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Resumo

Este protocolo descreve um método eficiente para dissociar a escarro em uma única suspensão celular e a subsequente caracterização de subconjuntos celulares em plataformas citométricas de fluxo padrão.

Resumo

O sputum, amplamente utilizado para estudar o conteúdo celular e outras características microambientais para entender a saúde do pulmão, é tradicionalmente analisado por meio de metodologias baseadas em citologia. Sua utilidade é limitada porque a leitura dos slides é demorada e requer pessoal altamente especializado. Além disso, detritos extensos e a presença de muitas células epiteliais escamosas (SECs), ou células da bochecha, muitas vezes torna uma amostra inadequada para o diagnóstico. Em contraste, a citometria de fluxo permite fenotipagem de alto rendimento de populações celulares, excluindo simultaneamente detritos e SECs.

O protocolo aqui apresentado descreve um método eficiente para dissociar a escarro em uma única suspensão celular, mancha de anticorpos e fixar populações celulares, e adquirir amostras em uma plataforma citométrica de fluxo. Uma estratégia de gating que descreve a exclusão de detritos, células mortas (incluindo SECs) e doublets de células é apresentada aqui. Além disso, este trabalho também explica como analisar células de escarro única viáveis baseadas em um aglomerado de diferenciação (CD)45 populações positivas e negativas para caracterizar subconjuntos de linhagem hematopoiética e epitelial. Uma medida de controle de qualidade também é fornecida pela identificação de macrófagos específicos do pulmão como evidência de que uma amostra é derivada do pulmão e não é saliva. Finalmente, foi demonstrado que este método pode ser aplicado a diferentes plataformas citométricas, fornecendo perfis de escarro do mesmo paciente analisado em três citómetros de fluxo; Navios EX, LSR II e Lyric. Além disso, este protocolo pode ser modificado para incluir marcadores celulares adicionais de interesse. Um método para analisar uma amostra de escarro inteira em uma plataforma citométrica de fluxo é apresentado aqui que torna a escarro favorável para o desenvolvimento de diagnósticos de alta produtividade de doenças pulmonares.

Introdução

Os avanços técnicos no hardware e software de citómetros de fluxo permitiram identificar muitas populações celulares distintas simultaneamente1,2,3,4. A utilização do citómetro de fluxo na pesquisa de células hematopoiéticas, por exemplo, levou a uma compreensão muito melhor do sistema imunológico2 e da hierarquia celular do sistema hematopoiético5, bem como a distinção diagnóstica de uma infinidade de diferentes cânceres sanguíneos6,7,8. Embora a maioria das células de escarro sejam de origem hematopoiética9,10,11, a citometria de fluxo não tem sido amplamente aplicada à análise de escarro para fins diagnósticos. No entanto, vários estudos sugerem que a avaliação das populações de células imunes na escarro (o subconjunto mais significativo de células) pode ser de grande ajuda no diagnóstico e/ou monitoramento de doenças como asma e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)12,13,14,15. Além disso, a existência de marcadores epiteliais específicos que podem ser usados na citometria de fluxo permite o interrogatório do subconjunto mais significativo de células em escarro, células epiteliais pulmonares.

Além da capacidade de analisar muitas populações celulares distintas de diferentes origens teciduais, um citômetro de fluxo pode avaliar um grande número de células em um período relativamente curto. Em comparação, os tipos de análises cológicas baseadas em slides muitas vezes requerem pessoal e/ou equipamento altamente especializados. Essas análises podem ser intensivas em mão-de-obra, o que leva a apenas uma proporção da amostra de escarro que está sendo analisada16.

Três questões críticas limitam o uso generalizado de escarro na citometria de fluxo. A primeira questão diz respeito à coleta de escarro. A saliva é coletada através de uma tosse que expele muco dos pulmões para a cavidade oral, posteriormente cuspindo em um copo de coleta. Uma vez que o muco viaja através da cavidade oral, há uma alta chance de contaminação sec. Essa contaminação complica a análise da amostra, mas o problema é facilmente corrigido em uma plataforma citométrica de fluxo, como mostrado neste estudo.

Nem todo mundo pode produzir escarro espontaneamente; por isso, vários dispositivos foram desenvolvidos para auxiliar na coleta de escarro de forma não invasiva17. O nebulizador é um desses dispositivos e tem sido mostrado para produzir amostras de escarro confiáveis18,19,20. Embora o nebulizador seja uma forma muito eficaz de coleta não invasiva, seu uso ainda requer uma configuração em uma instalação médica com pessoal especializado21. Em contraste, dispositivos portáteis como a flauta pulmonar22,23,24 e o acapella16,25 podem ser usados em casa, pois são muito fáceis de usar. Estes dispositivos de assistência são seguros e econômicos.

Para nós, a acapella deu resultados consistentemente melhores do que a flauta pulmonar16 e, portanto, o dispositivo de acapella foi escolhido para coleções de escarro. Uma amostra de coleta de 3 dias foi decidida porque o objetivo principal do uso de escarro é desenvolver um teste de detecção de câncer de pulmão16. Foi demonstrado que uma amostra de 3 dias aumenta a probabilidade de detecção de câncer de pulmão em comparação com uma amostra de 1 ou 2 dias26,27,28. No entanto, outros métodos de coleta de escarro podem ser preferíveis para diferentes propósitos. Se um método de coleta de escarro diferente for utilizado do que o descrito aqui, recomenda-se titular cuidadosamente cada anticorpo ou corante usado para análise citométrica de fluxo; muito poucos dados estão disponíveis sobre como diferentes métodos de coleta de escarro afetam as proteínas-alvo para citometria de fluxo.

A segunda questão que amortece o entusiasmo pelo uso de escarro para diagnósticos, principalmente relacionados à citometria de fluxo, é o número de células. O problema é a coleta de células viáveis suficientes para uma análise confiável. Dois estudos demonstraram que amostras de escarro coletadas por métodos não invasivos, com a ajuda de um dispositivo auxiliar, contêm células viáveis suficientes que podem ser utilizadas em diagnóstico clínico ou estudos de pesquisa16,24. No entanto, nenhum desses estudos abordou a questão dos números celulares relativos à citometria de fluxo.

Para os estudos que formam a base para este protocolo, foram coletadas amostras de escarro de participantes de alto risco para o desenvolvimento de câncer de pulmão seguindo diretrizes institucionais aprovadas para cada local de estudo. Os participantes de alto risco foram definidos entre 55 e 75 anos, tendo fumado 30 anos de embalagem e não ter parado de fumar nos últimos 15 anos. Os pacientes foram mostrados como usar o dispositivo de acapella de acordo com as instruções do fabricante29 e coletaram escarro por três dias consecutivos em casa. A amostra foi mantida na geladeira até a última coleta. No último dia de coleta, a amostra foi enviada ao laboratório durante a noite com um pacote frio congelado. As amostras foram processadas em uma única suspensão celular no dia em que foram recebidas. Com este método de coleta de escarro, mais do que suficientes células viáveis são obtidas para uma análise citométrica de fluxo confiável.

Por fim, e relacionado com a emissão anterior do número de células, é a questão de como liberar as células de escarro de seu ambiente mucinoso. Como as células podem ser mantidas viáveis e criar uma única suspensão celular que não obstrua o citómetro de fluxo? Baseado no trabalho inicial de Pizzichini et al.30 e Miller et al.31, este protocolo descreve um método fácil e confiável para o processamento de escarro em uma única suspensão celular adequada para análise citométrica de fluxo. Este método tem utilizado diretrizes bem estabelecidas na citometria de fluxo32,33,34 para desenvolver uma estratégia eficiente de rotulagem de anticorpos para identificar células hematopoiéticas e epiteliais em escarro e fornecer configurações de instrumentos, medidas de controle de qualidade e diretrizes de análise padronizando a análise de escarro em uma plataforma citométrica de fluxo.

Protocolo

Todas as etapas do processamento de escarro são realizadas em um gabinete de segurança biológica com equipamentos de proteção individual adequados.

1. Preparação do reagente antes de iniciar a dissociação do escarro

  1. Descongele 1% Paraformaldeído (PFA), 25 mL por amostra no gelo e mantenha frio até o uso.
    ATENÇÃO: O PFA é tóxico por inalação e contato com a pele. Prepare o fixador de acordo com as instruções do fabricante e congele a -20 °C em alíquotas de 25 mL até usar.
  2. Aproxime o peso da amostra e descongele 0,1% Dithiothreitol (DTT) para a etapa 2.2 e leve-a a 37 °C. (As alíquotas de DTT devem ser armazenadas a -20 °C antes do uso.)
  3. Leve 0,5% N-acetil-L-cisteína (NAC) até 37 °C para a etapa 2.2. (O NAC deve ser feito fresco semanalmente e armazenado a 4 °C antes do uso.)

2. Dissociação de sputum

  1. Pese a amostra de escarro para determinar os volumes de reagentes de dissociação.
    NOTA: Considera-se que uma amostra é pequena se o peso inicial for ≤3 g, médio se > 3 g, mas ≤ 8 g, grande se >8, mas ≤16 g, e extra-grande se uma amostra pesa >16 g. As indicações pequenas, médias, grandes e extra-grandes serão utilizadas em todo o protocolo. A quantidade de reagentes necessários para dissociação e rotulagem diferem de acordo com o tamanho da amostra de escarro.
  2. Transfira uma pequena amostra para um tubo cônico limpo de 50 mL, uma amostra média para uma garrafa descartável de plástico de 250 mL limpa, ou uma amostra grande e extra-grande para uma garrafa descartável de plástico limpa de 500 mL. Adicione 1 mL/g de peso amostral de 0,5% NAC e 4 mL/g de peso amostral de 0,1% DTT.
  3. Vórtice em velocidade máxima (para 15 s), e depois arrasa em temperatura ambiente (em velocidade máxima) por 15 minutos.
  4. Diluir a amostra com quatro volumes da Solução de Sal Balanceado (HBSS) da Hank (com base no volume total de amostras + reagentes) para neutralizar o NAC e o DTT; vórtice rapidamente em velocidade máxima e rocha em temperatura ambiente por 5 minutos em velocidade máxima.
  5. Filtre a suspensão da célula através de um filtro de célula de malha de nylon de 100 μm em um ou mais tubos de centrífuga cônica de 50 mL para criar uma suspensão unicelular.
  6. Centrifugar as células a 800 x g por 10 min a 4 °C. Aspire o supernasce, combine todas as pelotas em um tubo cônico de 15 mL e depois lave as pelotas com HBSS usando as mesmas condições.
  7. Resuspengem a pelota celular em um volume de tampão determinado pelo peso inicial da amostra de escarro.
    NOTA: Uma pequena amostra é resuspendida em 250 μL de HBSS. Uma amostra média é resuspendida em 760 μL de HBSS. Amostras grandes e extra-grandes são resuspendidas em 1460 μL de HBSS.
  8. Pegue uma alíquota da suspensão da célula para uma contagem de células viva/morta usando o Trypan Blue.
    NOTA: Para uma amostra pequena, use 5 μL. Para uma amostra média, grande ou extra-grande, use 10 μL. Diluir 1:10 com HBSS.
    1. Misture 10 μL da diluição do escarro com 30 μL de 0,4% Trypan Blue para obter uma diluição amostral final de 1:40. Carregue nas câmaras de contagem de um hemócito para uma contagem de células.
      NOTA: Pode ser necessário ajustar a diluição final se os números de células estiverem muito baixos ou muito altos para obter uma contagem precisa. Consultar Guiot et al.20 para distinguir corretamente células de escarro de SECs e detritos é fortemente recomendado aqui. Isso é essencial para uma contagem de células precisa.
  9. Da amostra extra-grande, remova 50 x 106 células do total e adicione a um novo tubo com HBSS adicionado o suficiente para criar um volume total de 1700 μL.
    NOTA: Considere esta uma amostra grande para o restante do protocolo. As amostras restantes podem ser descartadas ou usadas para outros fins.

3. Mancha de corante anticorpo e viabilidade

  1. Escolha de anticorpos e corante de coloração
    NOTA: A Tabela 1 mostra os anticorpos e o corante de viabilidade que são utilizados neste protocolo e as populações celulares que identificam.
    1. Rotule os tubos que contêm as células de escarro (ver Tabela 2 para etiquetas).
    2. Use tubos de citometria de fluxo de 5 mL (compatíveis com o citômetro de fluxo utilizado) para o tubo de amostra com as células não manchadas e o tubo com o controle do isótipo. Use tubos cônicos de 15 mL para as amostras de sangue e tubo epitelial.
      NOTA: Estas amostras serão transferidas para tubos de citometria de fluxo após a coloração e fixação de anticorpos.
  2. Rotule os tubos de compensação (Tabela 3).
    NOTA: Utilize tubos de citometria de fluxo de 5 mL compatíveis com o cítmetro de fluxo que está sendo utilizado.
  3. Adicione a quantidade de HBSS, anticorpos e/ou corantes a cada um dos tubos de células de escarro e tubos de compensação, conforme indicado na Tabela 2 e Na Tabela 3, respectivamente.
    NOTA: Adicione tampão (HBBS), anticorpos e corante a todos os tubos antes de adicionar células ou contas de compensação para garantir que o tempo de coloração de todos os tubos seja consistente.
  4. Adicione as quantidades de volume de células de escarro listadas na Tabela 2 aos tubos de ensaio.
  5. Adicione contas de compensação aos tubos de compensação conforme listado na Tabela 3.
  6. Incubar todos os tubos (tubos de ensaio e compensação) no gelo, protegidos da luz, por 35 minutos. Em seguida, encha os tubos com HBSS gelado e centrífuga a 4 °C por 10 min a 800 x g.
  7. Para os tubos de compensação, aspire o supernante o mais próximo possível das pelotas e aperte as pelotas para soltar.
  8. Adicione 0,5 mL de HBSS frio aos tubos de compensação, armazene-os no gelo a 4 °C e proteja-os da luz até que seja necessário para a análise da citometria de fluxo.
  9. Aspire o supernatante do isótipo, sangue e tubos epiteliais não contidos após a centrifugação (passo 3.6 da seção de coloração de anticorpos) e solte as pelotas apertando os tubos.

4. Fixação com 1% de paraformaldeído (PFA)

  1. Adicione a PFA fria de 1% (que deve ser descongelada até agora) aos tubos não localizados, isótipo, sangue e epitelial; 2 mL para os tubos de isótipo e isótipo não manchados, e 10 mL para os tubos sanguíneos e epiteliais.
  2. Incubar os tubos no gelo, protegidos da luz por 1h. Vórtice rapidamente em velocidade máxima após 30 min.
  3. Encha os tubos com HBSS gelado. Em seguida, tubos de centrífugas a 4 °C por 10 min a 1600 x g.
  4. Aspire o máximo de supernasce possível sem perturbar a pelota celular e aperte o tubo com os dedos para soltar as células.
  5. Adicione 200 μL de HBSS frio aos tubos de isótipo e isótipo não manchados.
  6. Calcule o volume de HBSS para resuspensão do sangue e tubo epitelial de acordo com a contagem total de células.
    NOTA: Volume de resuspensão = 0,15 x [contagem total de células (etapa 8 de dissociação de escarro) / 106]. Use 50 x 106 como contagem de células para uma amostra extra-grande.
  7. Armazene todos os tubos de amostra e compensação, protegidos da luz no gelo a 4 °C até que a análise da citometria de fluxo seja realizada.
    NOTA: Este protocolo não foi testado para armazenamento por mais de 24 horas.

5. Aquisição de dados no cicímetro de fluxo

  1. Aplique procedimentos de inicialização adequados para o cítmetro de fluxo que está sendo utilizado.
    NOTA: Esta seção do protocolo pressupõe que a pessoa que opera o citômetro de fluxo é treinada no uso do instrumento disponível a eles, especialmente no que diz respeito aos procedimentos diários, incluindo a verificação da estabilidade dos sistemas ópticos e fluidos, técnicas para padronizar a dispersão de luz e intensidade de fluorescência, bem como calcular e aplicar a matriz de compensação correta.
  2. Use a mistura de contas do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) para garantir que as tensões de dispersão para a frente e dispersão lateral sejam definidas para colocar as contas NIST para cobrir todo o enredo sem colocar as contas muito perto dos eixos.
    NOTA: Esta etapa é crucial para garantir que detritos menores que 5 μm possam ser eliminados por meio da análise pós-aquisição. Dependendo do citómetro de fluxo utilizado, esteja atento que as menores contas não estão sendo excluídas com o limiar (ao usar o LSR II ou o Lyric) ou com o alto discriminador (usando o citômetro de fluxo Navios EX). Para o Navios EX, foi utilizado um ganho de 2 para a dispersão dianteira e lateral, uma tensão de 236 para dispersão para a frente e 250 para dispersão lateral. Para o LSR II, foi utilizada uma tensão de dispersão para a frente de 165 e uma tensão de dispersão lateral de 190.
  3. Defina a vazão para médio (LSR II) ou alto (Navios EX).
    NOTA: A taxa média ou alta de fluxo para a maioria dos instrumentos pode ser usada para adquirir os tubos de escarro. É importante notar que o uso muito lento de uma taxa de fluxo ou muito diluído da amostra pode resultar na fixação das células, resultando em um aumento do vórtice que não é desejado. Portanto, a adesão ao volume calculado de resuspensão na etapa 4.6 deve resultar em densidade celular que pode ser adquirida rapidamente, mas não entupir a máquina.
  4. Ajuste as tensões para cada parâmetro utilizado para os parâmetros de dispersão e fluorescentes para colocar as populações celulares na escala. Use os números com a estratégia de gating como orientação sobre como ajustar as tensões de acordo.
    NOTA: Certifique-se de que todos os parâmetros necessários sejam selecionados na janela de seleção de parâmetros antes da aquisição ou que os dados não sejam adquiridos.
  5. Adquira os dados da amostra de escarro não manchada primeiro, seguido pela amostra manchada de isótipo, e depois o tubo sanguíneo e o tubo epitelial.
    NOTA: Se a suspensão da célula estiver muito concentrada para permitir que o citômetro de fluxo execute as amostras sem entupimento, as amostras podem ser diluídas com HBSS.

Resultados

Este protocolo foi desenvolvido com um ambiente de laboratório clínico em mente. O foco durante o desenvolvimento do protocolo foi a simplicidade, eficiência e reprodutibilidade. Verificou-se que o passo mais demorado no processamento da escarro era contar as células. Portanto, o protocolo é configurado de tal forma que o processamento de escarro e rotulagem celular possam ser realizados independentemente da contagem celular sem perda de tempo. Uma contagem de células precisa, que ainda é necessária para diluir a...

Discussão

O conteúdo celular da escarro inclui uma grande variedade de células amplas, muitas vezes acompanhadas por muitos detritos37. Além disso, a análise da escarro requer um controle de qualidade que confirme que a amostra é coletada do pulmão em vez da cavidade oral38. Portanto, não é tão simples analisar a escarro por citometria de fluxo como é para o sangue, por exemplo, que libera uma suspensão celular muito mais limpa e homogênea. Este protocolo abordou todas es...

Divulgações

Todos os autores são funcionários antigos ou atuais da bioAffinity Technologies.

Agradecimentos

Queremos agradecer a David Rodriguez por sua ajuda com a preparação da figura. As amostras de sputum foram realizadas no BD LSR II no UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, apoiado pela UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) e UL1 TR001120 (bolsa CTSA).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Paraformaldehyde Flow-FixPolysciences25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360Fisher Scientific08-771-19
3 M NaOHEMDSX0593-1
50 mL conical falcon tubeFisher Scientific14-432-22
Alexa488 anti-human CD19BioLegend302219
Alexa488 anti-human CD3BioLegend300415
Alexa488 anti-human cytokeratinBioLegend628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 IsotypeBioLegend400129
BV510 anti-human CD45BioLegend304036
CD66b FITC isotypeBD Biosciences555748
CompBead Plus Compensation BeadsBD Biosciences560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mLFisher Scientific09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mLFisher Scientific09-761-10
CS&T beadsBD Biosciences655051
DTTFisher ScientificBP172-5
FITC anti-human CD66bGeneTexGTX75907
Fixable Viability StainBD Biosciences564406
FlowCheckBeckman CoulterA69183
FlowSetBeckman CoulterA69184
HBSSFisher Scientific14-175-095
NACSigma-AldrichA9165
NIST Beads, 05 μMPolysciences64080
NIST Beads, 20 μMPolysciences64160
NIST Beads, 30 μMPolysciences64170
PE anti-human CD45BioLegend304039
PE-CF594 anti-human EpCAMBD Biosciences565399
PE-CF594 CD206/EpCAM IsotypeBD Biosciences562292
PE-CR594 anti-human CD206BD Biosciences564063
Sodium citrate dihydrateEMDSX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%Fisher Scientific15250061

Referências

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