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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit un flux de travail optimisé pour l’isolement des noyaux et la microscopie à illumination structurée à super-résolution afin d’évaluer les nucléoporines individuelles dans le nucléoplasme et les NPC dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites et les tissus humains post-mortem.

Résumé

Le complexe de pores nucléaires (NPC) est une structure macromoléculaire complexe composée de plusieurs copies de ~30 protéines nucléoporines (Nups) différentes. Collectivement, ces Nups ont pour fonction de réguler l’organisation du génome, l’expression des gènes et le transport nucléocytoplasmique (NCT). Récemment, des anomalies de la NCT et des altérations de Nups spécifiques ont été identifiées comme des pathologies précoces et importantes dans de multiples maladies neurodégénératives, notamment la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie d’Alzheimer (MA)/démence frontotemporale (FTD) et la maladie de Huntington (MH). Les progrès de la microscopie optique et de la microscopie électronique permettent un examen approfondi des structures subcellulaires, y compris le NPC et ses constituants Nup, avec une précision et une résolution accrues. Parmi les techniques couramment utilisées, la microscopie à illumination structurée à super-résolution (SIM) offre l’opportunité inégalée d’étudier la localisation et l’expression de Nups individuels à l’aide de stratégies conventionnelles de marquage basées sur les anticorps. L’isolement des noyaux avant la SIM permet de visualiser les protéines Nup individuelles au sein du NPC et du nucléoplasme dans un espace 3D entièrement et précisément reconstruit. Ce protocole décrit une procédure d’isolement des noyaux et de SIM pour évaluer l’expression et la distribution de Nup dans les cellules du SNC et les tissus post-mortem dérivés d’iPSC humains.

Introduction

La prévalence des maladies neurodégénératives liées à l’âge augmente avec le vieillissement de la population1. Bien que les fondements génétiques et les caractéristiques pathologiques soient bien caractérisés, les événements moléculaires précis conduisant aux lésions neuronales restent mal compris2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Récemment, un G4C2 L’expansion répétée de l’hexanucléotide dans le premier intron du gène C9orf72 a été identifiée comme la cause génétique la plus fréquente des maladies neurodégénératives apparentées que sont la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la démence frontotemporale (DFT)13,14. Plusieurs études soutiennent maintenant un rôle central pour les perturbations de la machinerie de transport nucléaire, y compris les complexes de pores nucléaires (NPC) et les récepteurs de transport nucléaire (NTR, karyophérines), comme étant la cause de l’ALS C9orf7215,16. Dans les cellules qui ne se divisent pas dans le cerveau du rat, les nucléoporines d’échafaudage (Nups) ont une durée de vie extrêmement longue. En conséquence, des altérations des NPC et des NCT ont été signalées au cours du vieillissement17,18,19,20. De plus, certains nucléoporines ou transportines, lorsqu’ils sont mutés, sont liés à des maladies neurologiques spécifiques21,22. Par exemple, les mutations de Nup62 ont été associées à la nécrose striatale bilatérale infantile (IBSN), un trouble neurologique affectant le noyau caudé et le putamen23; des mutations de Gle1 ont été impliquées dans la maladie du motoneurone fœtal, le syndrome de contracture congénitale létale humaine-1 (LCCS1)24; et les mutations d’Aladin sont à l’origine du syndrome Triple-A25. Les altérations de la TCN fonctionnelle sont exacerbées dans les maladies neurodégénératives liées à l’âge telles que la SLA, la maladie de Huntington (MH) et la maladie d’Alzheimer (MA)16,26,27,28,29,30,31. De plus, des Nups et des NTR spécifiques ont été signalés comme modificateurs de la toxicité induite par C9orf72 dans le Drosophila oeil28 ou modifier biochimiquement l’état d’agrégation de protéines liées à des maladies telles que FUS et tau27,32,33,34. Collectivement, ces premières études suggèrent que l’altération de la TCN peut être une caractéristique pathologique primaire et précoce de la SLA et de la DFT. Des études dans un système modèle basé sur la surexpression ont suggéré qu’une mauvaise localisation de Nups et de karyophérines spécifiques peut avoir un impact sur le NCT16,35,36,37,38. Cependant, ces études pathologiques ne lient pas réellement les accumulations cytoplasmiques de protéines NPC à des défauts dans la structure ou la fonction de la NPC. Par exemple, cette pathologie peut simplement refléter la dérégulation des pools cytoplasmiques des protéines Nup avec peu d’impact sur la composition et la fonction des NPC. En revanche, une étude récente utilisant la microscopie à illumination structurée (SIM) à super résolution démontre l’émergence d’une lésion significative du NPC lui-même, caractérisée par une réduction des niveaux spécifiques de Nup dans le nucléoplasme et les NPC des neurones humains C9orf72 ALS/FTD, conduisant finalement à une altération de la fonction NPC en tant qu’événement initiateur précoce dans les cascades de maladies pathogènes15.

