JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول سير عمل محسنا لعزل النوى والفحص المجهري الهيكلي الفائق الدقة لتقييم النيوكليوبورينات الفردية داخل النيوكليوبلازم و NPCs في الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات والأنسجة البشرية بعد الوفاة.

Abstract

مركب المسام النووية (NPC) عبارة عن بنية جزيئية معقدة تتكون من نسخ متعددة من ~ 30 بروتين نيوكليوبورين مختلف (Nups). بشكل جماعي ، تعمل هذه النوبات على تنظيم الجينوم والتعبير الجيني والنقل النووي للكريات (NCT). في الآونة الأخيرة ، تم تحديد العيوب في NCT والتعديلات في Nups المحددة على أنها أمراض مبكرة وبارزة في العديد من الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك التصلب الجانبي الضموري (ALS) ، ومرض الزهايمر (AD) / الخرف الجبهي الصدغي (FTD) ، ومرض هنتنغتون (HD). يسمح التقدم في كل من المجهر الضوئي والإلكترون بإجراء فحص شامل للهياكل الخلوية الفرعية ، بما في ذلك NPC ومكوناته ، مع زيادة الدقة والدقة. من بين التقنيات الشائعة الاستخدام ، يوفر الفحص المجهري للإضاءة الهيكلية فائقة الدقة (SIM) فرصة لا مثيل لها لدراسة توطين وتعبير Nups الفردية باستخدام استراتيجيات وضع العلامات التقليدية القائمة على الأجسام المضادة. يتيح عزل النوى قبل بطاقة SIM تصور بروتينات Nup الفردية داخل NPC والنيوكليوبلازم في مساحة ثلاثية الأبعاد معاد بناؤها بالكامل ودقة. يصف هذا البروتوكول إجراء لعزل النوى وبطاقة SIM لتقييم تعبير Nup وتوزيعه في خلايا الجهاز العصبي المركزي البشري المشتقة من iPSC وأنسجة ما بعد الوفاة.

Introduction

يتزايد انتشار الأمراض التنكسية العصبية المرتبطة بالعمر مع تقدم السكان في العمر1. في حين أن الأسس الجينية والسمات المميزة المرضية مميزة بشكل جيد ، فإن الأحداث الجزيئية الدقيقة التي تؤدي إلى إصابة الخلايا العصبية لا تزال غير مفهومة جيدا2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. في الآونة الأخيرة ، أ ز4C2 تم تحديد تمدد تكرار سداسي النوكليوتيدات في الإنترون الأول من الجين C9orf72 باعتباره السبب الوراثي الأكثر شيوعا للأمراض التنكسية العصبية ذات الصلة بالتصلب الجانبي الضموري (ALS) والخرف الجبهي الصدغي (FTD)13,14. تدعم العديد من الدراسات الآن دورا مركزيا للاضطرابات في آلية النقل النووي ، بما في ذلك مجمعات المسام النووية (NPCs) ومستقبلات النقل النووي (NTRs ، karyopherins) ، باعتبارها مسببة ل C9orf72 ALS15,16. في الخلايا غير المنقسمة داخل دماغ الفئران ، تكون نيوكليوبورينات السقالات (Nups) طويلة الأمد للغاية. نتيجة لذلك ، تم الإبلاغ عن تغييرات في الشخصيات غير القابلة للعب و NCT أثناء الشيخوخة17,18,19,20. علاوة على ذلك ، ترتبط بعض النيوكليوبورينات أو الترانسالتينات ، عند تحورها ، بأمراض عصبية معينة21,22. على سبيل المثال ، تم ربط الطفرات في Nup62 بالنخر العقدي الثنائي الطفولي (IBSN) ، وهو اضطراب عصبي يؤثر على النواة المذنبة والبوتامين23; كانت الطفرات في Gle1 متورطة في مرض الخلايا العصبية الحركية الجنينية متلازمة التقلص الخلقي البشري المميت -1 (LCCS1)24; والطفرات في علاء الدين مسببة لمتلازمة Triple-A25. تتفاقم التغيرات في NCT الوظيفية في الأمراض التنكسية العصبية المرتبطة بالعمر مثل ALS ومرض هنتنغتون (HD) ومرض الزهايمر (AD)16,26,27,28,29,30,31. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن Nups و NTRs محددة كمعدلات للسمية بوساطة C9orf72 في Drosophila عين28 أو تعديل حالة تجميع البروتينات المرتبطة بالأمراض كيميائيا حيويا مثل FUS و tau27,32,33,34. بشكل جماعي ، تشير هذه الدراسات المبكرة إلى أن NCT المتغير قد يكون سمة مرضية أولية ومبكرة لمرض التصلب الجانبي الضموري و FTD. اقترحت الدراسات التي أجريت في نظام النموذج القائم على الإفراط في التعبير أن التوطين الخاطئ ل Nups و karyopherins معين قد يؤثر على NCT16,35,36,37,38. ومع ذلك ، فإن دراسات علم الأمراض هذه لا تربط في الواقع التراكمات السيتوبلازمية لبروتينات NPC بعيوب في بنية أو وظيفة NPC. على سبيل المثال ، قد يعكس هذا المرض ببساطة عدم تنظيم التجمعات السيتوبلازمية لبروتينات Nup مع تأثير ضئيل على تكوين NPC ووظيفته. في المقابل ، توضح دراسة حديثة تستخدم الفحص المجهري الهيكلي للإضاءة فائقة الدقة (SIM) ظهور إصابة كبيرة في NPC نفسها تتميز بانخفاض مستويات Nup المحددة داخل النيوكليوبلازم و NPCs للخلايا العصبية البشرية C9orf72 ALS / FTD مما يؤدي في النهاية إلى تغيير وظيفة NPC كحدث بدء مبكر في شلالات الأمراض المسببة للأمراض15.

