Análise de escarro controlada pela qualidade por citometria de fluxo

Resumo

Este protocolo descreve um método eficiente para dissociar a escarro em uma única suspensão celular e a subsequente caracterização de subconjuntos celulares em plataformas citométricas de fluxo padrão.

Resumo

O sputum, amplamente utilizado para estudar o conteúdo celular e outras características microambientais para entender a saúde do pulmão, é tradicionalmente analisado por meio de metodologias baseadas em citologia. Sua utilidade é limitada porque a leitura dos slides é demorada e requer pessoal altamente especializado. Além disso, detritos extensos e a presença de muitas células epiteliais escamosas (SECs), ou células da bochecha, muitas vezes torna uma amostra inadequada para o diagnóstico. Em contraste, a citometria de fluxo permite fenotipagem de alto rendimento de populações celulares, excluindo simultaneamente detritos e SECs.

O protocolo aqui apresentado descreve um método eficiente para dissociar a escarro em uma única suspensão celular, mancha de anticorpos e fixar populações celulares, e adquirir amostras em uma plataforma citométrica de fluxo. Uma estratégia de gating que descreve a exclusão de detritos, células mortas (incluindo SECs) e doublets de células é apresentada aqui. Além disso, este trabalho também explica como analisar células de escarro única viáveis baseadas em um aglomerado de diferenciação (CD)45 populações positivas e negativas para caracterizar subconjuntos de linhagem hematopoiética e epitelial. Uma medida de controle de qualidade também é fornecida pela identificação de macrófagos específicos do pulmão como evidência de que uma amostra é derivada do pulmão e não é saliva. Finalmente, foi demonstrado que este método pode ser aplicado a diferentes plataformas citométricas, fornecendo perfis de escarro do mesmo paciente analisado em três citómetros de fluxo; Navios EX, LSR II e Lyric. Além disso, este protocolo pode ser modificado para incluir marcadores celulares adicionais de interesse. Um método para analisar uma amostra de escarro inteira em uma plataforma citométrica de fluxo é apresentado aqui que torna a escarro favorável para o desenvolvimento de diagnósticos de alta produtividade de doenças pulmonares.

Introdução

Os avanços técnicos no hardware e software de citómetros de fluxo permitiram identificar muitas populações celulares distintas simultaneamente1,2,3,4. A utilização do citómetro de fluxo na pesquisa de células hematopoiéticas, por exemplo, levou a uma compreensão muito melhor do sistema ^{imunológico2} e da hierarquia celular do sistema hematopoiético5, bem como a distinção diagnóstica de uma infinidade de diferentes cânceres sanguíneos6,7,8.

Protocolo

Todas as etapas do processamento de escarro são realizadas em um gabinete de segurança biológica com equipamentos de proteção individual adequados.

1. Preparação do reagente antes de iniciar a dissociação do escarro

1. Descongele 1% Paraformaldeído (PFA), 25 mL por amostra no gelo e mantenha frio até o uso.
   ATENÇÃO: O PFA é tóxico por inalação e contato com a pele. Prepare o fixador de acordo com as instruções do fabricante e congele a -20 °C em alíquotas de 25 mL até usar.
2. Aproxime o peso da amostra e descongele 0,1% Dithiothreitol (DTT) para a etapa 2.2 e leve-a a 37 °C. (As alíquotas de DTT devem ser armazenadas a -2....

Resultados

Este protocolo foi desenvolvido com um ambiente de laboratório clínico em mente. O foco durante o desenvolvimento do protocolo foi a simplicidade, eficiência e reprodutibilidade. Verificou-se que o passo mais demorado no processamento da escarro era contar as células. Portanto, o protocolo é configurado de tal forma que o processamento de escarro e rotulagem celular possam ser realizados independentemente da contagem celular sem perda de tempo. Uma contagem de células precisa, que ainda é necessária para diluir a.......

Discussão

O conteúdo celular da escarro inclui uma grande variedade de células amplas, muitas vezes acompanhadas por muitos ^detritos37. Além disso, a análise da escarro requer um controle de qualidade que confirme que a amostra é coletada do pulmão em vez da cavidade ^oral38. Portanto, não é tão simples analisar a escarro por citometria de fluxo como é para o sangue, por exemplo, que libera uma suspensão celular muito mais limpa e homogênea. Este protocolo abordou todas es.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061