Le passage des macromolécules entre le noyau et le cytoplasme est régi par le complexe de pores nucléaires (NPC). Le NPC est un grand complexe macromoléculaire intégré dans l’enveloppe nucléaire composé de plusieurs copies de 30 protéines nucléoporines (Nups)39,40,41. Bien que la stœchiométrie Nup varie selon les types de cellules 42,43,44, le maintien de la composition globale des NPC est essentiel pour la NCT, l’organisation du génome et la viabilité cellulaire globale 39,41,45,46. Par conséquent, l’altération de la composition des NPC et les défauts de transport fonctionnel qui en résultent sont susceptibles d’avoir un impact sur une myriade de fonctions cellulaires en aval. Les constituants Nup de la NPC sont fortement organisés en plusieurs sous-complexes, y compris l’anneau cytoplasmique et les filaments, le canal central, l’anneau externe, l’anneau intérieur, l’anneau transmembranaire et le panier nucléaire. Collectivement, les Nups d’échafaudage des anneaux interne, externe et transmembranaire ancrent les NPC dans l’enveloppe nucléaire et fournissent des points d’ancrage pour les Nups de l’anneau cytoplasmique, du canal central et du panier nucléaire. Alors que les petites molécules (<40-60 kD) peuvent diffuser passivement à travers le NPC, le transport actif de cargaisons plus importantes est facilité par les interactions entre les récepteurs de transport nucléaire (NTR, caryophérines) et les FG Nups des filaments cytoplasmiques, du canal central et du panier nucléaire 39,40,41,45. En outre, une poignée de Nups peut également fonctionner à l’extérieur du NPC, dans le nucléoplasme, pour réguler l’expression des gènes46,47.

Étant donné que la dimension latérale d’un seul NPC humain est d’environ 100-120 nm40, la microscopie standard à grand champ ou confocale est insuffisante pour résoudre les NPC individuels48. Les techniques de microscopie électronique (EM) telles que la MET ou la MEB sont souvent utilisées pour évaluer la structure globale des NPC39,40. Malgré les avantages de ces techniques pour résoudre l’ultrastructure des NPC, elles sont moins couramment utilisées pour évaluer la présence de protéines Nup individuelles au sein des NPC. Les limites techniques de la combinaison du marquage par anticorps ou par marquage avec ces technologies de pointe, TEM et SEM, ne permettent pas toujours une évaluation précise et fiable des Nups individuels eux-mêmes au sein des NPC ou du nucléoplasme. De plus, ces techniques peuvent être techniquement difficiles et ne sont pas encore largement accessibles à tous les chercheurs. Cependant, les progrès récents de la microscopie optique et de fluorescence ont augmenté l’accessibilité des technologies d’imagerie à super-résolution. Plus précisément, SIM offre l’opportunité inégalée d’imager des Nups individuels avec une résolution qui approche les dimensions latérales d’un NPC humain 40,48,49,50,51. Contrairement à d’autres approches de super-résolution telles que la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) et la déplétion par émission stimulée (STED), la SIM est compatible avec l’immunomarquage conventionnel à base d’anticorps49. Ainsi, SIM permet une analyse complète de tous les Nups pour lesquels un anticorps Nup spécifique est disponible. La possibilité d’échantillonner et d’imager plusieurs Nups différents dans la même préparation offre des avantages significatifs par rapport aux autres méthodes d’imagerie lors de l’étude des nombreuses protéines qui composent le NPC. La procédure suivante détaille un protocole optimisé pour l’évaluation des composants Nup individuels de la NPC à l’aide de noyaux isolés de neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) et de tissus post-mortem du système nerveux central humain (SNC).

Protocole

Tous les échantillons de sang pour la génération d’iPSC et les prélèvements de tissus autopsiés sont approuvés par l’IRB de Johns Hopkins sous la supervision éthique de Johns Hopkins. Toutes les informations sur les patients sont conformes à la HIPPA. Le protocole suivant est conforme à toutes les procédures de biosécurité de Johns Hopkins.

1. Préparation de lames pour l’immunomarquage et l’imagerie

  1. Placez une lame de microscope en verre chargée positivement dans un cytoentonnoir vide et tracez un cercle avec un stylo barrière hydrophobe pour délimiter une zone de dépôt des noyaux.
  2. Ajouter 50 μL de solution de collagène à 1 mg/mL (diluée dans 1x PBS) au centre du cercle dessiné à l’étape 1.1 et incuber à température ambiante pendant 5 min.
  3. Aspirez la solution de collagène et laissez les lames sécher à l’air libre à température ambiante pendant environ 1 h.

2. Préparation du tampon de lyse et des gradients de saccharose

  1. Préparer les solutions de tampon de lyse et de gradient de saccharose selon le protocole du kit d’isolement des noyaux.
    1. Pour chaque échantillon, préparer un tube conique de 50 mL de tampon de lyse en combinant 11 mL du tampon de lyse fourni, 110 μL de la solution de Triton X-100 à 10 % fournie et 11 μL de DTT 1 M (Dithiothreitol) fraîchement préparé ou décongelé.
    2. Pour chaque échantillon, à l’aide d’un tube conique de 50 mL, préparer une solution de coussin de saccharose de 1,85 mL en combinant 27,75 mL de la solution de coussin de saccharose de 2 M, 2,25 mL de tampon de coussin de saccharose fourni et 30 μL de DTT de 1 M fraîchement préparé ou décongelé.
      REMARQUE : Une solution de coussin de saccharose de 1,85 M est optimale pour les iPSN et les tissus du SNC humain post-mortem, mais ajustez-la pour d’autres types de cellules ou échantillons de tissus. Des détails supplémentaires sur les cellules HEK293, les astrocytes dérivés d’iPSC et l’enrichissement des noyaux d’oligodendrocytes à partir de tissus post-mortem du SNC ont récemment été publiés15.
  2. Mélangez doucement les solutions de tampon de lyse et de coussin de saccharose en inversant les tubes coniques et stockez-les sur de la glace.

3. Lyse des iPSN et du tissu autopsie du SNC humain post-mortem

  1. Avant de procéder à la lyse, placez le rotor de l’ultracentrifugeuse (sans porte-échantillons) dans l’ultracentrifugeuse et laissez-le prérefroidir à 4 °C.
  2. Lyse des iPSN.
    REMARQUE : Les protocoles de lyse diffèrent pour les iPSN et les tissus du SNC humain post-mortem. Suivez le protocole pour le type d’échantillon spécifié ci-dessous (étape 3.2 : iPSN, étape 3.3 : tissu humain du SNC post-mortem).
    1. Retirez les iPSN de l’incubateur et aspirez les supports. Rincez brièvement avec 1x PBS et ajoutez le tampon de lyse directement dans le puits ou la plaque.
      REMARQUE : Prenez soin de rincer correctement les iPSN avec une quantité suffisante de 1x PBS pour éliminer les débris et les cellules mortes. Le volume de tampon de lyse à ajouter aux plaques iPSN varie. Veuillez vous référer au tableau 1. Assurez-vous que le matériel de départ est de >2,5 millions d’iPSN.
    2. Grattez les iPSN à l’aide d’un grattoir à cellules et transférez-les dans le tampon de lyse restant dans le tube conique de 50 ml.
    3. Boucher chaque tube conique et vortex les échantillons pendant 20 s pour faciliter la lyse de l’iPSN.
    4. Laissez les échantillons reposer sur de la glace pendant 1 à 2 minutes avant de continuer.
  3. Lyse de tissus post-mortem du SNC humain.
    1. Pesez ~100 mg de tissu humain congelé du SNC post-mortem en le coupant avec une lame de rasoir dans une boîte de Pétri placée sur un lit de glace sèche. Assurez-vous de travailler sur une surface entourée de tampons jetables pour éviter la contamination locale des tissus. Faites attention aux dissections spécifiques de la matière grise par rapport à la substance blanche (par exemple, le manteau cortical par rapport à la substance blanche sous-jacente) visibles au moment de la dissection tissulaire.
      REMARQUE : Portez l’EPI approprié, y compris des lunettes de protection et des gants, lorsque vous manipulez des échantillons de tissus humains congelés post-mortem. Cette étape peut également être réalisée à l’avance et les aliquotes tissulaires stockées à -80 °C. 50 mg sont une quantité suffisante pour l’isolement des noyaux. Cependant, plus de 100 mg de tissu produit souvent un isolement incomplet des noyaux, comme en témoigne la présence de cytoplasme intact entourant certains noyaux.
    2. Préparez l’homogénéisateur Dounce en le nettoyant et en le rinçant abondamment à l’eau distillée. Réfrigérez l’homogénéisateur en le plaçant sur de la glace.
    3. Ajouter 100 mg de mouchoir dans un homogénéisateur fraîchement nettoyé, rincé et réfrigéré (sur de la glace) contenant 2 ml du tampon de lyse préparé.
    4. Homogénéiser dans l’homogénéisateur Dounce en utilisant la procédure standard sur glace.
      REMARQUE : En règle générale, 10 à 20 coups par pilon sont suffisants pour se déplacer à travers l’échantillon sans résistance.
    5. Transférez 2 ml d’homogénat de cerveau humain post-mortem dans les 9 ml restants de tampon de lyse dans des tubes coniques.
    6. Agitez vigoureusement pendant 30 s et laissez reposer sur de la glace pendant 5 min pour faciliter la lyse.

4. Isolement des noyaux à partir d’iPSN et de tissus du SNC humain post-mortem

  1. Déposer 10 mL de solution de coussin de saccharose 1,85 M (effectuée à l’étape 2.1.2) au fond d’un tube d’ultracentrifugeuse et ajouter 18 mL de solution de coussin de saccharose 1,85 M à chaque lysat.
  2. Mélangez délicatement la solution de coussin de lysat et de saccharose (combinée à l’étape 4.1) en inversant le tube conique de 50 mL.
  3. Ajouter lentement 28 ml de mélange de solution de coussin de lysat et de saccharose sur le dessus des 10 ml de solution de coussin de saccharose de 1,85 M dans le tube d’ultracentrifugation (à partir de l’étape 4.1).
    REMARQUE : Il y a un total de 29 mL de mélange de solution de coussin de lysat et de saccharose dans le tube conique de 50 mL (étapes 4.1-4.2). Laissez 1 ml de ce mélange de solution de coussin de lysat et de saccharose dans le tube conique de 50 ml. Cela garantit un pipetage précis et cohérent entre tous les échantillons en raison de la viscosité de la solution de coussin de saccharose.
  4. Placez les tubes d’ultracentrifugation dans les supports et ajoutez une solution supplémentaire de coussin de saccharose de 1,85 M (effectuée à l’étape 2.1.2) si nécessaire pour équilibrer les échantillons.
  5. Placez les porte-échantillons dans le rotor de l’ultracentrifugeuse réfrigérée et faites-les tourner à 30 000 x g, 4 °C pendant 45 min.
  6. Retirez les tubes d’ultracentrifugation des porte-échantillons et jetez les surnageants. Les noyaux seront visibles sous forme de pastilles sur les côtés inférieurs du tube de l’ultracentrifugeuse.
  7. Remettre les pastilles de noyaux en suspension dans 1 mL de la mémoire tampon de stockage des noyaux fournie par vortex et les transférer dans un tube de microcentrifugation.
  8. Centrifuger les tubes de microcentrifugation à 2 500 x g, 4 °C pendant 5 min.
  9. Retirer le surnageant et remettre les noyaux en suspension en injectant 1 mL de tampon de stockage des noyaux fournis.
  10. Procéder à l’immunocoloration ou stocker les noyaux à -80 °C.
    REMARQUE : Les noyaux peuvent être stockés à -80 °C jusqu’à 6 mois et être soumis à deux cycles de gel/dégel avant que l’intégrité structurelle ne soit compromise.

5. Immunomarquage des noyaux isolés

  1. Prélever une aliquote de 10 μL de la suspension de noyaux et compter à l’aide d’un hémacytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé.
  2. Assemblez les lames préparées (à partir de l’étape 1.3) dans les cytoentonnoirs.
  3. À chaque cytoentonnoir, superposez 200 μL de tampon de stockage de noyaux frais et ~100 000 nucles.
  4. Faites tourner doucement les noyaux sur les lames en plaçant les cytoentonnoirs dans un cytospin et en centrifugeant pendant 3 min à 100 x g.
  5. Déclipsez les cytofunnels et ajoutez immédiatement ~100 μL de PFA (paraformaldéhyde) à 4 % dans les lames et incubez pendant 15 min à température ambiante.
    REMARQUE : Les noyaux peuvent également être fixés avec du méthanol. Utilisez une méthode de fixation appropriée pour chaque anticorps. Si vous utilisez du méthanol, sautez l’étape de perméabilisation (5.7). Les cytoentonnoirs sont à usage unique ; Jetez-les à ce stade.
  6. Lavez les noyaux 3x pendant 5 min avec 1x PBS.
  7. Perméabiliser les noyaux avec 0,1 % de Triton X-100 dans 1x PBS pendant 10 min à température ambiante.
  8. Bloquez les noyaux dans une solution en bloc (10 % de sérum de chèvre ou d’âne dans 1x PBS) pendant 30 min à température ambiante.
  9. Incuber les noyaux avec des anticorps primaires dilués dans une solution en bloc pendant la nuit à 4 °C.
  10. Lavez les noyaux 3x pendant 5 min avec 1x PBS.
  11. Incuber les noyaux avec des anticorps secondaires dilués dans une solution en bloc pendant 1 h à température ambiante.
    REMARQUE : Les anticorps secondaires Alexa Fluor 488, 568 et 647 sont préférés.
  12. Lavez les noyaux 3x pendant 5 min avec 1x PBS.
  13. FACULTATIF : Incuber les noyaux pendant 5 minutes avec du DAPI ou du Hoechst, suivi de deux lavages supplémentaires de 5 minutes avec 1x PBS.
  14. Tenez une lingette non pelucheuse sur le bord du cercle contenant les noyaux pour enlever complètement le dernier lavage PBS.
  15. Ajoutez 1 goutte (~10 μL) d’un support de montage anti-évanouissement à montage rigide (sans DAPI) sur chaque diapositive et placez délicatement des lamelles carrées à haute tolérance de 18 mm x 18 mm sur chaque diapositive.
    REMARQUE : Lors de l’utilisation d’un support à montage dur, le scellement des lames n’est pas nécessaire si les lames sont imagées dans un délai approprié. L’immunoréactivité de Nup est généralement restée stable sur des lames non scellées stockées à 4 °C pendant ~6 mois. Cependant, les bords de la lamelle peuvent être scellés avec une fine couche de vernis à ongles si un support monté humide est utilisé ou pour un stockage prolongé.
  16. Gardez les lames à l’abri de la lumière et laissez-les durcir toute la nuit à température ambiante.
  17. L’imagerie des noyaux peut être obtenue par microscopie à illumination structurée (SIM) à super-résolution.
    REMARQUE : Zeiss, Nikon et GE Healthcare fabriquent tous des microscopes SIM. Suivez les protocoles spécifiques au système pour l’acquisition et le traitement des images. Utilisez des paramètres d’imagerie (puissance laser, jeux de filtres, temps d’exposition) appropriés pour chaque Nup et fluorophore. Lors de l’imagerie, évitez les bords du cercle (à partir de l’étape 1.1) car ces noyaux sont généralement aplatis et étalés à la suite de l’étape de centrifugation (5.4). Les images entièrement déconvoluées et traitées peuvent être soumises à un certain nombre d’analyses, y compris la détection ponctuelle et les mesures de volume à l’aide de modules d’analyse 3D standard dans les logiciels d’analyse d’images FIJI ou Imaris. Des détails supplémentaires sur les méthodes d’analyse ont été publiés récemment15.

Résultats

Pour examiner la distribution et l’expression de POM121 dans les noyaux neuronaux humains, les iPSN de contrôle et de C9orf72 ont été différenciés comme décrit précédemment15. Le cortex moteur humain post-mortem et les iPSN du jour 32 ont été lysés et soumis à l’isolement des noyaux et à l’immunocoloration comme décrit ci-dessus. Les noyaux isolés positifs à NeuN ont été imagés par microscopie à illumination structurée à super-résoluti...

Discussion

Étant donné l’identification récente des déficits NCT comme un phénomène précoce et important dans de multiples maladies neurodégénératives 16,27,28,30,31, il existe un besoin critique d’examiner en profondeur le mécanisme par lequel cette pathologie se produit. Comme la NPC et ses protéines Nup individuelles c...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Des tissus post-mortem du SNC humain ont été fournis par la banque d’autopsie de la SLA de Johns Hopkins et le Target ALS Postmortem Tissue Core. Ce travail a été soutenu par l’ALSA Milton Safenowitz Postdoctoral Fellowship Fellowship (ANC), ainsi que par le financement du NIH-NINDS, du ministère de la Défense, de l’ALS Association, de la Muscular Dystrophy Association, de F Prime, du Robert Packard Center for ALS Research Answer ALS Program et de l’initiative Chan Zuckerberg.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL conical tubesFisher Scientific14-959-49A
Beckman UltracentrifugeBeckman Coulter
Cell ScrapersSarstedt83.183
CollagenAdvanced Biomatrix5005
CoverslipsMatTekPCS-170-1818
CytofunnelThermo Fisher ScientificA78710020
Cytospin 4Fisher ScientificA78300003
Dounce HomogenizersDWK Life Sciences357542
DTTSigma AldrichD0632
Eppendorf tubesFisher Scientific05-408-129
Goat Anti-Chicken Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21449
Goat Anti-Mouse Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11029
Goat Anti-Mouse Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11031
Goat Anti-Mouse Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21236
Goat Anti-Rabbit Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11034
Goat Anti-Rabbit Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11036
Goat Anti-Rabbit Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21245
Goat Anti-Rat Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11006
Goat Anti-Rat Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11077
Goat Anti-Rat Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21247
HemacytometerFisher Scientific267110
Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Normal Goat SerumVector LabsS-1000
Nuclei PURE Prep Nuclei Isolation KitSigma AldrichNUC201Contains Lysis Buffer, 10% Triton X-100, 2 M Sucrose Gradient, Sucrose Cushion Solution, and Nuclei Storage Buffer; Referenced in protocol as "nuclei isolation kit"
PBSThermo Fisher Scientific10010023
PFAElectron Microscopy Sciences15714-S
Prolong Gold AntifadeInvitrogenP36930Referenced in protocol as "hard mount antifade mounting media"
SW 32 Ti Ultracentrifuge RotorBeckman Coulter369694Referenced in protocol as "ultracentrifuge rotor"
Triton X-100Sigma AldrichT9284
Trypan BlueThermo Fisher Scientific15-250-061
Ultracentrifuge TubesBeckman Coulter344058
Nucleoporin Primary AntibodiesPrimary antibodies suitable for immunofluorescent detection of invidual nucleoporins are available from multiple companies 

Références

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