يخضع مرور الجزيئات الكبيرة بين النواة والسيتوبلازم لمركب المسام النووية (NPC). NPC عبارة عن مركب جزيئي كبير مضمن في الغلاف النووي يتكون من نسخ متعددة من 30 بروتين نيوكليوبورين (Nups) 39،40،41. على الرغم من أن القياس المتكافئ يختلف بين أنواع الخلايا42،43،44 ، إلا أن الحفاظ على التركيب الكلي لأجهزة الكمبيوتر غير القابلة للعب أمر بالغ الأهمية ل NCT ، وتنظيم الجينوم ، والجدوى الخلويةالإجمالية 39،41،45،46. نتيجة لذلك ، من المرجح أن يؤثر تغيير تكوين NPC والعيوب اللاحقة في النقل الوظيفي على عدد لا يحصى من الوظائف الخلوية النهائية. يتم تنظيم مكونات Nup ل NPC بشكل كبير في مجمعات فرعية متعددة ، بما في ذلك الحلقة السيتوبلازمية والخيوط ، والقناة المركزية ، والحلقة الخارجية ، والحلقة الداخلية ، والحلقة الغشائية ، والسلة النووية. بشكل جماعي ، تقوم سقالة Nups من الحلقات الداخلية والخارجية والغشائية بتثبيت الشخصيات غير القابلة للعب داخل الغلاف النووي وتوفر نقاط ربط ل Nups من الحلقة السيتوبلازمية والقناة المركزية والسلة النووية. في حين أن الجزيئات الصغيرة (<40-60 كيلو دالتون) يمكن أن تنتشر بشكل سلبي من خلال NPC ، يتم تسهيل النقل النشط للشحنات الكبيرة من خلال التفاعلات بين مستقبلات النقل النووي (NTRs ، karyopherins) و FG Nups للخيوط السيتوبلازمية والقناة المركزية والسلة النووية39،40،41،45. أيضا ، يمكن أن تعمل حفنة من Nups أيضا خارج NPC ، داخل النيوكليوبلازم ، لتنظيم التعبير الجيني46،47.

