JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen optimierten Arbeitsablauf für die Zellkernisolierung und die hochauflösende strukturierte Beleuchtungsmikroskopie zur Bewertung einzelner Nukleoporine im Nukleoplasma und in NPCs in induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen und postmortalen menschlichen Geweben.

Zusammenfassung

Der Kernporenkomplex (NPC) ist eine komplexe makromolekulare Struktur, die aus mehreren Kopien von ~30 verschiedenen Nukleoporinproteinen (Nups) besteht. Zusammen regulieren diese Nups die Genomorganisation, die Genexpression und den nukleozytoplasmatischen Transport (NCT). In jüngster Zeit wurden Defekte in der NCT und Veränderungen an spezifischen Nups als frühe und prominente Pathologien bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen identifiziert, darunter Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Alzheimer-Krankheit (AD)/Frontotemporale Demenz (FTD) und Huntington-Krankheit (HD). Fortschritte sowohl in der Licht- als auch in der Elektronenmikroskopie ermöglichen eine gründliche Untersuchung subzellulärer Strukturen, einschließlich des NPC und seiner Nup-Bestandteile, mit erhöhter Präzision und Auflösung. Von den gebräuchlichsten Techniken bietet die hochauflösende strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM) die beispiellose Möglichkeit, die Lokalisation und Expression einzelner Nups mit herkömmlichen Antikörper-basierten Markierungsstrategien zu untersuchen. Die Isolierung von Zellkernen vor der SIM ermöglicht die Visualisierung einzelner Nup-Proteine innerhalb des NPC und des Nukleoplasmas in einem vollständig und genau rekonstruierten 3D-Raum. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Zellkernisolierung und SIM zur Bewertung der Nup-Expression und -Verteilung in humanen iPSC-abgeleiteten ZNS-Zellen und postmortalen Geweben.

Einleitung

Die Prävalenz altersbedingter neurodegenerativer Erkrankungen nimmt mit zunehmendem Alter der Bevölkerung zu1. Während die genetischen Grundlagen und pathologischen Merkmale gut charakterisiert sind, sind die genauen molekularen Ereignisse, die zu neuronalen Verletzungen führen, nach wie vor wenig verstanden2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Kürzlich wurde ein G4C2 Die Hexanukleotid-Repeat-Expansion im ersten Intron des C9orf72-Gens wurde als häufigste genetische Ursache für die verwandten neurodegenerativen Erkrankungen Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und Frontotemporale Demenz (FTD) identifiziert13,14. Mehrere Studien belegen nun eine zentrale Rolle für Störungen in der nuklearen Transportmaschinerie, einschließlich nukleärer Porenkomplexe (NPCs) und nukleärer Transportrezeptoren (NTRs, Karyopherine), als Verursacher von C9orf72 ALS15,16. In sich nicht teilenden Zellen im Rattengehirn sind Gerüst-Nukleoporine (Nups) extrem langlebig. Infolgedessen wurden Veränderungen bei NPCs und NCT während des Alterns berichtet17,18,19,20. Darüber hinaus sind einige Nukleoporine oder Transportine, wenn sie mutiert sind, mit bestimmten neurologischen Erkrankungen verbunden21,22. Zum Beispiel wurden Mutationen in Nup62 mit der infantilen bilateralen striatalen Nekrose (IBSN) in Verbindung gebracht, einer neurologischen Störung, die den Nucleus caudatus und das Putamen betrifft23; Mutationen in Gle1 wurden mit der fetalen Motoneuronenerkrankung Human Lethal Congenital Contracture Syndrome-1 (LCCS1) in Verbindung gebracht24; und Mutationen in Aladin sind ursächlich für das Triple-A-Syndrom25. Veränderungen der funktionellen NCT verschlimmern sich bei altersbedingten neurodegenerativen Erkrankungen wie ALS, der Huntington-Krankheit (HD) und der Alzheimer-Krankheit (AD)16,26,27,28,29,30,31. Darüber hinaus wurden spezifische Nups und NTRs als Modifikatoren der C9orf72-vermittelten Toxizität in der Drosophila Auge28 oder den Aggregationszustand von krankheitsgebundenen Proteinen wie FUS und Tau biochemisch zu modifizieren27,32,33,34. Zusammengenommen deuten diese frühen Studien darauf hin, dass eine veränderte NCT ein primäres und frühes pathologisches Merkmal von ALS und FTD sein könnte. Studien zu Überexpressions-basierten Modellsystemen haben gezeigt, dass die Fehllokalisation spezifischer Nups und Karyopherine die NCT beeinflussen kann16,35,36,37,38. Diese pathologischen Studien bringen zytoplasmatische Ansammlungen von NPC-Proteinen jedoch nicht mit Defekten in der Struktur oder Funktion des NPC in Verbindung. Zum Beispiel kann diese Pathologie einfach die Dysregulation der zytoplasmatischen Pools von Nup-Proteinen mit geringem Einfluss auf die Zusammensetzung und Funktion von NPCs widerspiegeln. Im Gegensatz dazu zeigt eine kürzlich durchgeführte Studie, in der hochauflösende strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM) eingesetzt wurde, das Auftreten einer signifikanten Schädigung des NPC selbst, die durch eine Verringerung der spezifischen Nup-Spiegel im Nukleoplasma und in den NPCs menschlicher C9orf72 ALS/FTD-Neuronen gekennzeichnet ist und letztendlich zu einer veränderten NPC-Funktion als frühes auslösendes Ereignis in pathogenen Krankheitskaskaden führt15.

Der Durchgang von Makromolekülen zwischen dem Zellkern und dem Zytoplasma wird durch den Kernporenkomplex (NPC) gesteuert. Das NPC ist ein großer makromolekularer Komplex, der in die Kernhülle eingebettet ist und aus mehreren Kopien von 30 Nukleoporinproteinen (Nups) besteht39,40,41. Obwohl die Nup-Stöchiometrie zwischen den Zelltypen variiert 42,43,44, ist die Aufrechterhaltung der Gesamt-NPC-Zusammensetzung entscheidend für die NCT, die Genomorganisation und die allgemeine zelluläre Lebensfähigkeit 39,41,45,46. Infolgedessen wirken sich eine veränderte NPC-Zusammensetzung und nachfolgende Defekte im funktionellen Transport wahrscheinlich auf eine Vielzahl nachgelagerter zellulärer Funktionen aus. Die Nup-Bestandteile des NPC sind hochgradig in mehrere Unterkomplexe organisiert, einschließlich des zytoplasmatischen Rings und der Filamente, des zentralen Kanals, des äußeren Rings, des inneren Rings, des Transmembranrings und des Kernkorbs. Gemeinsam verankern Gerüst-Nups des inneren, äußeren und Transmembranrings NPCs in der Kernhülle und bieten Ankerpunkte für Nups des zytoplasmatischen Rings, des zentralen Kanals und des Kernkorbs. Während kleine Moleküle (<40-60 kD) passiv durch den NPC diffundieren können, wird der aktive Transport größerer Ladungen durch Wechselwirkungen zwischen nukleären Transportrezeptoren (NTRs, Karyopherinen) und den FG-Nups der zytoplasmatischen Filamente, des zentralen Kanals und des Kernkorbserleichtert 39,40,41,45. Außerdem kann eine Handvoll Nups zusätzlich außerhalb des NPC, innerhalb des Nukleoplasmas, die Genexpression regulieren46,47.

Angesichts der Tatsache, dass die laterale Dimension eines einzelnen menschlichen NPC etwa 100-120 nm40 beträgt, ist die Standard-Weitfeld- oder konfokale Mikroskopie nicht ausreichend, um einzelne NPCsaufzulösen 48. Elektronenmikroskopische (EM) Techniken wie TEM oder REM werden häufig verwendet, um die Gesamtstruktur von NPCszu bewerten 39,40. Trotz der Vorteile dieser Techniken zur Auflösung der NPC-Ultrastruktur werden sie seltener verwendet, um das Vorhandensein einzelner Nup-Proteine innerhalb des NPC zu bewerten. Die technischen Einschränkungen der Kombination von Antikörper- oder Tag-basierter Markierung mit diesen hochmodernen Technologien, TEM und SEM, erlauben nicht immer eine genaue und zuverlässige Beurteilung einzelner Nups selbst innerhalb von NPCs oder des Nukleoplasmas. Darüber hinaus können diese Techniken technisch anspruchsvoll sein und sind noch nicht für alle Forscher allgemein zugänglich. Jüngste Fortschritte in der Licht- und Fluoreszenzmikroskopie haben jedoch die Zugänglichkeit von hochauflösenden Bildgebungstechnologien verbessert. Insbesondere bietet SIM die unvergleichliche Möglichkeit, einzelne Nups mit einer Auflösung abzubilden, die sich den lateralen Abmessungen eines menschlichen NPCs 40,48,49,50,51 annähert. Im Gegensatz zu anderen superauflösenden Ansätzen wie der stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) und der stimulierten Emissionsverarmung (STED) ist SIM mit der konventionellen Antikörper-basierten Immunfärbung kompatibel49. Somit ermöglicht SIM eine umfassende Analyse aller Nups, für die ein spezifischer Nup-Antikörper verfügbar ist. Die Möglichkeit, mehrere verschiedene Nups in ein und demselben Präparat zu beproben und abzubilden, bietet erhebliche Vorteile gegenüber anderen bildgebenden Verfahren bei der Untersuchung der vielen Proteine, aus denen der NPC besteht. Das folgende Verfahren beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Bewertung einzelner Nup-Komponenten des NPC unter Verwendung von Zellkernen, die aus Neuronen (iPSNs) aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) und postmortalen Geweben des menschlichen Zentralnervensystems (ZNS) isoliert wurden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Alle Blutproben für die iPS-Erzeugung und autopsierte Gewebeentnahmen werden vom Johns Hopkins IRB unter Ethikaufsicht von Johns Hopkins zugelassen. Alle Patienteninformationen sind HIPPA-konform. Das folgende Protokoll hält sich an alle Biosicherheitsverfahren von Johns Hopkins.

1. Vorbereitung von Objektträgern für die Immunfärbung und Bildgebung

  1. Positionieren Sie einen positiv geladenen Objektträger aus Glas in einem leeren Zytotrichter und zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift einen Kreis, um einen Bereich für die Ablagerung der Zellkerne zu umreißen.
  2. 50 μl 1 mg/ml Kollagenlösung (verdünnt in 1x PBS) in die Mitte des in Schritt 1.1 gezeichneten Kreises geben und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Aspirieren Sie die Kollagenlösung und lassen Sie die Objektträger ca. 1 h bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.

2. Herstellung von Lysepuffer und Saccharosegradienten

  1. Bereiten Sie den Lysepuffer und die Saccharose-Gradientenlösungen gemäß dem Protokoll des Zellkernisolationskits vor.
    1. Bereiten Sie für jede Probe ein konisches 50-ml-Röhrchen mit Lysepuffer vor, indem Sie 11 ml des mitgelieferten Lysepuffers, 110 μl der mitgelieferten 10%igen Triton X-100-Lösung und 11 μl frisch zubereitetes oder aufgetautes 1 M DTT (Dithiothreitol) kombinieren.
    2. Verwenden Sie für jede Probe ein konisches 50-ml-Röhrchen, um eine 1,85-m-Saccharose-Kissenlösung herzustellen, indem 27,75 mL der mitgelieferten 2-M-Saccharose-Kissenlösung, 2,25 mL des mitgelieferten Saccharose-Kissenpuffers und 30 μl frisch zubereitetes oder aufgetautes 1 M DTT kombiniert werden.
      HINWEIS: Eine 1,85 M Saccharose-Kissenlösung ist optimal für iPSNs und postmortales menschliches ZNS-Gewebe, aber passen Sie sie für andere Zelltypen oder Gewebeproben an. Weitere Details zu HEK293-Zellen, iPSC-abgeleiteten Astrozyten und der Anreicherung von Oligodendrozytenkernen aus postmortalem ZNS-Gewebe wurden kürzlich veröffentlicht15.
  2. Mischen Sie Lysepuffer und Saccharosekissenlösungen vorsichtig, indem Sie konische Röhrchen umdrehen und auf Eis lagern.

3. Lyse von iPSNs und postmortalem humanem ZNS-Gewebe

  1. Bevor Sie mit der Lyse fortfahren, setzen Sie den Ultrazentrifugenrotor (ohne Probenhalter) in die Ultrazentrifuge ein und lassen Sie ihn auf 4 °C vorkühlen.
  2. Lyse von iPSNs.
    HINWEIS: Die Lyseprotokolle unterscheiden sich für iPSNs und postmortales menschliches ZNS-Gewebe. Befolgen Sie das Protokoll für den unten angegebenen Probentyp (Schritt 3.2: iPSNs, Schritt 3.3: postmortales menschliches ZNS-Gewebe).
    1. Entnehmen Sie die iPSNs aus dem Inkubator und saugen Sie das Medium an. Spülen Sie kurz mit 1x PBS und geben Sie den Lysepuffer direkt in die Vertiefung oder Platte.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, iPSNs ausreichend mit einer ausreichenden Menge von 1x PBS zu spülen, um Ablagerungen und abgestorbene Zellen zu entfernen. Das Volumen des Lysepuffers, das den iPSN-Platten zugesetzt werden muss, variiert. Siehe Tabelle 1. Stellen Sie sicher, dass das Ausgangsmaterial >2,5 Millionen iPSNs beträgt.
    2. Kratzen Sie die iPSNs mit einem Zellschaber ab und überführen Sie sie in den restlichen Lysepuffer im konischen 50-mL-Röhrchen.
    3. Verschließen Sie jedes konische Röhrchen und wirbeln Sie die Proben 20 s lang vor, um die iPSN-Lyse zu erleichtern.
    4. Lassen Sie die Proben 1-2 Minuten auf Eis ruhen, bevor Sie fortfahren.
  3. Lyse von postmortalem humanem ZNS-Gewebe.
    1. Wiegen Sie ~100 mg gefrorenes postmortales menschliches ZNS-Gewebe ab, indem Sie mit einer Rasierklinge in eine Petrischale schneiden, die auf einem Bett aus Trockeneis liegt. Achten Sie darauf, auf einer Oberfläche zu arbeiten, die von Einweg-Pads umgeben ist, um eine lokale Kontamination des Gewebes zu vermeiden. Achten Sie auf spezifische Dissektionen der grauen Substanz im Vergleich zur weißen Substanz (z. B. kortikaler Mantel versus darunter liegende weiße Substanz), die zum Zeitpunkt der Gewebedissektion sichtbar sind.
      HINWEIS: Tragen Sie die geeignete PSA, einschließlich Augenschutz und Handschuhe, wenn Sie mit gefrorenen postmortalen menschlichen Gewebeproben umgehen. Dieser Schritt kann auch im Voraus abgeschlossen und die Gewebealiquote bei -80 °C gelagert werden. 50 mg ist eine ausreichende Menge für die Zellkernisolierung. Gewebe mit mehr als 100 mg Gehalt führt jedoch häufig zu einer unvollständigen Isolierung der Zellkerne, was durch das Vorhandensein von intaktem Zytoplasma um einige Kerne herum belegt wird.
    2. Bereiten Sie den Dounce Homogenisator vor, indem Sie ihn reinigen und gründlich mit destilliertem Wasser spülen. Kühlen Sie den Homogenisator, indem Sie ihn auf Eis stellen.
    3. Geben Sie 100 mg Gewebe in den frisch gereinigten, gespülten und gekühlten (auf Eis) Dounce Homogenisator, der 2 ml des vorbereiteten Lysepuffers enthält.
    4. Homogenisieren Sie im Dounce Homogenisator mit dem Standardverfahren auf Eis.
      HINWEIS: In der Regel reichen 10-20 Hübe pro Stößel aus, um sich ohne Widerstand durch die Probe zu bewegen.
    5. 2 ml postmortales Homogenat des menschlichen Gehirns auf die restlichen 9 ml Lysepuffer in konischen Röhrchen übertragen.
    6. 30 s lang kräftig einreiben und 5 Minuten auf Eis ruhen lassen, um die Lyse zu erleichtern.

4. Isolierung von Zellkernen aus iPSNs und postmortalem menschlichem ZNS-Gewebe

  1. Schichten Sie 10 mL 1,85 M Saccharose-Kissenlösung (hergestellt in Schritt 2.1.2) auf den Boden eines Ultrazentrifugenröhrchens und fügen Sie 18 mL 1,85 M Saccharose-Kissenlösung zu jedem Lysat hinzu.
  2. Die Lysat/Saccharose-Kissenlösung (in Schritt 4.1 kombiniert) wird vorsichtig gemischt, indem das konische 50-ml-Röhrchen umgedreht wird.
  3. Geben Sie langsam 28 ml Lysat/Saccharose-Kissenmischung auf die 10 ml 1,85 M Saccharose-Kissenlösung im Ultrazentrifugenröhrchen (aus Schritt 4.1).
    HINWEIS: In dem konischen 50-ml-Röhrchen (Schritte 4.1-4.2) befindet sich eine Mischung aus insgesamt 29 ml Lysat/Saccharose-Kissenlösung. Lassen Sie 1 ml dieser Mischung aus Lysat/Saccharose-Polsterlösung in dem konischen 50-ml-Röhrchen. Dies gewährleistet aufgrund der Viskosität der Saccharose-Kissenlösung ein genaues und konsistentes Pipettieren unter allen Proben.
  4. Legen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen in die Halterungen und fügen Sie bei Bedarf eine zusätzliche 1,85 M Saccharose-Kissenlösung (hergestellt in Schritt 2.1.2) hinzu, um die Proben auszugleichen.
  5. Die Probenhalter in den Rotor in die gekühlte Ultrazentrifuge setzen und bei 30.000 x g, 4 °C für 45 min schleudern.
  6. Die Ultrazentrifugenröhrchen aus den Probenhaltern nehmen und die Überstände entsorgen. Die Kerne sind als Pellets an den Unterseiten des Ultrazentrifugenröhrchens sichtbar.
  7. Resuspendieren Sie die Kernpellets in 1 ml des mitgelieferten Zellkernspeicherpuffers durch Vortexen und überführen Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
  8. Zentrifugieren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen bei 2.500 x g, 4 °C für 5 min.
  9. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellkerne, indem Sie 1 ml des mitgelieferten Zellkernspeicherpuffers in frischen 1 ml vortexen.
  10. Fahren Sie mit der Immunfärbung fort oder lagern Sie die Zellkerne bei -80 °C.
    HINWEIS: Die Zellkerne können bis zu 6 Monate lang bei -80 °C gelagert und zwei Gefrier-/Auftauzyklen unterzogen werden, bevor die strukturelle Integrität beeinträchtigt wird.

5. Immunfärbung der isolierten Zellkerne

  1. Nehmen Sie ein 10-μl-Aliquot der Zellkernsuspension und zählen Sie mit einem Hämazytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
  2. Setzen Sie die vorbereiteten Objektträger (aus Schritt 1.3) in die Zytotrichter ein.
  3. Auf jeden Zytotrichter werden 200 μl frischer Zellkernspeicherpuffer und ~100.000 Zellkerne gelegt.
  4. Schleudern Sie die Kerne vorsichtig auf die Objektträger, indem Sie die Zytotrichter in einen Zytospin legen und 3 Minuten lang bei 100 x g zentrifugieren.
  5. Lösen Sie die Zytotrichter und geben Sie sofort ~100 μl 4% PFA (Paraformaldehyd) zu den Objektträgern und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Kerne können auch mit Methanol fixiert werden. Verwenden Sie die für jeden Antikörper geeignete Fixierungsmethode. Bei Verwendung von Methanol ist der Schritt der Permeabilisierung (5.7) zu überspringen. Zytotrichter sind für den einmaligen Gebrauch bestimmt; Werfen Sie sie an dieser Stelle weg.
  6. Waschen Sie die Zellkerne 3x für 5 min mit 1x PBS.
  7. Permeabilisieren Sie die Kerne mit 0,1% Triton X-100 in 1x PBS für 10 min bei Raumtemperatur.
  8. Blockieren Sie die Zellkerne in Blocklösung (10% Ziegen- oder Eselserum in 1x PBS) für 30 min bei Raumtemperatur.
  9. Die Zellkerne werden mit Primärantikörpern inkubiert, die über Nacht bei 4 °C in Blocklösung verdünnt werden.
  10. Waschen Sie die Zellkerne 3x für 5 min mit 1x PBS.
  11. Die Zellkerne werden mit in Blocklösung verdünnten Sekundärantikörpern 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert.
    HINWEIS: Alexa Fluor 488, 568 und 647 Sekundärantikörper werden bevorzugt.
  12. Waschen Sie die Zellkerne 3x für 5 min mit 1x PBS.
  13. OPTIONAL: Inkubieren Sie die Zellkerne für 5 min mit DAPI oder Hoechst, gefolgt von zwei weiteren 5 min Washes mit 1x PBS.
  14. Halten Sie ein fusselfreies Tuch an den Rand des Kreises mit den Kernen, um die letzte PBS-Wäsche vollständig zu entfernen.
  15. Geben Sie 1 Tropfen (~10 μl) eines fest montierbaren Antifading-Eindeckmediums (ohne DAPI) auf jeden Objektträger und platzieren Sie vorsichtig quadratische Deckgläser mit hoher Toleranz von 18 mm x 18 mm auf jedem Objektträger.
    HINWEIS: Bei Verwendung eines fest eingespannten Mediums ist eine Objektträgerversiegelung nicht erforderlich, wenn die Objektträger innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens abgebildet werden. Die Nup-Immunreaktivität blieb in der Regel auf unversiegelten Objektträgern, die bei 4 °C gelagert wurden, ~6 Monate lang stabil. Die Ränder des Deckglases können jedoch mit einer dünnen Schicht Nagellack versiegelt werden, wenn ein Wet-Mount-Medium verwendet wird oder bei längerer Lagerung.
  16. Bewahren Sie die Objektträger lichtgeschützt auf und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur aushärten.
  17. Die Zellkerne können mit Hilfe der hochauflösenden strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SIM) abgebildet werden.
    HINWEIS: Zeiss, Nikon und GE Healthcare stellen SIM-Mikroskope her. Befolgen Sie die systemspezifischen Protokolle für die Bilderfassung und -verarbeitung. Verwenden Sie Bildgebungsparameter (Laserleistung, Filtersätze, Belichtungszeit), die für jedes Nup und Fluorophor geeignet sind. Bei der Bildgebung sind die Kanten des Kreises (aus Schritt 1.1) zu vermeiden, da diese Kerne durch den Zentrifugationsschritt (5.4) typischerweise abgeflacht und ausgebreitet werden. Vollständig entfaltete und verarbeitete Bilder können einer Reihe von Analysen unterzogen werden, einschließlich Spot-Erkennung und Volumenmessungen mit Standard-3D-Analysemodulen in FIJI oder Imaris Bildanalysesoftware. Weitere Details zu den Analysemethoden wurden kürzlich veröffentlicht15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Um die NPC- und nukleoplasmatische Verteilung und Expression von POM121 in humanen neuronalen Kernen zu untersuchen, wurden Kontroll- und C9orf72-iPSNs wie zuvor beschrieben unterschieden15. Postmortale humane motorische Kortex und iPSNs am Tag 32 wurden lysiert und wie oben beschrieben einer Zellkernisolierung und Immunfärbung unterzogen. NeuN-positive isolierte Kerne wurden mittels superauflösender strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM) unter Verwendung ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Angesichts der jüngsten Identifizierung von NCT-Defiziten als frühes und prominentes Phänomen bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen 16,27,28,30,31 besteht ein dringender Bedarf, den Mechanismus, durch den diese Pathologie auftritt, gründlich zu untersuchen. Da das NPC und seine einzelnen Nup-Proteine das funktionell...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

Postmortales humanes ZNS-Gewebe wurde von der Johns Hopkins ALS Autopsy Bank und dem Target ALS Postmortem Tissue Core zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde durch das ALSA Milton Safenowitz Postdoctoral Fellowship (ANC) sowie durch Mittel des NIH-NINDS, des Verteidigungsministeriums, der ALS Association, der Muscular Dystrophy Association, F Prime, des Robert Packard Center for ALS Research Answer ALS Program und der Chan Zuckerberg Initiative unterstützt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL conical tubesFisher Scientific14-959-49A
Beckman UltracentrifugeBeckman Coulter
Cell ScrapersSarstedt83.183
CollagenAdvanced Biomatrix5005
CoverslipsMatTekPCS-170-1818
CytofunnelThermo Fisher ScientificA78710020
Cytospin 4Fisher ScientificA78300003
Dounce HomogenizersDWK Life Sciences357542
DTTSigma AldrichD0632
Eppendorf tubesFisher Scientific05-408-129
Goat Anti-Chicken Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21449
Goat Anti-Mouse Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11029
Goat Anti-Mouse Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11031
Goat Anti-Mouse Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21236
Goat Anti-Rabbit Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11034
Goat Anti-Rabbit Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11036
Goat Anti-Rabbit Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21245
Goat Anti-Rat Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11006
Goat Anti-Rat Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11077
Goat Anti-Rat Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21247
HemacytometerFisher Scientific267110
Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Normal Goat SerumVector LabsS-1000
Nuclei PURE Prep Nuclei Isolation KitSigma AldrichNUC201Contains Lysis Buffer, 10% Triton X-100, 2 M Sucrose Gradient, Sucrose Cushion Solution, and Nuclei Storage Buffer; Referenced in protocol as "nuclei isolation kit"
PBSThermo Fisher Scientific10010023
PFAElectron Microscopy Sciences15714-S
Prolong Gold AntifadeInvitrogenP36930Referenced in protocol as "hard mount antifade mounting media"
SW 32 Ti Ultracentrifuge RotorBeckman Coulter369694Referenced in protocol as "ultracentrifuge rotor"
Triton X-100Sigma AldrichT9284
Trypan BlueThermo Fisher Scientific15-250-061
Ultracentrifuge TubesBeckman Coulter344058
Nucleoporin Primary AntibodiesPrimary antibodies suitable for immunofluorescent detection of invidual nucleoporins are available from multiple companies 

Referenzen

  1. Hou, Y., et al. Ageing as a risk factor for neurodegenerative disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (10), 565-581 (2019).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Bang, J., Spina, S., Miller, B. L. Frontotemporal dementia. Lancet. 386 (10004), 1672-1682 (2015).
  4. Blauwendraat, C., Nalls, M. A., Singleton, A. B. The genetic architecture of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 19 (2), 170-178 (2020).
  5. Cacace, R., Sleegers, K., Van Broeckhoven, C. Molecular genetics of early-onset Alzheimer's disease revisited. Alzheimer's & Dementia. 12 (6), 733-748 (2016).
  6. Di Resta, C., Ferrari, M. New molecular approaches to Alzheimer's disease. Clinical Biochemistry. 72, 81-86 (2019).
  7. Karch, C. M., Cruchaga, C., Goate, A. M. Alzheimer's disease genetics: from the bench to the clinic. Neuron. 83 (1), 11-26 (2014).
  8. Kovacs, G. G. Molecular pathology of neurodegenerative diseases: principles and practice. Journal of Clinical Pathology. 72 (11), 725-735 (2019).
  9. McColgan, P., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: a clinical review. European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).
  10. Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. The Lancet. Neurology. 10 (1), 83-98 (2011).
  11. Dugger, B. N., Dickson, D. W. Pathology of neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 028035(2017).
  12. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
  13. DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72 (2), 245-256 (2011).
  14. Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72 (2), 257-268 (2011).
  15. Coyne, A. N., et al. G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD. Neuron. 107 (4), 1124-1140 (2020).
  16. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  17. D'Angelo, M. A., Raices, M., Panowski, S. H., Hetzer, M. W. Age-dependent deterioration of nuclear pore complexes causes a loss of nuclear integrity in postmitotic cells. Cell. 136 (2), 284-295 (2009).
  18. Hetzer, M. W. The role of the nuclear pore complex in aging of post-mitotic cells. Aging (Albany NY). 2 (2), 74-75 (2010).
  19. Savas, J. N., Toyama, B. H., Xu, T., Yates, J. R., Hetzer, M. W. Extremely long-lived nuclear pore proteins in the rat brain. Science. 335 (6071), 942(2012).
  20. Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
  21. Nofrini, V., Di Giacomo, D., Mecucci, C. Nucleoporin genes in human diseases. European Journal of Human Genetics. 24 (10), 1388-1395 (2016).
  22. Sakuma, S., D'Angelo, M. A. The roles of the nuclear pore complex in cellular dysfunction, aging and disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 68, 72-84 (2017).
  23. Basel-Vanagaite, L., et al. Mutated nup62 causes autosomal recessive infantile bilateral striatal necrosis. Annals of Neurology. 60 (2), 214-222 (2006).
  24. Nousiainen, H. O., et al. Mutations in mRNA export mediator GLE1 result in a fetal motoneuron disease. Nature Genetics. 40 (2), 155-157 (2008).
  25. Cronshaw, J. M., Matunis, M. J. The nuclear pore complex: disease associations and functional correlations. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15 (1), 34-39 (2004).
  26. Chou, C. C., et al. TDP-43 pathology disrupts nuclear pore complexes and nucleocytoplasmic transport in ALS/FTD. Nature Neuroscience. 21 (2), 228-239 (2018).
  27. Eftekharzadeh, B., et al. Tau protein disrupts nucleocytoplasmic transport in Alzheimer's disease. Neuron. 99 (5), 925-940 (2018).
  28. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  29. Gasset-Rosa, F., et al. Polyglutamine-expanded huntingtin exacerbates age-related disruption of nuclear integrity and nucleocytoplasmic transport. Neuron. 94 (1), 48-57 (2017).
  30. Grima, J. C., et al. Mutant huntingtin disrupts the nuclear pore complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
  31. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  32. Guo, L., et al. Nuclear-import receptors reverse aberrant phase transitions of RNA-binding proteins with prion-like domains. Cell. 173 (3), 677-692 (2018).
  33. Hofweber, M., et al. Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation. Cell. 173 (3), 706-719 (2018).
  34. Yoshizawa, T., et al. Nuclear Import Receptor Inhibits Phase Separation of FUS through Binding to Multiple Sites. Cell. 173 (3), 693-705 (2018).
  35. Chew, J., et al. Aberrant deposition of stress granule-resident proteins linked to C9orf72-associated TDP-43 proteinopathy. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 9(2019).
  36. Zhang, Y. J., et al. Poly(GR) impairs protein translation and stress granule dynamics in C9orf72-associated frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis. Nat Medicine. 24 (8), 1136-1142 (2018).
  37. Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nature Neuroscience. 19 (5), 668-677 (2016).
  38. Zhang, Y. J., et al. Heterochromatin anomalies and double-stranded RNA accumulation underlie C9orf72 poly(PR) toxicity. Science. 363 (6428), (2019).
  39. Beck, M., Hurt, E. The nuclear pore complex: understanding its function through structural insight. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (2), 73-89 (2017).
  40. Lin, D. H., Hoelz, A. The structure of the nuclear pore complex (an update). Annual Review of Biochemistry. 88, 725-783 (2019).
  41. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissue-specific and developmental functions. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (11), 687-699 (2012).
  42. Kinoshita, Y., Kalir, T., Dottino, P., Kohtz, D. S. Nuclear distributions of NUP62 and NUP214 suggest architectural diversity and spatial patterning among nuclear pore complexes. PLoS One. 7 (4), 36137(2012).
  43. Ori, A., et al. Cell type-specific nuclear pores: a case in point for context-dependent stoichiometry of molecular machines. Molecular Systems Biology. 9, 648(2013).
  44. Rajoo, S., Vallotton, P., Onischenko, E., Weis, K. Stoichiometry and compositional plasticity of the yeast nuclear pore complex revealed by quantitative fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), 3969-3977 (2018).
  45. Li, C., Goryaynov, A., Yang, W. The selective permeability barrier in the nuclear pore complex. Nucleus. 7 (5), 430-446 (2016).
  46. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complexes and regulation of gene expression. Current Opinion in Cell Biology. 46, 26-32 (2017).
  47. Pascual-Garcia, P., Capelson, M. Nuclear pores in genome architecture and enhancer function. Current Opinion in Cell Biology. 58, 126-133 (2019).
  48. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  49. Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nature Neuroscience. 16 (7), 790-797 (2013).
  50. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  51. Wu, Y., Shroff, H. Faster, sharper, and deeper: structured illumination microscopy for biological imaging. Nature Methods. 15 (12), 1011-1019 (2018).
  52. Hampoelz, B., et al. Pre-assembled nuclear pores insert into the nuclear envelope during early development. Cell. 166 (3), 664-678 (2016).
  53. Hampoelz, B., et al. Nuclear pores assemble from nucleoporin condensates during oogenesis. Cell. 179 (3), 671-686 (2019).
  54. Agote-Aran, A., et al. Spatial control of nucleoporin condensation by fragile X-related proteins. The EMBO Journal. 39 (20), 104467(2020).
  55. Colombi, P., Webster, B. M., Fröhlich, F., Lusk, C. P. The transmission of nuclear pore complexes to daughter cells requires a cytoplasmic pool of Nsp1. The Journal of Cell Biology. 203 (2), 215-232 (2013).
  56. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  57. Löschberger, A., Franke, C., Krohne, G., van de Linde, S., Sauer, M. Correlative super-resolution fluorescence and electron microscopy of the nuclear pore complex with molecular resolution. Journal of Cell Science. 127, Pt 20 4351-4355 (2014).
  58. Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. Journal of Cell Science. 125, Pt 3 570-575 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

Zellkernisolierunghochaufl sende MikroskopieKernporenkomplexNukleoporinproteineNeurodegenerationAmyotrophe LateralskleroseAlzheimer KrankheitFrontotemporale DemenzHuntington KrankheitNukleozytoplasmatischer TransportMikroskopietechniken3D VisualisierungIPSC abgeleitete ZNS Zellen

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten