Qualitätskontrollierte Sputumanalyse mittels Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Dissoziation von Sputum in eine einzelne Zellsuspension und die anschließende Charakterisierung zellulärer Untergruppen auf Standard-Durchflusszytometrieplattformen.

Zusammenfassung

Sputum, weit verbreitet, um den zellulären Inhalt und andere mikroumweltliche Merkmale zu untersuchen, um die Gesundheit der Lunge zu verstehen, wird traditionell mit zytologischen Methoden analysiert. Sein Nutzen ist begrenzt, da das Lesen der Folien zeitaufwendig ist und hochspezialisiertes Personal erfordert. Darüber hinaus machen ausgedehnte Trümmer und das Vorhandensein von zu vielen Plattenepithelzellen (SECs) oder Wangenzellen eine Probe oft für die Diagnose ungeeignet. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Durchflusszytometrie eine Hochdurchsatz-Phänotypisierung zellulärer Populationen bei gleichzeitigem Ausschluss von Trümmern und SECs.

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine effiziente Methode, um Sputum in eine einzelne Zellsuspension zu dissoziieren, Antikörper zu färben und zelluläre Populationen zu fixieren und Proben auf einer durchflusszytometrischen Plattform zu entnehmen. Eine Gating-Strategie, die den Ausschluss von Trümmern, toten Zellen (einschließlich SECs) und Zelldouletten beschreibt, wird hier vorgestellt. Darüber hinaus erklärt diese Arbeit auch, wie lebensfähige, einzelne Sputumzellen basierend auf einem Cluster von Differenzierungspopulationen (CD) 45 positiven und negativen Populationen analysiert werden können, um hämatopoetische und epitheliale Abstammungsuntergruppen zu charakterisieren. Eine Qualitätskontrollmaßnahme wird auch durch die Identifizierung lungenspezifischer Makrophagen als Beweis dafür bereitgestellt, dass eine Probe aus der Lunge stammt und kein Speichel ist. Schließlich wurde gezeigt, dass diese Methode auf verschiedene zytometrische Plattformen angewendet werden kann, indem Sputumprofile desselben Patienten bereitgestellt werden, die auf drei Durchflusszytometern analysiert wurden. Navios EX, LSR II und Lyric. Darüber hinaus kann dieses Protokoll modifiziert werden, um zusätzliche zelluläre Marker von Interesse aufzunehmen. Hier wird eine Methode zur Analyse einer gesamten Sputumprobe auf einer durchflusszytometrischen Plattform vorgestellt, die Sputum für die Entwicklung einer Hochdurchsatzdiagnostik von Lungenerkrankungen geeignet macht.

Einleitung

Technische Fortschritte in der Hard- und Software von Durchflusszytometern haben es ermöglicht, viele verschiedene Zellpopulationen gleichzeitig zu identifizieren1,2,3,4. Der Einsatz des Durchflusszytometers in der hämatopoetischen Zellforschung hat beispielsweise zu einem viel besseren Verständnis des ^{Immunsystems2} und der zellulären Hierarchie des hämatopoetischen ^Systems5 sowie zur diagnostischen Unterscheidung einer Vielzahl verschiedener Blutkrebsarten ^{geführt6,7,8}<....

Protokoll

Alle Schritte der Sputumaufbereitung werden in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt.

1. Reagenzienvorbereitung vor Beginn der Sputumdissoziation

1. 1% Paraformaldehyd (PFA), 25 ml pro Probe auf Eis auftauen und bis zum Gebrauch kalt aufbewahren.
   VORSICHT: PFA ist giftig durch Einatmen und Hautkontakt. Bereiten Sie das Fixiermittel gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und frieren Sie es bei -20 °C in 25 ml Aliquots bis zum Gebrauch ein.
2. Ungefähr das Gewicht der Probe und 0,1% Dithiothreitol (DTT) für Schritt 2.2 auftauen und auf 37 °C bringen. (Aliquots....

Ergebnisse

Dieses Protokoll wurde mit Blick auf ein klinisches Labor entwickelt. Der Fokus bei der Entwicklung des Protokolls lag auf Einfachheit, Effizienz und Reproduzierbarkeit. Es wurde festgestellt, dass der zeitaufwendigste Schritt bei der Verarbeitung von Sputum das Zählen der Zellen war. Daher ist das Protokoll so aufgebaut, dass die Sputumverarbeitung und Zellmarkierung unabhängig von der Zellzählung ohne Zeitverlust durchgeführt werden kann. Eine genaue Zellzahl, die immer noch notwendig ist, um die Probe für einen u.......

Diskussion

Der zelluläre Gehalt des Sputums umfasst eine Vielzahl von weit reichenden Zellen, oft begleitet von vielen ^Trümmern37. Darüber hinaus erfordert die Sputumanalyse eine Qualitätskontrolle, die bestätigt, dass die Probe aus der Lunge und nicht aus der Mundhöhle entnommen ^wird38. Daher ist es nicht so einfach, Sputum mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, wie es beispielsweise bei Blut der Fall ist, das eine viel sauberere und homogenere Zellsuspension freisetzt. D.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061