بالنظر إلى أن البعد الجانبي لشخصية شخصية واحدة يبلغ حوالي 100-120 نانومتر40 ، فإن الفحص المجهري القياسي واسع المجال أو متحد البؤر غير كاف لحل الشخصيات غير القابلة للعبالفردية 48. غالبا ما تستخدم تقنيات المجهر الإلكتروني (EM) مثل TEM أو SEM لتقييم الهيكل العام لغير القابلة للعب39،40. على الرغم من مزايا هذه التقنيات لحل البنية التحتية لأجهزة الكمبيوتر غير القابلة للعب ، إلا أنها أقل استخداما لتقييم وجود بروتينات Nup الفردية داخل NPC. لا تسمح القيود التقنية للجمع بين الأجسام المضادة أو الملصقات القائمة على العلامات مع هذه التقنيات الحديثة ، TEM و SEM ، دائما بإجراء تقييم دقيق وموثوق للأفراد النيوبرازيين أنفسهم داخل NPCs أو النيوكليوبلازم. علاوة على ذلك ، يمكن أن تكون هذه التقنيات صعبة من الناحية الفنية ولم يتم الوصول إليها على نطاق واسع لجميع الباحثين. ومع ذلك ، فإن التطورات الحديثة في المجهر الضوئي والفلوري قد زادت من إمكانية الوصول إلى تقنيات التصوير فائقة الدقة. على وجه التحديد ، توفر SIM فرصة لا مثيل لها لتصوير Nups الفردية بدقة تقترب من الأبعاد الجانبية لشخصية شخصيةواحدة 40،48،49،50،51. على عكس الأساليب الأخرى فائقة الدقة مثل الفحص المجهري لإعادة البناء البصري العشوائي (STORM) واستنفاد الانبعاث المحفز (STED) ، فإن SIM متوافقة مع التلوين المناعي التقليدي القائم على الأجسامالمضادة 49. وبالتالي ، تسمح SIM بإجراء تحليل شامل لجميع Nups التي يتوفر لها جسم مضاد محدد من Nup. توفر القدرة على أخذ عينات وتصوير العديد من Nups المختلفة في نفس المستحضر مزايا كبيرة لطرق التصوير الأخرى عند مسح العديد من البروتينات التي تتكون منها NPC. يوضح الإجراء التالي تفاصيل بروتوكول محسن لتقييم مكونات Nup الفردية ل NPC باستخدام النوى المعزولة من الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة (iPSC) (iPSNs) وأنسجة الجهاز العصبي المركزي البشري (CNS) بعد الوفاة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع عينات الدم لتوليد iPSC ومجموعات الأنسجة التي تم تشريحها من قبل Johns Hopkins IRB مع إشراف أخلاقيات جونز هوبكنز. جميع معلومات المريض متوافقة مع HIPPA. يلتزم البروتوكول التالي بجميع إجراءات السلامة البيولوجية في جامعة جونز هوبكنز.

1. تحضير الشرائح للتلوين المناعي والتصوير

  1. ضع شريحة مجهر زجاجي موجب الشحنة في قمع خلوي فارغ وارسم دائرة بقلم حاجز مسعور لتحديد منطقة لإيداع النوى.
  2. أضف 50 ميكرولتر من محلول الكولاجين 1 مجم / مل (مخفف في 1x PBS) إلى وسط الدائرة المرسومة في الخطوة 1.1 واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  3. قم بشفط محلول الكولاجين واترك الشرائح تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة تقريبا.

2. تحضير عازلة التحلل وتدرجات السكروز

  1. تحضير محلول التحلل المخزن المؤقت ومحاليل التدرج السكروز وفقا لبروتوكول مجموعة عزل النوى.
    1. لكل عينة ، قم بإعداد أنبوب مخروطي 50 مل من المخزن المؤقت للتحلل عن طريق الجمع بين 11 مل من مخزن التحلل المزود ، و 110 ميكرولتر من محلول Triton X-100 المزود بنسبة 10٪ ، و 11 ميكرولتر من 1 M DTT المحضر حديثا أو المذاب (Dithiothreitol).
    2. لكل عينة ، استخدم أنبوبا مخروطيا سعة 50 مل لتحضير محلول وسادة سكروز 1.85 م عن طريق الجمع بين 27.75 مل من محلول وسادة السكروز 2 M المرفق ، و 2.25 مل من عازلة وسادة السكروز المرفقة ، و 30 ميكرولتر من 1 M DTT المحضر أو المذاب حديثا.
      ملاحظة: يعتبر محلول وسادة السكروز 1.85 M مثاليا ل iPSNs وأنسجة الجهاز العصبي المركزي البشري بعد الوفاة ، ولكن قم بضبطه لأنواع الخلايا الأخرى أو عينات الأنسجة. تم مؤخرا نشر تفاصيل إضافية لخلايا HEK293 ، والخلايا النجمية المشتقة من iPSC ، وإثراء نوى الخلايا قليلة التغصن من أنسجة الجهاز العصبي المركزي بعد الوفاة15.
  2. امزج بلطف محاليل تحلل المخزن المؤقت ووسادة السكروز عن طريق قلب الأنابيب المخروطية وتخزينها على الثلج.

