3 günlük bir örneğin akciğer kanseri tespit olasılığını 1 veya 2 günlük bir örneğe kıyasla artırdığı gösterilmiştir26,27,28. Bununla birlikte, balgam toplamanın diğer yöntemleri farklı amaçlar için tercih edilebilir. Burada açıklanandan farklı bir balgam toplama yöntemi kullanılıyorsa, akış sitometrik analizi için kullanılan her antikor veya boyanın dikkatlice titratlanmasınız önerilir; farklı balgam toplama yöntemlerinin akış sitometrisi için hedeflenen proteinleri nasıl etkilediği hakkında çok az veri mevcuttur.

Öncelikle akış sitometrisi ile ilgili tanılama için balgam kullanma hevesini sönümleyen ikinci konu hücre numarasıdır. Sorun, güvenilir bir analiz için yeterli uygulanabilir hücrelerin toplanmasıdır. İki çalışma, invaziv olmayan yöntemlerle toplanan balgam örneklerinin, bir yardımcı cihaz yardımıyla, klinik tanı veya araştırma çalışmalarında kullanılabilecek yeterli uygulanabilir hücre içerdiğini göstermiştir16,24. Bununla birlikte, bu çalışmaların hiçbiri akış sitometrisi ile ilgili hücre sayıları sorununu ele almamıştır.

Bu protokolün temelini oluşturan çalışmalar için, her çalışma alanı için onaylanmış kurumsal kılavuzları izleyerek akciğer kanserine yakalanma riski yüksek katılımcılardan balgam örnekleri toplanarak alındı. Yüksek riskli katılımcılar 55-75 yaşları arasında, 30 paket yıl sigara içmiş ve son 15 yıl içinde sigarayı bırakmamış olarak tanımlanmıştır. Hastalara acapella cihazının üreticinin talimatlarına göre nasıl kullanılacağı gösterildi29 ve evde art arda üç gün boyunca balgam toplandı. Numune son koleksiyona kadar buzdolabında muhafaza edildi. Son toplama gününde, numune donmuş bir soğuk paketle bir gecede laboratuvara gönderildi. Numuneler alındıkları gün tek bir hücre süspansiyonuna işlendi. Bu balgam toplama yöntemi ile güvenilir bir akış sitometrik analizi için fazlasıyla uygulanabilir hücre elde edilir.

Son olarak ve önceki hücre sayısı sorunu ile ilgili olarak, balgam hücrelerinin mucinous ortamından nasıl serbest bırakılacağı sorusudur. Hücreler nasıl canlı tutulabilir ve akış sitometresini tıkamayan tek bir hücre süspansiyonu oluşturabilir? Pizzichini ve ark.30 ve Miller ve ark.31'in ilk çalışmalarına dayanarak, bu protokol balgam işleme için akış sitometrik analizi için uygun olan tek bir hücre süspansiyonuna kolay ve güvenilir bir yöntem açıklar. Bu yöntem, balgamdaki hematopoetik ve epitel hücrelerini tanımlamak ve bir akış sitometrik platformunda balgam analizini standartlaştıran cihaz ayarları, kalite kontrol önlemleri ve analiz kılavuzları sağlamak için verimli bir antikor etiketleme stratejisi geliştirmek için akış sitometrisinde iyi belirlenmiş kılavuzlar kullanmıştır.

Protokol

Balgam işlemenin tüm adımları, uygun kişisel koruyucu ekipmana sahip biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirilir.

1. Balgam ayrışmaya başlamadan önce reaktif hazırlama

  1. %1 Paraformaldehit (PFA), buzda numune başına 25 mL çözün ve kullanıma kadar soğuk tutun.
    DİkKAT: PFA inhalasyon ve cilt teması ile toksiktir. Düzelticiyi üreticinin talimatlarına göre hazırlayın ve kullanıma kadar 25 mL aliquots içinde -20 °C'de dondurun.
  2. Numunenin ağırlığını yaklaşık olarak kavr ve 2.2. adım için yeterli miktarda% 0.1 Dithiothreitol (DTT) çözün ve 37 ° C'ye getirin. (DTT'nin aliquotları kullanılmadan önce -20 °C'de saklanmalıdır.)
  3. Adım 2.2 için 37 °C'ye kadar yeterli %0,5 N-asetil-L-sistein (NAC) getirin. (NAC haftalık taze hale getirilmeli ve kullanılmadan önce 4 °C'de saklanmalıdır.)

2. Balgam ayrışması

  1. Ayrışma reaktiflerinin hacimlerini belirlemek için balgam örneğini tartın.
    NOT: başlangıç ağırlığı ≤3 g ise küçük, >3 g ama ≤8 g ise orta, >8 ise büyük ancak ≤16 g ve bir örnek >16 g ağırlığındaysa ekstra büyük olarak kabul edilir. Protokol boyunca küçük, orta, büyük ve ekstra büyük endikasyonlar kullanılacaktır. Ayrışma ve etiketleme için gereken reaktif miktarı balgam örneğinin boyutuna göre farklılık gösterir.
  2. Küçük bir numuneyi temiz bir 50 mL konik tüpe, orta bir numuneyi temiz 250 mL plastik tek kullanımlık şişeye veya büyük ve ekstra büyük bir numuneyi temiz bir 500 mL plastik tek kullanımlık şişeye aktarın. %0,5 NAC 1 mL/g örnek ağırlığı ve %0,1 DTT 4 mL/g numune ağırlığı ekleyin.
  3. Maksimum hızda (15 s için) girdap ve ardından 15 dakika boyunca oda sıcaklığında (maksimum hızda) kayan.
  4. NAC ve DTT'yi nötralize etmek için numuneyi dört cilt Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) (numune + reaktiflerin toplam hacmine göre) ile seyreltin; Vorteks maksimum hızda hızlı bir şekilde ve maksimum hızda 5 dakika boyunca oda sıcaklığında kayar.
  5. Tek hücreli süspansiyon oluşturmak için hücre süspansiyonunu 100 μm naylon ağ hücresi süzgeçlerinden bir veya daha fazla 50 mL konik santrifüj tüpüne filtreleyin.
  6. Hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 800 x g'da santrifüj edin. Süpernatantı aspire edin, tüm peletleri bir 15 mL konik tüpte birleştirin ve ardından aynı koşulları kullanarak peletleri HBSS ile yıkayın.
  7. Hücre peletini balgam örneğinin ilk ağırlığına göre belirlenen bir arabellek hacminde yeniden kullanın.
    NOT: Küçük bir numune 250 μL HBSS'de yeniden sınıflanır. Orta boy bir numune 760 μL HBSS'de yeniden kullanılabilir. Büyük ve ekstra büyük numuneler 1460 μL HBSS'de yeniden sınıflanır.
  8. Trypan Blue kullanarak canlı/ölü hücre sayısı için hücre süspansiyonunun bir aliquot'ını alın.
    NOT: Küçük bir numune için 5 μL kullanın. Orta, büyük veya ekstra büyük bir numune için 10 μL kullanın.
    1. 1:40'lık son bir numune seyreltme elde etmek için balgam seyreltmenin 10 μL'sini% 0,4 Trypan Blue'nun 30 μL'si ile karıştırın. Hücre sayısı için hemositometrenin sayım odalarına yükleyin.
      NOT: Hücre sayıları doğru bir sayı elde etmek için çok düşük veya çok yüksekse son seyreltmeyi ayarlamak gerekebilir. Balgam hücrelerini SEC'lerden ve döküntülerden doğru bir şekilde ayırt etmek için Guiot ve ark.20'ye danışmak burada şiddetle tavsiye edilir. Bu, doğru bir hücre sayısı için gereklidir.
  9. Ekstra büyük numuneden, toplamdan 50 x 106 hücre çıkarın ve toplam 1700 μL hacim oluşturmak için yeterli HBSS ile yeni bir tüp ekleyin.
    NOT: Bunu protokolün geri kalanı için büyük bir örnek olarak düşünün. Arta kalan örnekler atılabilir veya başka amaçlar için kullanılabilir.

3. Antikor ve canlılık boyası boyama

  1. Antikor ve boyama boyası seçimi
    NOT: Tablo 1 , bu protokolde kullanılan antikorları ve canlılık boyasını ve tanımladıkları hücre popülasyonlarını gösterir.
    1. Balgam hücrelerini içeren tüpleri etiketleyin (etiketler için Tablo 2'ye bakın).
    2. Tespit edilmemiş hücrelere sahip numune tüpü ve izotip kontrolüne sahip tüp için 5 mL akış sitomemetri tüpleri (kullanılan akış sitometresi ile uyumlu) kullanın. Kan ve epitel tüp örnekleri için 15 mL konik tüp kullanın.
      NOT: Bu numuneler antikor boyama ve fiksasyonu takiben akış sitometri tüplerine aktarılacaktır.
  2. Kompanzasyon tüplerini etiketle (Tablo 3).
    NOT: Kullanılan akış sitometresi ile uyumlu 5 mL akış sitomemetri tüpleri kullanın.
  3. Sırasıyla Tablo 2 ve Tablo 3'te belirtildiği gibi balgam hücresi tüplerinin ve kompanzasyon tüplerinin her birine HBSS, antikor ve/veya boya miktarını ekleyin.
    NOT: Tüm tüplerin boyama süresinin tutarlı olduğundan emin olmak için hücre veya kompanzasyon boncukları eklemeden önce tüm tüplere tampon (HBBS), antikorlar ve boya ekleyin.
  4. Tablo 2'de listelenen balgam hücresi hacmi miktarlarını test tüplerine ekleyin.
  5. Tablo 3'te listelendiği gibi kompanzasyon tüplerine kompanzasyon boncukları ekleyin.
  6. Işıktan korunan tüm tüpleri (tahlil ve kompanzasyon tüpleri) 35 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Ardından, tüpleri 4 °C'de 800 x g'da 10 dakika boyunca buz gibi HBSS ve santrifüj ile doldurun.
  7. Kompanzasyon tüpleri için, süpernatantı peletlere mümkün olduğunca yakın aspire edin ve gevşetmek için peletleri hafifçe vurun.
  8. Kompanzasyon tüplerine 0,5 mL soğuk HBSS ekleyin, 4 °C'de buzda saklayın ve akış sitometri analizi için gerekli olana kadar ışıktan koruyun.
  9. Santrifüjlemeden sonra (antikor boyama bölümünden 3.6. adım) sonra, yersiz izotip, kan ve epitel tüplerden süpernatantı aspire edin ve tüpleri sallayarak peletleri gevşetin.

4. %1 Paraformaldehit (PFA) ile fiksasyon

  1. Lekesiz, izotip, kan ve epitel tüplere soğuk% 1 PFA (şimdiye kadar çözülmesi gereken) ekleyin; Lekesiz ve izotip tüplere 2 mL, kan ve epitel tüplerine 10 mL.
  2. Tüpleri 1 saat boyunca ışıktan korunan buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Vortex 30 dakika sonra maksimum hızda hızlı bir şekilde.
  3. Tüpleri buz gibi HBSS ile doldurun. Daha sonra, 4 °C'de santrifüj tüpleri 1600 x g'da 10 dakika boyunca.
  4. Hücre peletini bozmadan mümkün olduğunca fazla süpernatant emiş ve hücreleri gevşetmek için tüpü parmaklarla hareket ettirin.
  5. Lekesiz ve izotip tüplere 200 μL soğuk HBSS ekleyin.
  6. Kanın ve epitel tüpünün yeniden canlandırılması için HBSS hacmini toplam hücre sayısına göre hesaplayın.
    NOT: Resüsyon hacmi = 0,15 x [toplam hücre sayısı (balgam ayrışması adım 8) / 106]. Ekstra büyük bir örnek için hücre sayısı olarak 50 x 106 kullanın.
  7. Akış sitometrisi analizi yapılana kadar buz üzerinde ışıktan korunan tüm numune ve kompanzasyon tüplerini 4 °C'de saklayın.
    NOT: Bu iletişim kuralı 24 saatten fazla depolama için sınanmamıştır.

5. Akış sitometresinde veri toplama

  1. Kullanılan akış sitometresi için uygun başlangıç yordamlarını uygulayın.
    NOT: Protokolün bu bölümünde, akış sitometresini işleten kişinin, özellikle optik ve akışkan sistemlerin stabilitesini kontrol etmek, ışık saçılımı ve floresan yoğunluğunu standartlaştırma teknikleri ve doğru kompanzasyon matrisini hesaplamak ve uygulamak da dahil olmak üzere günlük prosedürler ile ilgili olarak mevcut cihazın kullanımı konusunda eğitilmeleri varsaymaktadır.
  2. İleri saçılma ve yan dağılım voltajlarının, boncukları eksenlere çok yakın yerleştirmeden tüm arsayı kapsayacak şekilde yerleştirecek şekilde ayarlandığından emin olmak için Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü (NIST) boncuklarının karışımını kullanın.
    NOT: Bu adım, 5 μm'den küçük kalıntıların alım sonrası analizler ile ortadan kaldırılabilmesini sağlamak için çok önemlidir. Kullanılan akış sitometresine bağlı olarak, en küçük boncukların eşikle (LSR II veya Lirik kullanılırken) veya yüksek ayırıcıyla (Navios EX akış sitometresini kullanarak) dışlanmadığını unutmayın. Navios EX için, ileri ve yan dağılım için 2, ileri saçılma için 236 ve yan dağılım için 250 voltaj için 2 kazanç kullanılmıştır. LSR II için 165 ileri saçılma gerilimi ve 190 yan dağılım gerilimi kullanılmıştır.
  3. Akış hızını orta (LSR II) veya yüksek (Navios EX) olarak ayarlayın.
    NOT: Balgam tüplerini elde etmek için çoğu enstrüman için orta veya yüksek akış hızı kullanılabilir. Bir akış hızının çok yavaş kullanılması veya numunenin çok seyreltilmiş olmasının hücrelerin yerleşmesine neden olabileceğini ve bunun da istenmeyen vortekslerin artmasına neden olabileceğini belirtmek önemlidir. Bu nedenle, 4.6 adımında hesaplanan resüspensyon hacmine bağlı kalmak, hızlı bir şekilde elde edilebilen ancak makineyi tıkamayan hücresel yoğunluğa neden olmalıdır.
  4. Hücre popülasyonlarını ölçeğe yerleştirmek için dağılım ve floresan parametreleri için kullanılan her parametre için voltajları ayarlayın. Gerilimlerin buna göre nasıl ayarlanacağına rehberlik etmek için gating stratejisine sahip rakamları kullanın.
    NOT: Alma işleminden önce parametre seçim penceresinde gereken tüm parametrelerin seçildiğinden veya verilerin alınmayacağından emin olun.
  5. Önce lekesiz balgam örneği, ardından izotip lekeli örnek, sonra da kan tüpü ve epitel tüpü için veri alın.
    NOT: Hücre süspansiyonu, akış sitometresinin numuneleri tıkanmadan çalıştırmasına izin vermeyecek kadar konsantreyse, numuneler HBSS ile daha da seyreltilebilir.

Sonuçlar

Bu protokol klinik laboratuvar ayarı göz önünde bulundurularak geliştirilmiştir. Protokolün geliştirilmesi sırasında odak noktası basitlik, verimlilik ve tekrarlanabilirlikti. Balgamının işlenmesinde en çok zaman alan adımın hücreleri saymak olduğu bulunmuştur. Bu nedenle protokol, balgam işleme ve hücre etiketlemesi zaman kaybı olmadan hücre sayımından bağımsız olarak gerçekleştirilebilecek şekilde ayarlanır. Numuneyi engelsiz bir çalışma için uygun şekilde seyreltmek için hala ger...

Tartışmalar

Balganın hücresel içeriği, genellikle çok fazla enkazla birlikte çok çeşitli hücreler içerir37. Ek olarak, balgam analizi, numunenin ağız boşluğu yerine akciğerden toplandığını doğrulayan bir kalite kontrolü gerektirir38. Bu nedenle, balgamumu akış sitometrisi ile analiz etmek, örneğin çok daha temiz ve homojen bir hücre süspansiyonu serbest bırakan kan için olduğu kadar basit değildir. Bu protokol tüm bu sorunları ele almıştır: hem en k...

Açıklamalar

Tüm yazarlar bioAffinity Technologies'in geçmiş veya mevcut çalışanlarıdır.

Teşekkürler

David Rodriguez'e figür hazırlığındaki yardımı için teşekkür etmek istiyoruz. Balgam örnekleri UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) ve UL1 TR001120 (CTSA hibesi) tarafından desteklenen UT Health San Antonio Flow Cytometry Paylaşılan Kaynak Tesisi'ndeki BD LSR II'de çalıştırıldı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Paraformaldehyde Flow-FixPolysciences25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360Fisher Scientific08-771-19
3 M NaOHEMDSX0593-1
50 mL conical falcon tubeFisher Scientific14-432-22
Alexa488 anti-human CD19BioLegend302219
Alexa488 anti-human CD3BioLegend300415
Alexa488 anti-human cytokeratinBioLegend628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 IsotypeBioLegend400129
BV510 anti-human CD45BioLegend304036
CD66b FITC isotypeBD Biosciences555748
CompBead Plus Compensation BeadsBD Biosciences560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mLFisher Scientific09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mLFisher Scientific09-761-10
CS&T beadsBD Biosciences655051
DTTFisher ScientificBP172-5
FITC anti-human CD66bGeneTexGTX75907
Fixable Viability StainBD Biosciences564406
FlowCheckBeckman CoulterA69183
FlowSetBeckman CoulterA69184
HBSSFisher Scientific14-175-095
NACSigma-AldrichA9165
NIST Beads, 05 μMPolysciences64080
NIST Beads, 20 μMPolysciences64160
NIST Beads, 30 μMPolysciences64170
PE anti-human CD45BioLegend304039
PE-CF594 anti-human EpCAMBD Biosciences565399
PE-CF594 CD206/EpCAM IsotypeBD Biosciences562292
PE-CR594 anti-human CD206BD Biosciences564063
Sodium citrate dihydrateEMDSX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%Fisher Scientific15250061

Referanslar

  1. Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (7), 705-713 (2010).
  2. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews. Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).
  3. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
  4. Robinson, J. P., Roederer, M. History of science. Flow cytometry strikes gold. Science. 350 (6262), 739-740 (2015).
  5. Orfao, A., et al. Immunophenotypic dissection of normal hematopoiesis. Journal of Immunological Methods. 475, 112684 (2019).
  6. Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
  7. Bento, L. C., et al. The use of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: A review. Frontiers in Oncology. 7, 270 (2017).
  8. Della Porta, M. G., Picone, C. Diagnostic utility of flow cytometry in myelodysplastic syndromes. Mediterranean Journal of Hematology and Infectious Diseases. 9 (1), 2017017 (2017).
  9. Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2), 475-478 (2000).
  10. Spanevello, A., et al. Induced sputum cellularity. Reference values and distribution in normal volunteers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 162 (3), 1172-1174 (2000).
  11. Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
  12. Hastie, A. T., et al. Mixed sputum granulocyte longitudinal impact on lung function in the severe asthma research program. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (7), 882-892 (2021).
  13. Hastie, A. T., et al. Association of sputum and blood eosinophil concentrations with clinical measures of COPD severity: an analysis of the SPIROMICS cohort. The Lancet. Respiratory Medicine. 5 (12), 956-967 (2017).
  14. Kim, J., et al. Innate immune crosstalk in asthmatic airways: Innate lymphoid cells coordinate polarization of lung macrophages. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (5), 1769-1782 (2019).
  15. Bai, Y., Zhou, Q., Fang, Q., Song, L., Chen, K. Inflammatory cytokines and T-Lymphocyte subsets in serum and sputum in patients with bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 25, 2206-2210 (2019).
  16. Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-Carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
  17. Hristara-Papadopoulou, A., Tsanakas, J., Diomou, G., Papadopoulou, O. Current devices of respiratory physiotherapy. Hippokratia. 12 (4), 211-220 (2008).
  18. Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and biochemical analysis of induced sputum from asthmatic and from healthy subjects. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
  19. Alexis, N., Soukup, J., Ghio, A., Becker, S. Sputum phagocytes from healthy individuals are functional and activated: a flow cytometric comparison with cells in bronchoalveolar lavage and peripheral blood. Clinical Immunology. 97 (1), 21-32 (2000).
  20. Guiot, J., et al. Methodology for sputum induction and laboratory processing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56612 (2017).
  21. Paggiaro, P. L., et al. Sputum induction. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 3-8 (2002).
  22. Anjuman, N., Li, N., Guarnera, M., Stass, S. A., Jiang, F. Evaluation of lung flute in sputum samples for molecular analysis of lung cancer. Clinical and Translational Medicine. 2, 15 (2013).
  23. Sethi, S., Yin, J., Anderson, P. K. Lung flute improves symptoms and health status in COPD with chronic bronchitis: A 26 week randomized controlled trial. Clinical and Translational Medicine. 3, 29 (2014).
  24. Su, J., et al. Analysis of lung flute-collected sputum for lung cancer diagnosis. Biomarker Insights. 10, 55-61 (2015).
  25. Naraparaju, S., Vaishali, K., Venkatesan, P., Acharya, V. A comparison of the Acapella and a threshold inspiratory muscle trainer for sputum clearance in bronchiectasis-A pilot study. Physiotherapy Theory and Practice. 26 (6), 353-357 (2010).
  26. Hinson, K. F., Kuper, S. W. The diagnosis of lung cancer by examination of sputum. Thorax. 18, 350-353 (1963).
  27. Johnston, W. W., Bossen, E. H. Ten years of respiratory cytopathology at Duke University Medical Center. I. The cytopathologic diagnosis of lung cancer during the years 1970 to 1974, noting the significance of specimen number and type. Acta Cytologica. 25 (2), 103-107 (1981).
  28. Ng, A. B., Horak, G. C. Factors significant in the diagnostic accuracy of lung cytology in bronchial washing and sputum samples. II. Sputum samples. Acta Cytologica. 27 (4), 397-402 (1983).
  29. . Smiths Medical Videos Available from: https://videos.smiths-medical.com/search?q=acapella&page=1 (2021)
  30. Pizzichini, E., et al. Indices of airway inflammation in induced sputum: reproducibility and validity of cell and fluid-phase measurements. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154 (2), 308-317 (1996).
  31. Miller, H. R., Phipps, P. H., Rossier, E. Reduction of nonspecific fluorescence in respiratory specimens by pretreatment with N-acetylcysteine. Journal of Clinical Microbiology. 24 (3), 470-471 (1986).
  32. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  33. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  34. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
  35. Stewart, C. C., Stewart, S. J. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
  36. Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
  37. Kini, S. R. . Color Atlas of Pulmonary Cytopathology. , (2002).
  38. Papanicolaou Society of Cytopathology Task Force on Standards of Practice. Guidelines of the Papanicolaou Society of Cytopathology for the examination of cytologic specimens obtained from the respiratory tract. Diagnostic Cytopathology. 21 (1), 61-69 (1999).
  39. Holmes, K. L., et al. International Society for the Advancement of Cytometry cell sorter biosafety standards. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 85 (5), 434-453 (2014).
  40. Datta, S., Shah, L., Gilman, R. H., Evans, C. A. Comparison of sputum collection methods for tuberculosis diagnosis: a systematic review and pairwise and network meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (8), 760-771 (2017).
  41. Armstrong-Hough, M., et al. "Something so hard": a mixed-methods study of home sputum collection for tuberculosis contact investigation in Uganda. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease: The Official Journal of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. 22 (10), 1152-1159 (2018).
  42. Freeman, C. M., et al. Design of a multi-center immunophenotyping analysis of peripheral blood, sputum and bronchoalveolar lavage fluid in the Subpopulations and Intermediate Outcome Measures in COPD Study (SPIROMICS). Journal of Translational Medicine. 13, 19 (2015).
  43. Petsky, H. L., Li, A., Chang, A. B. Tailored interventions based on sputum eosinophils versus clinical symptoms for asthma in children and adults. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 8, 005603 (2017).
  44. Hisert, K. B., Liles, W. C., Manicone, A. M. A flow cytometric method for isolating cystic fibrosis airway macrophages from expectorated sputum. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (1), 42-50 (2019).
  45. Duncan, G. A., et al. Microstructural alterations of sputum in cystic fibrosis lung disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (18), 88198 (2016).
  46. Kemp, R. A., Reinders, D. M., Turic, B. Detection of lung cancer by automated sputum cytometry. Journal of Thoracic Oncology: Official Publication of the International Association for the Study of Lung Cancer. 2 (11), 993-1000 (2007).
  47. Blandin Knight, S., et al. Progress and prospects of early detection in lung cancer. Open Biology. 7 (9), (2017).
  48. Gomperts, B. N., Spira, A., Elashoff, D. E., Dubinett, S. M. Lung cancer biomarkers: FISHing in the sputum for risk assessment and early detection. Cancer Prevention Research. 3 (4), 420-423 (2010).
  49. Demoruelle, M. K., et al. Antibody responses to citrullinated and noncitrullinated antigens in the sputum of subjects with rheumatoid arthritis and subjects at risk for development of rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (4), 516-527 (2018).
  50. Wang, K., et al. Differences of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 shedding duration in sputum and nasopharyngeal swab specimens among adult inpatients with coronavirus disease 2019. Chest. 158 (5), 1876-1884 (2020).
  51. Chattopadhyay, P. K., Hogerkorp, C. -. M., Roederer, M. A chromatic explosion: the development and future of multiparameter flow cytometry. Immunology. 125 (4), 441-449 (2008).
  52. Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nature Immunology. 15 (2), 128-135 (2014).
  53. Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
  54. Chattopadhyay, P. K., et al. Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry. Nature Medicine. 12 (8), 972-977 (2006).
  55. Duetz, C., Bachas, C., Westers, T. M., Avan de Loosdrecht, A. A. Computational analysis of flow cytometry data in hematological malignancies: future clinical practice. Current Opinion in Oncology. 32 (2), 162-169 (2020).
  56. Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nature Reviews. Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır