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Method Article
该方案描述了用于细胞核分离和超分辨率结构照明显微镜的优化工作流程,以评估核质内的单个核孔蛋白和诱导多能干细胞衍生神经元和死后人体组织中的 NPC。
核孔复合体 (NPC) 是一种复杂的大分子结构,由 ~30 个不同核孔蛋白 (Nups) 的多个拷贝组成。总的来说,这些 Nups 的功能是调节基因组组织、基因表达和核质转运 (NCT)。最近,NCT 缺陷和特定 Nups 的改变已被确定为多种神经退行性疾病的早期和突出病症,包括肌萎缩侧索硬化症 (ALS)、阿尔茨海默病 (AD)/额颞叶痴呆 (FTD) 和亨廷顿病 (HD)。光学和电子显微镜的进步允许以更高的精度和分辨率彻底检查亚细胞结构,包括 NPC 及其 Nup 成分。在常用的技术中,超分辨率结构照明显微镜 (SIM) 为使用基于抗体的常规标记策略研究单个 Nups 的定位和表达提供了无与伦比的机会。在 SIM 之前分离细胞核,可以在完全准确地重建的 3D 空间中可视化 NPC 和核质中的单个 Nup 蛋白。该方案描述了细胞核分离和 SIM 的程序,用于评估 Nup 在人 iPSC 衍生的 CNS 细胞和死后组织中的表达和分布。
随着人口老龄化,与年龄相关的神经退行性疾病的患病率正在增加1.虽然遗传基础和病理特征已得到很好的表征,但导致神经元损伤的确切分子事件仍然知之甚少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.最近,一个 G4C2 C9orf72 基因第一个内含子中的六核苷酸重复扩增被确定为相关神经退行性疾病肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和额颞叶痴呆 (FTD) 的最常见遗传原因13,14.现在有几项研究支持核运输机制中断的核心作用,包括核孔复合体 (NPC) 和核转运受体 (NTR,核蛋白),是 C9orf72 ALS 的病因15,16.在大鼠大脑内的非分裂细胞中,支架核孔蛋白 (Nups) 的寿命极长。因此,据报道,NPC 和 NCT 在衰老过程中发生了变化17,18,19,20.此外,一些核孔蛋白或转运蛋白在发生突变时与特定的神经系统疾病有关21,22.例如,Nup62 的突变与婴儿双侧纹状体坏死 (IBSN) 有关,IBSN 是一种影响尾状核和壳核的神经系统疾病23;Gle1 突变与胎儿运动神经元病人类致死先天性挛缩综合征 1 (LCCS1) 有关24;和 Aladin 突变是 Triple-A 综合征的病因25.功能性 NCT 的改变在与年龄相关的神经退行性疾病中加剧,例如 ALS、亨廷顿病 (HD) 和阿尔茨海默病 (AD)16,26,27,28,29,30,31.此外,据报道,特异性 Nups 和 NTR 是 C9orf72 介导的毒性的修饰因子。 Drosophila 眼睛28 或生化修饰疾病相关蛋白(如 FUS 和 tau)的聚集状态27,32,33,34.总的来说,这些早期研究表明,改变的 NCT 可能是 ALS 和 FTD 的主要和早期病理特征。基于过表达的模型系统的研究表明,特异性 Nups 和核蛋白的错误定位可能会影响 NCT16,35,36,37,38.然而,这些病理学研究实际上并没有将 NPC 蛋白的细胞质积累与 NPC 的结构或功能缺陷联系起来。例如,这种病理可能只是反映了 Nup 蛋白细胞质库的失调,对 NPC 的组成和功能影响不大。相比之下,最近一项采用超分辨率结构照明显微镜 (SIM) 的研究表明,鼻咽癌本身出现了重大损伤,其特征是人类 C9orf72 ALS/FTD 神经元的核质和 NPC 内的特异性 Nup 水平降低,最终导致 NPC 功能改变,成为致病性疾病级联反应的早期起始事件15.