3. تحلل iPSNs وأنسجة الجهاز العصبي المركزي البشري بعد الوفاة

  1. قبل الشروع في التحلل ، ضع دوار الطرد المركزي الفائق (بدون حاملات العينات) في جهاز الطرد المركزي الفائق واتركه يبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
  2. تحلل iPSNs.
    ملاحظة: تختلف بروتوكولات التحلل ل iPSNs وأنسجة الجهاز العصبي المركزي البشري بعد الوفاة. اتبع البروتوكول الخاص بنوع العينة المحدد أدناه (الخطوة 3.2: iPSNs ، الخطوة 3.3: أنسجة الجهاز العصبي المركزي البشري بعد الوفاة).
    1. قم بإزالة iPSNs من الحاضنة وشفط الوسائط. اشطفها لفترة وجيزة باستخدام 1x PBS وأضف المخزن المؤقت للتحلل مباشرة إلى البئر أو اللوحة.
      ملاحظة: احرص على شطف iPSNs بشكل كاف بكمية كافية من 1x PBS لإزالة الحطام والخلايا الميتة. سيختلف حجم المخزن المؤقت للتحلل المراد إضافته إلى لوحات iPSN. يرجى الرجوع إلى الجدول 1. تأكد من أن المادة الأولية هي >2.5 مليون iPSN.
    2. كشط iPSNs مع مكشطة خلية ونقلها إلى المخزن المؤقت للتحلل المتبقي في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
    3. غطاء كل أنبوب مخروطي ودوامة العينات لمدة 20 ثانية لتسهيل تحلل iPSN.
    4. دع العينات تجلس على الجليد لمدة 1-2 دقيقة قبل المتابعة.
  3. تحلل أنسجة الجهاز العصبي المركزي البشري بعد الوفاة.
    1. قم بوزن ~ 100 مجم من أنسجة الجهاز العصبي المركزي البشري المجمدة بعد الوفاة عن طريق القطع بشفرة حلاقة في طبق بتري يوضع على طبقة من الثلج الجاف. تأكد من العمل على سطح محاط بوسادات يمكن التخلص منها لتجنب تلوث الأنسجة المحلية. انتبه إلى المادة الرمادية المحددة مقابل تشريح المادة البيضاء (على سبيل المثال ، الرف القشري مقابل المادة البيضاء الأساسية) المرئية في وقت تشريح الأنسجة.
      ملاحظة: ارتد معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك الملابس والقفازات الواقية للعين عند التعامل مع عينات الأنسجة البشرية المجمدة بعد الوفاة. يمكن أيضا إكمال هذه الخطوة في وقت مبكر وتخزين حصص الأنسجة عند -80 درجة مئوية. 50 مجم هي كمية كافية لعزل النوى. ومع ذلك ، فإن أكثر من 100 مجم من الأنسجة غالبا ما ينتج عنه عزل غير كامل للنوى ، كما يتضح من وجود السيتوبلازم السليم المحيط ببعض النوى.
    2. قم بإعداد الخالط Dounce عن طريق التنظيف والشطف جيدا بالماء المقطر. قم بتبريد الخالط بوضعه على الثلج.
    3. أضف 100 مجم من الأنسجة إلى الخالط Dounce النظيف حديثا ومغسول ومبرد (على الثلج) يحتوي على 2 مل من محلول التحلل المحضر.
    4. تجانس في الخالط Dounce باستخدام الإجراء القياسي على الجليد.
      ملاحظة: عادة ما تكون 10-20 ضربة لكل مدقة كافية للتحرك عبر العينة دون مقاومة.
    5. نقل 2 مل من تجانس الدماغ البشري بعد الوفاة إلى 9 مل المتبقية من محلول التحلل في الأنابيب المخروطية.
    6. دوامة بقوة لمدة 30 ثانية واتركها على الجليد لمدة 5 دقائق لتسهيل التحلل.

4. عزل النوى من iPSNs وأنسجة الجهاز العصبي المركزي البشري بعد الوفاة

  1. طبقة 10 مل من محلول وسادة السكروز 1.85 M (مصنوع في الخطوة 2.1.2) في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الفائق وإضافة 18 مل من محلول وسادة السكروز 1.85 M إلى كل محللة.
  2. امزج محلول وسادة الليزات / السكروز برفق (مدمجا في الخطوة 4.1) عن طريق قلب الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.
  3. أضف ببطء 28 مل من مزيج محلول وسادة المحلل / السكروز إلى الجزء العلوي من محلول وسادة السكروز 10 مل من 1.85 M في أنبوب الطرد المركزي الفائق (من الخطوة 4.1).
    ملاحظة: يوجد إجمالي 29 مل من مزيج محلول وسادة المحلل / السكروز في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل (الخطوات 4.1-4.2). اترك 1 مل من مزيج محلول وسادة المحلل / السكروز في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل. وهذا يضمن سحب ماصات دقيق ومتسق بين جميع العينات بسبب لزوجة محلول وسادة السكروز.
  4. ضع أنابيب الطرد المركزي الفائق في الحوامل وأضف محلول وسادة سكروز إضافي بطول 1.85 متر (مصنوع في الخطوة 2.1.2) حسب الحاجة لموازنة العينات.
  5. ضع حاملي العينات في الدوار في جهاز الطرد المركزي الفائق المبرد وقم بالدوران عند 30,000 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة.
  6. قم بإزالة أنابيب الطرد المركزي الفائق من حاملات العينات وتخلص من المواد الطافية. ستكون النوى مرئية على شكل كريات على الجوانب السفلية لأنبوب الطرد المركزي الفائق.
  7. أعد تعليق كريات النوى في 1 مل من المخزن المؤقت لتخزين النوى المزود عن طريق الدوامة ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
  8. جهاز الطرد المركزي أنابيب الطرد المركزي الدقيقة عند 2,500 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  9. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق النوى عن طريق الدوامة في 1 مل من المخزن المؤقت لتخزين النوى المزودة.
  10. استمر في التلوين المناعي أو قم بتخزين النوى عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تخزين النوى عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر وإخضاعها لدورتين للتجميد / الذوبان قبل المساس بالسلامة الهيكلية.

5. تلبوخ مناعي للنوى المعزولة

  1. خذ 10 ميكرولتر من تعليق النوى واعدها باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي.
  2. قم بتجميع الشرائح المحضرة (من الخطوة 1.3) في القمع الخلوي.
  3. لكل قمع خلوي ، طبقة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتخزين النوى الطازجة و ~ 100,000 نواة.
  4. قم بتدوير النوى برفق على الشرائح عن طريق وضع القمع الخلوي في تدور الخلوي والطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 100 × جم.
  5. قم بفك القمع الخلوي وأضف على الفور ~ 100 ميكرولتر من 4٪ PFA (بارافورمالدهايد) إلى الشرائح واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن أيضا تثبيت النوى بالميثانول. استخدم طريقة التثبيت المناسبة لكل جسم مضاد. في حالة استخدام الميثانول ، تخطي خطوة النفاذية (5.7). القمع الخلوي يستخدم مرة واحدة. تجاهلهم في هذه المرحلة.
  6. اغسل النوى 3x لمدة 5 دقائق باستخدام 1x PBS.
  7. تخلل النوى بنسبة 0.1٪ Triton X-100 في 1x PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. قم بسد النوى في محلول الكتلة (مصل الماعز أو الحمار بنسبة 10٪ في 1x PBS) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. احتضان النوى بالأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الكتلة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  10. اغسل النوى 3x لمدة 5 دقائق باستخدام 1x PBS.
  11. احتضان النوى بالأجسام المضادة الثانوية المخففة في محلول كتلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يفضل استخدام الأجسام المضادة الثانوية Alexa Fluor 488 و 568 و 647.
  12. اغسل النوى 3x لمدة 5 دقائق باستخدام 1x PBS.
  13. اختياري: احتضن النوى لمدة 5 دقائق باستخدام DAPI أو Hoechst متبوعا بغسلتين إضافيتين لمدة 5 دقائق باستخدام 1x PBS.
  14. امسك مسحا خاليا من النسالة على حافة الدائرة التي تحتوي على نوى لإزالة آخر غسول PBS تماما.
  15. أضف قطرة واحدة (~ 10 ميكرولتر) من وسائط التثبيت المضادة للبهتان ذات التثبيت الصلب (بدون DAPI) إلى كل شريحة وضع أغطية مربعة عالية التسامح مقاس 18 مم × 18 مم برفق على كل شريحة.
    ملاحظة: عند استخدام وسائط مثبتة بصلب، لا يكون الختم المنزلق ضروريا إذا تم تصوير الشرائح ضمن إطار زمني مناسب. عادة ما يظل النشاط المناعي للنوب مستقرا على الشرائح غير المغلقة المخزنة عند 4 درجات مئوية لمدة ~ 6 أشهر. ومع ذلك ، يمكن إغلاق حواف الغطاء بطبقة رقيقة من طلاء الأظافر إذا تم استخدام وسائط مبللة أو للتخزين لفترات طويلة.
  16. حافظ على الشرائح محمية من الضوء واتركها تشفى طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
  17. يمكن تصوير النوى عن طريق الفحص المجهري للإضاءة الهيكلية فائقة الدقة (SIM).
    ملاحظة: تقوم كل من Zeiss و Nikon و GE Healthcare بتصنيع مجاهر SIM. اتبع البروتوكولات الخاصة بالنظام للحصول على الصور ومعالجتها. استخدم معلمات التصوير (طاقة الليزر ، ومجموعات المرشحات ، ووقت التعرض) المناسبة لكل Nup والفلوروفور. عند التصوير ، تجنب حواف الدائرة (من الخطوة 1.1) حيث يتم تسطيح هذه النوى عادة وانتشارها نتيجة لخطوة الطرد المركزي (5.4). يمكن أن تخضع الصور المفككة والمعالجة بالكامل لعدد من التحليلات ، بما في ذلك الكشف عن البقع وقياسات الحجم باستخدام وحدات التحليل ثلاثية الأبعاد القياسية في برنامج تحليلات الصور FIJI أو Imaris. تم نشر تفاصيل إضافية حول طرق التحليلمؤخرا 15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لفحص NPC والتوزيع النووي والتعبير عن POM121 في نوى الخلايا العصبية البشرية ، تم تمييز التحكم و C9orf72 iPSNs كما هو موضحسابقا 15. تم تحلل القشرة الحركية البشرية بعد الوفاة واليوم 32 iPSNs وتعرضها لعزل النوى والتلوين المناعي كما هو موضح أعلاه. تم تصوير النوى المعزولة الإيجا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

بالنظر إلى التحديد الأخير لأوجه القصور في NCT كظاهرة مبكرة وبارزة في الأمراض التنكسية العصبيةالمتعددة 16،27،28،30،31 ، هناك حاجة ماسة لفحص الآلية التي يحدث بها هذا المرض بدقة. نظرا لأن NP...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم توفير أنسجة الجهاز العصبي المركزي البشري بعد الوفاة من قبل بنك تشريح الجثة الجانبي الضموري بجامعة جونز هوبكنز ونواة الأنسجة المستهدفة بعد الوفاة. تم دعم هذا العمل من قبل زمالة ALSA Milton Safenowitz لما بعد الدكتوراه (ANC) ، بالإضافة إلى تمويل من المعاهد الوطنية للصحة - NINDS ، ووزارة الدفاع ، وجمعية ALS ، وجمعية ضمور العضلات ، و F Prime ، ومركز روبرت باكارد لأبحاث ALS ، وبرنامج ALS ، ومبادرة تشان زوكربيرج.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL conical tubesFisher Scientific14-959-49A
Beckman UltracentrifugeBeckman Coulter
Cell ScrapersSarstedt83.183
CollagenAdvanced Biomatrix5005
CoverslipsMatTekPCS-170-1818
CytofunnelThermo Fisher ScientificA78710020
Cytospin 4Fisher ScientificA78300003
Dounce HomogenizersDWK Life Sciences357542
DTTSigma AldrichD0632
Eppendorf tubesFisher Scientific05-408-129
Goat Anti-Chicken Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21449
Goat Anti-Mouse Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11029
Goat Anti-Mouse Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11031
Goat Anti-Mouse Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21236
Goat Anti-Rabbit Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11034
Goat Anti-Rabbit Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11036
Goat Anti-Rabbit Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21245
Goat Anti-Rat Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11006
Goat Anti-Rat Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11077
Goat Anti-Rat Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21247
HemacytometerFisher Scientific267110
Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Normal Goat SerumVector LabsS-1000
Nuclei PURE Prep Nuclei Isolation KitSigma AldrichNUC201Contains Lysis Buffer, 10% Triton X-100, 2 M Sucrose Gradient, Sucrose Cushion Solution, and Nuclei Storage Buffer; Referenced in protocol as "nuclei isolation kit"
PBSThermo Fisher Scientific10010023
PFAElectron Microscopy Sciences15714-S
Prolong Gold AntifadeInvitrogenP36930Referenced in protocol as "hard mount antifade mounting media"
SW 32 Ti Ultracentrifuge RotorBeckman Coulter369694Referenced in protocol as "ultracentrifuge rotor"
Triton X-100Sigma AldrichT9284
Trypan BlueThermo Fisher Scientific15-250-061
Ultracentrifuge TubesBeckman Coulter344058
Nucleoporin Primary AntibodiesPrimary antibodies suitable for immunofluorescent detection of invidual nucleoporins are available from multiple companies 

References

  1. Hou, Y., et al. Ageing as a risk factor for neurodegenerative disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (10), 565-581 (2019).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Bang, J., Spina, S., Miller, B. L. Frontotemporal dementia. Lancet. 386 (10004), 1672-1682 (2015).
  4. Blauwendraat, C., Nalls, M. A., Singleton, A. B. The genetic architecture of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 19 (2), 170-178 (2020).
  5. Cacace, R., Sleegers, K., Van Broeckhoven, C. Molecular genetics of early-onset Alzheimer's disease revisited. Alzheimer's & Dementia. 12 (6), 733-748 (2016).
  6. Di Resta, C., Ferrari, M. New molecular approaches to Alzheimer's disease. Clinical Biochemistry. 72, 81-86 (2019).
  7. Karch, C. M., Cruchaga, C., Goate, A. M. Alzheimer's disease genetics: from the bench to the clinic. Neuron. 83 (1), 11-26 (2014).
  8. Kovacs, G. G. Molecular pathology of neurodegenerative diseases: principles and practice. Journal of Clinical Pathology. 72 (11), 725-735 (2019).
  9. McColgan, P., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: a clinical review. European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).
  10. Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. The Lancet. Neurology. 10 (1), 83-98 (2011).
  11. Dugger, B. N., Dickson, D. W. Pathology of neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 028035(2017).
  12. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
  13. DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72 (2), 245-256 (2011).
  14. Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72 (2), 257-268 (2011).
  15. Coyne, A. N., et al. G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD. Neuron. 107 (4), 1124-1140 (2020).
  16. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  17. D'Angelo, M. A., Raices, M., Panowski, S. H., Hetzer, M. W. Age-dependent deterioration of nuclear pore complexes causes a loss of nuclear integrity in postmitotic cells. Cell. 136 (2), 284-295 (2009).
  18. Hetzer, M. W. The role of the nuclear pore complex in aging of post-mitotic cells. Aging (Albany NY). 2 (2), 74-75 (2010).
  19. Savas, J. N., Toyama, B. H., Xu, T., Yates, J. R., Hetzer, M. W. Extremely long-lived nuclear pore proteins in the rat brain. Science. 335 (6071), 942(2012).
  20. Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
  21. Nofrini, V., Di Giacomo, D., Mecucci, C. Nucleoporin genes in human diseases. European Journal of Human Genetics. 24 (10), 1388-1395 (2016).
  22. Sakuma, S., D'Angelo, M. A. The roles of the nuclear pore complex in cellular dysfunction, aging and disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 68, 72-84 (2017).
  23. Basel-Vanagaite, L., et al. Mutated nup62 causes autosomal recessive infantile bilateral striatal necrosis. Annals of Neurology. 60 (2), 214-222 (2006).
  24. Nousiainen, H. O., et al. Mutations in mRNA export mediator GLE1 result in a fetal motoneuron disease. Nature Genetics. 40 (2), 155-157 (2008).
  25. Cronshaw, J. M., Matunis, M. J. The nuclear pore complex: disease associations and functional correlations. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15 (1), 34-39 (2004).
  26. Chou, C. C., et al. TDP-43 pathology disrupts nuclear pore complexes and nucleocytoplasmic transport in ALS/FTD. Nature Neuroscience. 21 (2), 228-239 (2018).
  27. Eftekharzadeh, B., et al. Tau protein disrupts nucleocytoplasmic transport in Alzheimer's disease. Neuron. 99 (5), 925-940 (2018).
  28. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  29. Gasset-Rosa, F., et al. Polyglutamine-expanded huntingtin exacerbates age-related disruption of nuclear integrity and nucleocytoplasmic transport. Neuron. 94 (1), 48-57 (2017).
  30. Grima, J. C., et al. Mutant huntingtin disrupts the nuclear pore complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
  31. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  32. Guo, L., et al. Nuclear-import receptors reverse aberrant phase transitions of RNA-binding proteins with prion-like domains. Cell. 173 (3), 677-692 (2018).
  33. Hofweber, M., et al. Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation. Cell. 173 (3), 706-719 (2018).
  34. Yoshizawa, T., et al. Nuclear Import Receptor Inhibits Phase Separation of FUS through Binding to Multiple Sites. Cell. 173 (3), 693-705 (2018).
  35. Chew, J., et al. Aberrant deposition of stress granule-resident proteins linked to C9orf72-associated TDP-43 proteinopathy. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 9(2019).
  36. Zhang, Y. J., et al. Poly(GR) impairs protein translation and stress granule dynamics in C9orf72-associated frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis. Nat Medicine. 24 (8), 1136-1142 (2018).
  37. Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nature Neuroscience. 19 (5), 668-677 (2016).
  38. Zhang, Y. J., et al. Heterochromatin anomalies and double-stranded RNA accumulation underlie C9orf72 poly(PR) toxicity. Science. 363 (6428), (2019).
  39. Beck, M., Hurt, E. The nuclear pore complex: understanding its function through structural insight. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (2), 73-89 (2017).
  40. Lin, D. H., Hoelz, A. The structure of the nuclear pore complex (an update). Annual Review of Biochemistry. 88, 725-783 (2019).
  41. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissue-specific and developmental functions. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (11), 687-699 (2012).
  42. Kinoshita, Y., Kalir, T., Dottino, P., Kohtz, D. S. Nuclear distributions of NUP62 and NUP214 suggest architectural diversity and spatial patterning among nuclear pore complexes. PLoS One. 7 (4), 36137(2012).
  43. Ori, A., et al. Cell type-specific nuclear pores: a case in point for context-dependent stoichiometry of molecular machines. Molecular Systems Biology. 9, 648(2013).
  44. Rajoo, S., Vallotton, P., Onischenko, E., Weis, K. Stoichiometry and compositional plasticity of the yeast nuclear pore complex revealed by quantitative fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), 3969-3977 (2018).
  45. Li, C., Goryaynov, A., Yang, W. The selective permeability barrier in the nuclear pore complex. Nucleus. 7 (5), 430-446 (2016).
  46. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complexes and regulation of gene expression. Current Opinion in Cell Biology. 46, 26-32 (2017).
  47. Pascual-Garcia, P., Capelson, M. Nuclear pores in genome architecture and enhancer function. Current Opinion in Cell Biology. 58, 126-133 (2019).
  48. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  49. Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nature Neuroscience. 16 (7), 790-797 (2013).
  50. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  51. Wu, Y., Shroff, H. Faster, sharper, and deeper: structured illumination microscopy for biological imaging. Nature Methods. 15 (12), 1011-1019 (2018).
  52. Hampoelz, B., et al. Pre-assembled nuclear pores insert into the nuclear envelope during early development. Cell. 166 (3), 664-678 (2016).
  53. Hampoelz, B., et al. Nuclear pores assemble from nucleoporin condensates during oogenesis. Cell. 179 (3), 671-686 (2019).
  54. Agote-Aran, A., et al. Spatial control of nucleoporin condensation by fragile X-related proteins. The EMBO Journal. 39 (20), 104467(2020).
  55. Colombi, P., Webster, B. M., Fröhlich, F., Lusk, C. P. The transmission of nuclear pore complexes to daughter cells requires a cytoplasmic pool of Nsp1. The Journal of Cell Biology. 203 (2), 215-232 (2013).
  56. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  57. Löschberger, A., Franke, C., Krohne, G., van de Linde, S., Sauer, M. Correlative super-resolution fluorescence and electron microscopy of the nuclear pore complex with molecular resolution. Journal of Cell Science. 127, Pt 20 4351-4355 (2014).
  58. Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. Journal of Cell Science. 125, Pt 3 570-575 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

IPSC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved