ניתוח כיח מבוקר איכות לפי ציטומטריית זרימה

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לניתוק כיח למתלה תא בודד ואת האפיון הבא של תת-קבוצות סלולריות בפלטפורמות ציטומטריות סטנדרטיות של זרימה.

Abstract

כיח, בשימוש נרחב כדי ללמוד את התוכן התאי ותכונות מיקרו-ויברונמנטליות אחרות כדי להבין את בריאות הריאה, מנותח באופן מסורתי באמצעות מתודולוגיות מבוססות ציטולוגיה. השירות שלה מוגבל כי קריאת השקופיות גוזלת זמן רב ודורש כוח אדם מיוחד מאוד. יתר על כן, פסולת נרחבת ונוכחות של יותר מדי תאי אפיתל קשקשיים (SECs), או תאי הלחי, לעתים קרובות הופך מדגם לא מספיק לאבחון. לעומת זאת, ציטומטריית הזרימה מאפשרת פנוטיפינג בעל תפוקה גבוהה של אוכלוסיות הסלולר ובו זמנית למעט פסולת ו- SECs.

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה יעילה לניתוק כיח לתוך מתלה תא יחיד, כתם נוגדנים ותיקון אוכלוסיות הסלולר, ולרכוש דגימות על פלטפורמה ציטומטרית זרימה. אסטרטגיית גטינג המתארת את הדרת הפסולת, תאים מתים (כולל SECs) ומכפילי תאים מוצגת כאן. יתר על כן, עבודה זו מסבירה גם כיצד לנתח תאי כיח יחיד קיימא המבוססים על אשכול של בידול (CD)45 אוכלוסיות חיוביות ושליליות כדי לאפיין תת-קבוצות שושלת hematopoietic ושושלת אפיתל. אמצעי בקרת איכות מסופק גם על ידי זיהוי מקרופאגים ספציפיים לריאות כראיה לכך שדגימה נגזרת מהריאה ואינה רוק. לבסוף, הוכח כי שיטה זו יכולה להיות מיושמת על פלטפורמות ציטומטריות שונות על ידי מתן פרופילי כיח מאותו חולה שנותח על שלושה ציטומטרים זרימה; Navios EX, LSR II, וליריק. יתר על כן, פרוטוקול זה ניתן לשנות כדי לכלול סמנים סלולריים נוספים של עניין. שיטה לניתוח דגימת כיח שלמה על פלטפורמה ציטומטרית זרימה מוצגת כאן מה שהופך את הליחה למקובלת לפיתוח אבחון בעל תפוקה גבוהה של מחלת ריאות.

Introduction

ההתקדמות הטכנית בחומרה ובתוכנה של ציטומטרי זרימה אפשרה לזהות אוכלוסיות תאים נפרדות רבות בו ^{זמנית1,2,3,4}. הניצול של cytometer הזרימה במחקר תאים hematopoietic, למשל, הוביל להבנה הרבה יותר טובה של המערכת ^{החיסונית2} ואת ההיררכיה התאית של המערכת hematopoietic5, כמו גם הבחנה אבחונית של שפע של סרטן דם שונים6,7,8. למרות שרוב תאי הכיח הם ממוצא hematopoietic9,10,11, ציטומטריית זרימה לא יושם באופן נרחב על ניתוח כיח למטרות אבחון. עם זאת, מספר מחקרים מראים כי ההערכה של אוכלוסיות תאי מערכת החיסון בליחה (תת קבוצת התאים המשמעותית ביותר) עשויה לעזר רב באבחון ו/או ניטור מחלות כגון אסתמה ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD)12,13,14,15. יתר על כן, קיומם של סמנים ספציפיים לאפיתל שניתן להשתמש בהם בציטומטריית זרימה מאפשר לחקור את תת-קבוצה משמעותית ביותר של תאים בליחה, תאי אפיתל ריאות.

בנוסף ליכולת לנתח אוכלוסיות תאים נפרדות רבות ממקורות רקמות שונות, cytometer זרימה יכול להעריך מספר גדול של תאים בתקופה קצרה יחסית. לשם השוואה, סוגים ציטולוגיים מבוססי שקופיות של ניתוחים דורשים לעתים קרובות כוח אדם ו / או ציוד מיוחדים מאוד. ניתוחים אלה יכולים להיות עתירי עבודה, מה שמוביל רק לחלק ממדגם הכיח ^{המנותח16}.

שלוש בעיות קריטיות מגבילות את השימוש הנרחב בליחה בציטומטריית הזרימה. הגיליון הראשון מתייחס לאוסף הליחה. כיח נאסף באמצעות שיעול שאף המסלק ריר מהריאות לחלל הפה, ולאחר מכן יורק לתוך אוסף. מאז הריר נע דרך חלל הפה, יש סיכוי גבוה של זיהום SEC. זיהום זה מסבך את ניתוח הדגימה, אך הבעיה מתוקנת בקלות על פלטפורמה ציטומטרית זרימה, כפי שמוצג במחקר זה.

לא כל אחד יכול לייצר כיח באופן ספונטני; לכן, מספר מכשירים פותחו כדי לסייע עם אוסף כיח באופן לא ^{פולשני17}. הנבולייזר הוא מכשיר אחד כזה והוכח כמפיק דגימות כיח אמינות18,19,20. למרות nebulizer היא דרך יעילה מאוד של איסוף כיח באופן לא פולשני, השימוש בו עדיין דורש הגדרה במתקן רפואי עם כוח אדם ^מיוחד21. לעומת זאת, ניתן להשתמש במכשירי כף יד כגון חליל הריאה22,23,24 והאקפלה16,25 בבית מכיוון שהם ידידותיים מאוד למשתמש. התקני סיוע אלה בטוחים וחסכוניים כאחד.

עבורנו, האקפלה נתנה תוצאות טובות יותר באופן עקבי מאשר חליל ^{הריאות16}, ולכן, מכשיר acapella נבחר עבור אוספי כיח. דגימת איסוף של 3 ימים הוחלט כי המטרה העיקרית לשימוש בליחה היא לפתח בדיקת גילוי סרטן ^ריאות16. הוכח כי מדגם של 3 ימים מגביר את הסבירות לגילוי סרטן ריאות בהשוואה לדגימה של יום או יומיים26,27,28. עם זאת, שיטות אחרות של איסוף כיח עשויות להיות עדיפות למטרות שונות. אם נעשה שימוש בשיטת איסוף כיח שונה מזו המתוארת כאן, מומלץ לתבל בקפידה כל נוגדן או צבע המשמשים לניתוח ציטומטרי של זרימה; מעט מאוד נתונים זמינים על האופן שבו שיטות שונות לאיסוף כיח משפיעות על החלבונים הממוקדים לציטומטריית זרימה.

הנושא השני שמדכא את ההתלהבות משימוש בליחה לאבחון, הקשור בעיקר לציטומטריית הזרימה, הוא מספר התא. הבעיה היא איסוף של תאים ברי קיימא מספיק לניתוח אמין. שני מחקרים הראו כי דגימות כיח שנאספו בשיטות לא פולשניות, בעזרת מכשיר סיוע, מכילות מספיק תאים בני קיימא שניתן להשתמש בהם באבחון קליני או ^{במחקרים16,24}. עם זאת, אף אחד מהמחקרים הללו לא התייחס לנושא מספרי התאים בנוגע לציטומטריית הזרימה.

עבור המחקרים המהווים את הבסיס לפרוטוקול זה, נאספו דגימות כיח ממשתתפים בסיכון גבוה לפתח סרטן ריאות בעקבות הנחיות מוסדיות מאושרות לכל אתר מחקר. משתתפים בסיכון גבוה הוגדרו בין 55-75 שנים, לאחר שעישנו 30 שנות חבילה ולא הפסיקו לעשן ב -15 השנים האחרונות. המטופלים הראו כיצד להשתמש במכשיר אקפלה על פי הוראות ^היצרן29 ונאספו כיח במשך שלושה ימים רצופים בבית. הדגימה נשמרה במקרר עד האוסף האחרון. ביום האיסוף האחרון, הדגימה נשלחה למעבדה בלילה עם חבילה קרה קפואה. הדגימות עובדו לתוך השעיית תא אחד ביום שהם התקבלו. בשיטה זו של איסוף כיח, יותר ממספיק תאים קיימא מתקבלים לניתוח ציטומטרי זרימה אמין.

לבסוף, וקשור לבעיה הקודמת של מספר התא, היא השאלה כיצד לשחרר את תאי הכיח מסביבתו המוסינית. כיצד ניתן לשמור על התאים בני קיימא וליצור השעיית תא בודד שאינו סותם את ציטומטר הזרימה? מבוסס על עבודה ראשונית של פיצ'יני ואח' ³⁰ ומילר ואח' ³¹, פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה ואמינה לעיבוד כיח לתוך מתלה תא בודד המתאים לניתוח ציטומטרי של זרימה. שיטה זו השתמשה בהנחיות מבוססות היטב בציטומטריה של זרימה32,33,34 כדי לפתח אסטרטגיית תיוג נוגדנים יעילה לזיהוי תאים המטויים ואפיתל בליחה ולספק הגדרות מכשיר, אמצעי בקרת איכות והנחיות ניתוח התקנון ניתוח כיח בפלטפורמה ציטומטרית של זרימה.

Protocol

כל שלבי עיבוד הכיח מבוצעים בארון בטיחות ביולוגי עם ציוד מגן אישי מתאים.

1. הכנת ריאגנט לפני תחילת דיסוציאציה של כיח

1. מפשירים 1% Paraformaldehyde (PFA), 25 מ"ל לדגימה על קרח, ולשמור על קור עד השימוש.
   אזהרה: PFA רעיל על ידי שאיפה ומגע עור. הכן את הקיבעון על פי הוראות היצרן ולהקפיא ב -20 °C ב 25 mL aliquots עד השימוש.
2. משוער את המשקל של המדגם להפשיר מספיק 0.1% Dithiothreitol (DTT) לשלב 2.2 ולהביא אותו ל 37 °C (50 °F). (עליקות של DTT צריך להיות מאוחסן ב -20 °C (70 °F) לפני השימוש.)
3. להביא מספיק 0.5% N-אצטיל- L-ציסטאין (NAC) עד 37 °C (5 °F) לשלב 2.2. (NAC צריך להיות טרי שבועי ומאוחסן ב 4 °C (7 °F) לפני השימוש.)

2. דיסוציאציה של כיח

1. שקול את דגימת הכיח כדי לקבוע את הנפחים של ריאגנטים דיסוציאציה.
   הערה: מדגם נחשב קטן אם המשקל ההתחלתי הוא ≤3 גרם, בינוני אם >3 גרם אבל ≤8 גרם, גדול אם >8 אבל ≤16 גרם, וגדול במיוחד אם מדגם שוקל >16 גרם. האינדיקציות קטנות, בינוניות, גדולות וגדולות במיוחד ישמשו לאורך הפרוטוקול. כמות ריאגנטים הנדרשים לדיסוציאציה ותיוג שונה בהתאם לגודל דגימת הליחה.
2. העבר מדגם קטן לצינור חרוט נקי 50 מ"ל, מדגם בינוני לבקבוק חד פעמי פלסטיק נקי 250 מ"ל, או מדגם גדול וגדול במיוחד לבקבוק חד פעמי פלסטיק 500 מ"ל נקי. הוסף 1 מ"ל / גרם משקל מדגם של 0.5% NAC ו 4 מ"ל / גרם משקל מדגם של 0.1% DTT.
3. מערבולת במהירות המרבית (עבור 15 s), ולאחר מכן רוק בטמפרטורת החדר (במהירות המרבית) במשך 15 דקות.
4. לדלל את המדגם עם ארבעה כרכים של פתרון מלח מאוזן של האנק (HBSS) (בהתבסס על הנפח הכולל של מדגם + ריאגנטים) כדי לנטרל את NAC ו- DTT; מערבולת במהירות המרבית וסלע בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות במהירות המרבית.
5. סנן את מתלה התא באמצעות מסננת תאי רשת ניילון 100 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי אחד או יותר של 50 מ"ל כדי ליצור מתלה של תא יחיד.
6. צנטריפוגות התאים ב 800 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F). לשאוף את supernatant, לשלב את כל הכדורים בצינור חרוט אחד 15 מ"ל, ולאחר מכן לשטוף את הכדורים עם HBSS באמצעות אותם תנאים.
7. resuspend גלולה התא בנפח של חוצץ נקבע על ידי המשקל הראשוני של דגימת כיח.
   הערה: מדגם קטן הוא respended ב 250 μL של HBSS. מדגם בינוני הוא respended ב 760 μL של HBSS. דגימות גדולות וגדולות במיוחד נותנות מחדש ב- 1460 μL של HBSS.
8. קח aliquot של השעיית התא לספירת תאים חיים / מתים באמצעות טריפאן כחול.
   הערה: עבור מדגם קטן, השתמש 5 μL. לקבלת מדגם בינוני, גדול או גדול במיוחד, השתמש ב- 10 μL. לדלל 1:10 עם HBSS.
   1. לערבב 10 μL של דילול כיח עם 30 μL של 0.4% טריפן כחול כדי להשיג דילול מדגם סופי של 1:40. טען לתוך תאי הספירה של hemocytometer לספירת תאים.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את הדילול הסופי אם מספרי התאים נמוכים מדי או גבוהים מדי כדי להשיג ספירה מדויקת. מומלץ מאוד להתייעץ עם Guiot et ^al.20 להבחנה נכונה של תאי כיח לבין SECs ופסולת. זה חיוני לספירת תאים מדויקת.
9. מתוך המדגם הגדול במיוחד, להסיר 50 x ¹⁰⁶ תאים מהסכום הכולל ולהוסיף צינור חדש עם מספיק HBSS הוסיף כדי ליצור נפח כולל של 1700 μL.
   הערה: שקול זאת כדוגמה גדולה עבור שאר הפרוטוקול. ניתן להשליך או להשתמש בשאריות דגימות למטרות אחרות.

3. כתמי נוגדנים וצביעת קיימא

1. בחירה של נוגדנים וצבע מכתים
   הערה: טבלה 1 מציגה את הנוגדנים ואת צבע הכדאיות המשמשים בפרוטוקול זה ואת אוכלוסיות התאים שהם מזהים.
   1. סמן את הצינורות המכילים את תאי הכיח (ראה טבלה 2 עבור תוויות).
   2. השתמש בצינורות ציטומטריה של זרימה 5 מ"ל (תואם לציטומטר הזרימה המשמש) עבור צינור הדגימה עם התאים הלא מזוהמים והצינור עם בקרת האיזוטיפ. השתמש 15 mL צינורות חרוט עבור הדם ודגימות צינור אפיתל.
      הערה: דגימות אלה יועברו צינורות ציטומטריה זרימה בעקבות כתמי נוגדנים קיבעון.
2. סמן את צינורות הפיצוי (טבלה 3).
   הערה: השתמש בצינורות ציטומטריה של זרימה 5 מ"ל התואמים לציטומטר הזרימה הנמצא בשימוש.
3. הוסף את כמות HBSS, נוגדן ו / או צבע לכל אחד צינורות תא כיח וצינורות פיצוי כפי שצוין בטבלה 2 ושולחן 3, בהתאמה.
   הערה: הוסף חוצץ (HBBS), נוגדנים וצבע לכל הצינורות לפני הוספת תאים או חרוזי פיצוי כדי להבטיח שזמן ההכתמה של כל הצינורות עקבי.
4. הוסף את כמויות נפח תא הליחה המפורטות בטבלה 2 לצינורות ה- assay.
5. הוסף חרוזי פיצוי לצינורות הפיצוי כמפורט בטבלה 3.
6. לדגור את כל הצינורות (צינורות מבחנה ופיצוי) על קרח, מוגן מפני אור, במשך 35 דקות. לאחר מכן, מלא את הצינורות עם HBSS קר כקרח וצנטריפוגה ב 4 °C (50 °F) במשך 10 דקות ב 800 x g.
7. עבור צינורות הפיצוי, לשאוף את supernatant קרוב לכדורים ככל האפשר ולהעיף את הכדורים להשתחרר.
8. הוסף 0.5 מ"ל של HBSS קר לצינורות הפיצוי, לאחסן אותם על הקרח ב 4 °C (75 °F) ולהגן עליהם מפני אור עד הצורך לניתוח ציטומטריית זרימה.
9. שאפו את הסופרנט מהצינורות האיזוטיפים, הדם והאפיתל הלא מזוהים לאחר הצנטריפוגה (שלב 3.6 ממקטע הכתמת הנוגדנים) ושחררו את הכדורים על ידי הבהוב הצינורות.

4. קיבעון עם 1% Paraformaldehyde (PFA)

1. הוסף PFA קר 1% (אשר צריך להיות מופשר על ידי החברה) צינורות לא נגועים, איזוטיפ, דם, אפיתל; 2 מ"ל לצינורות האיזוטיפים הלא מזוהמים, ו-10 מ"ל לצינורות הדם והאפיתל.
2. לדגור על הצינורות על קרח, מוגן מפני אור במשך 1 שעה. מערבולת במהירות המרבית לאחר 30 דקות.
3. מלאו את הצינורות ב-HBSS קר כקרח. לאחר מכן, צינורות צנטריפוגה ב 4 °C (55 °F) במשך 10 דקות ב 1600 x g.
4. שאפו כמה שיותר סופר-טבעי מבלי להפריע לכדור התא והעבירו את הצינור עם האצבעות כדי לשחרר את התאים.
5. הוסף 200 μL של HBSS קר לצינורות איזוטיפ לא נגועים.
6. חשב את הנפח של HBSS עבור resuspension של הדם ואת צינור האפיתל על פי ספירת התאים הכוללת.
   הערה: נפח התחדשות = 0.15 x [ספירת תאים כוללת (שלב 8 של פירוק כיח) / ¹⁰⁶]. השתמש ב- 50 x ¹⁰⁶ כספירת התאים עבור מדגם גדול במיוחד.
7. לאחסן את כל מדגם צינורות פיצוי, מוגן מפני אור על הקרח ב 4 °C (50 °F) עד ניתוח ציטומטריית זרימה מבוצע.
   הערה: פרוטוקול זה לא נבדק לאחסון במשך יותר מ- 24 שעות.

5. רכישת נתונים על ציטומטר הזרימה

1. החל הליכי אתחול מתאימים עבור cytometer הזרימה בשימוש.
   הערה: סעיף זה בפרוטוקול מניח כי האדם המפעיל את cytometer הזרימה מאומן בשימוש במכשיר העומד לרשותם, במיוחד לגבי נהלים יומיים כולל בדיקת היציבות של מערכות אופטיקה ו fluidics, טכניקות לתקנן פיזור אור ועוצמת פלואורסצנטיות, כמו גם חישוב והחלת מטריצת הפיצוי הנכונה.
2. השתמש בתערובת של חרוזים של המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה (NIST) כדי להבטיח כי מתחי פיזור וזרימת צד קדימה מוגדרים למקם את חרוזי NIST כדי להתפרש על כל החלקה מבלי למקם את החרוזים קרוב מדי לצירים.
   הערה: שלב זה חיוני כדי להבטיח כי פסולת קטנה מ 5 מיקרומטר ניתן לבטל על ידי ניתוח לאחר הרכישה. בהתאם לציטומטר הזרימה המשמש, שים לב כי החרוזים הקטנים ביותר אינם נכללים עם הסף (בעת שימוש LSR II או הליריקה) או עם המפלה הגבוהה (באמצעות Cytometer זרימה Navios EX). עבור Navios EX, רווח של 2 שימש עבור פיזור קדימה וצד, מתח של 236 עבור פיזור קדימה, ו 250 עבור פיזור צד. עבור LSR II, מתח פיזור קדימה של 165 ומתח פיזור צדדי של 190 שימש.
3. הגדר את קצב הזרימה לבינוני (LSR II) או גבוה (Navios EX).
   הערה: קצב הזרימה הבינוני או הגבוה עבור רוב המכשירים יכול לשמש לרכישת צינורות כיח. חשוב לציין כי שימוש איטי מדי של קצב זרימה או לדלל מדי של המדגם עלול לגרום לתאים להתיישב, וכתוצאה מכך מערבולת מוגברת אשר אינו הרצוי. לכן, היצמדות לנפח ההשתתפות המחושבת בשלב 4.6 אמורה לגרום לצפיפות תאית שניתן לרכוש במהירות אך לא לסתום את המכונה.
4. התאם את המתחים עבור כל פרמטר המשמש לפרמטרים של פיזור ופלואורסצנטי כדי למקם את אוכלוסיות התאים בסולם. השתמש בנתונים עם אסטרטגיית הגטינג כהדרכה כיצד להתאים את המתחים בהתאם.
   הערה: ודא שכל הפרמטרים הדרושים נבחרים בחלון בחירת הפרמטרים לפני הרכישה או שהנתונים לא יירכשו.
5. לרכוש נתונים עבור דגימת כיח נגוע תחילה, ואחריו מדגם מוכתם איזוטיפ, ולאחר מכן צינור הדם ואת צינור האפיתל.
   הערה: אם ההשעיה של התא מרוכזת מדי כדי לאפשר לציטומטר הזרימה להפעיל את הדגימות מבלי לסתום, הדגימות עשויות להיות מדוללות עוד יותר עם HBSS.

תוצאות

פרוטוקול זה פותח תוך התחשבות במעבדה קלינית. ההתמקדות במהלך פיתוח הפרוטוקול הייתה על פשטות, יעילות ושחזור. נמצא כי השלב הגוזל זמן רב ביותר בעיבוד של כיח היה לספור את התאים. לכן, הפרוטוקול מוגדר באופן כזה כי עיבוד כיח ותיוג תאים ניתן לבצע בנפרד מספירת תאים ללא אובדן זמן. ספירת תאים מדויקת, שעד...

Discussion

התוכן התאי של כיח כולל מגוון גדול של תאים רחבים, לעתים קרובות מלווה הרבה ^פסולת37. בנוסף, ניתוח כיח דורש בקרת איכות המאשרת את המדגם שנאסף מהריאה במקום מחלל ^הפה38. לכן, זה לא פשוט לנתח כיח על ידי ציטומטריה זרימה כפי שהוא עבור דם, למשל, אשר משחרר הרבה יותר נקי הומוגני השע?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061