大分子在细胞核和细胞质之间的通过受核孔复合体 (NPC) 控制。鼻咽癌是嵌入核膜中的大分子复合物,由 30 个核孔蛋白 (Nups) 的多个拷贝组成39,40,41。尽管 Nup 化学计量学因细胞类型而异 42,43,44,但维持整体 NPC 组成对于 NCT、基因组组织和整体细胞活力至关重要 39,41,45,46。因此,NPC 组成的改变和随后的功能运输缺陷可能会影响无数的下游细胞功能。鼻咽癌的 Nup 成分高度组织成多个亚复合物,包括细胞质环和细丝、中央通道、外环、内环、跨膜环和核篮。总的来说,内环、外膜环和跨膜环的支架 Nups 将 NPC 锚定在核膜内,并为细胞质环、中央通道和核篮的 Nups 提供锚点。虽然小分子 (<40-60 kD) 可以通过 NPC 被动扩散,但核转运受体(NTR,核蛋白)与细胞质丝、中央通道和核篮的 FG Nups 之间的相互作用促进了较大货物的主动运输 39,40,41,45。此外,少数 Nups 还可以在 NPC 之外的核质内发挥作用,以调节基因表达46,47。
鉴于单个人类 NPC 的横向尺寸约为 100-120 nm40,标准宽场或共聚焦显微镜不足以分辨单个 NPC48。电子显微镜 (EM) 技术,如 TEM 或 SEM,通常用于评估 NPC的整体结构 39,40。尽管这些技术在解析 NPC 超微结构方面具有优势,但它们不太常用于评估 NPC 中单个 Nup 蛋白的存在。将抗体或基于标签的标记与这些最先进的技术(TEM 和 SEM)相结合的技术限制并不总是能够准确可靠地评估 NPC 或核质中的单个 Nups 本身。此外,这些技术在技术上可能具有挑战性,并且尚未为所有研究人员广泛使用。然而,光学和荧光显微镜的最新进展增加了超分辨率成像技术的可及性。具体来说,SIM 提供了无与伦比的机会,可以以接近一个人类 NPC40、48、49、50、51 的横向尺寸的分辨率对单个 Nups 进行成像。与随机光学重建显微镜 (STORM) 和受激发射耗竭 (STED) 等其他超分辨率方法相比,SIM 与传统的基于抗体的免疫染色兼容49。因此,SIM 允许对具有特异性 Nup 抗体的所有 Nup 进行全面分析。在研究构成 NPC 的许多蛋白质时,在同一制备物中对多个不同 Nups 进行采样和成像的能力为其他成像方法提供了显著优势。以下程序详细介绍了一种优化方案,用于使用从诱导多能干细胞 (iPSC) 衍生神经元 (iPSN) 和死后人类中枢神经系统 (CNS) 组织中分离的细胞核来评估 NPC 的单个 Nup 成分。
所有用于 iPSC 生成和尸检组织采集的血液样本均已获得约翰霍普金斯大学 IRB 的批准,并受到约翰霍普金斯大学道德监督。所有患者信息均符合 HIPPA 标准。以下方案符合约翰霍普金斯大学的所有生物安全程序。
1. 制备用于免疫染色和成像的载玻片
2. 裂解缓冲液和蔗糖梯度的制备
3. iPSN 和死后人 CNS 组织的裂解
4. 从 iPSN 和死后人 CNS 组织中分离细胞核
5. 分离细胞核的免疫染色
为了检查 POM121 在人神经元核中的 NPC 和核质分布和表达,如前所述区分对照和 C9orf72 iPSN15。死后裂解人运动皮层和第 32 天 iPSN,并如上所述进行细胞核分离和免疫染色。使用超分辨率结构照明显微镜 (Zeiss) 通过超分辨率结构照明显微镜 (SIM) 对 NeuN 阳性分离的细胞核进行成像,并使用前面描述的默认结构照明反卷积参数进行处理15...
鉴于最近发现 NCT 缺陷是多种神经退行性疾病的早期和突出现象 16,27,28,30,31,迫切需要彻底检查这种病理发生的机制。由于 NPC 及其单个 Nup 蛋白关键控制功能性 NCT39,41,因此研究神经退行性疾病模型中的 N...
作者声明没有竞争性的经济利益。
死后人类 CNS 组织由约翰霍普金斯大学 ALS 尸检库和 Target ALS 尸检组织核心提供。这项工作得到了 ALSA Milton Safenowitz 博士后奖学金 (ANC) 的支持,以及 NIH-NINDS、国防部、ALS 协会、肌肉萎缩症协会、F Prime、罗伯特帕卡德 ALS 研究中心答案 ALS 计划和 Chan Zuckerberg 倡议的资助。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
Beckman Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
Cell Scrapers | Sarstedt | 83.183 | |
Collagen | Advanced Biomatrix | 5005 | |
Coverslips | MatTek | PCS-170-1818 | |
Cytofunnel | Thermo Fisher Scientific | A78710020 | |
Cytospin 4 | Fisher Scientific | A78300003 | |
Dounce Homogenizers | DWK Life Sciences | 357542 | |
DTT | Sigma Aldrich | D0632 | |
Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Goat Anti-Chicken Alexa 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21449 | |
Goat Anti-Mouse Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
Goat Anti-Mouse Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11031 | |
Goat Anti-Mouse Alexa 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21236 | |
Goat Anti-Rabbit Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | |
Goat Anti-Rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | |
Goat Anti-Rabbit Alexa 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21245 | |
Goat Anti-Rat Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | |
Goat Anti-Rat Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11077 | |
Goat Anti-Rat Alexa 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21247 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
Nuclei PURE Prep Nuclei Isolation Kit | Sigma Aldrich | NUC201 | Contains Lysis Buffer, 10% Triton X-100, 2 M Sucrose Gradient, Sucrose Cushion Solution, and Nuclei Storage Buffer; Referenced in protocol as "nuclei isolation kit" |
PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
PFA | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
Prolong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | Referenced in protocol as "hard mount antifade mounting media" |
SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 369694 | Referenced in protocol as "ultracentrifuge rotor" |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | 15-250-061 | |
Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
Nucleoporin Primary Antibodies | Primary antibodies suitable for immunofluorescent detection of invidual nucleoporins are available from multiple companies |
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