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Resumo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho otimizado para isolamento de núcleos e microscopia de iluminação estruturada de super-resolução para avaliar nucleoporinas individuais dentro do nucleoplasma e NPCs em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas e tecidos humanos post-mortem.

Resumo

O complexo de poros nucleares (NPC) é uma estrutura macromolecular complexa composta por múltiplas cópias de ~ 30 proteínas nucleoporinas diferentes (Nups). Coletivamente, esses Nups funcionam para regular a organização do genoma, a expressão gênica e o transporte nucleocitoplasmático (NCT). Recentemente, defeitos na NCT e alterações em Nups específicos foram identificados como patologias precoces e proeminentes em várias doenças neurodegenerativas, incluindo Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), Doença de Alzheimer (DA)/Demência Frontotemporal (FTD) e Doença de Huntington (HD). Os avanços na microscopia de luz e eletrônica permitem um exame completo das estruturas subcelulares, incluindo o NPC e seus constituintes Nup, com maior precisão e resolução. Das técnicas comumente usadas, a microscopia de iluminação estruturada de super-resolução (SIM) oferece a oportunidade incomparável de estudar a localização e expressão de Nups individuais usando estratégias convencionais de marcação baseadas em anticorpos. O isolamento de núcleos antes do SIM permite a visualização de proteínas Nup individuais dentro do NPC e do nucleoplasma no espaço 3D totalmente reconstruído com precisão. Este protocolo descreve um procedimento para isolamento de núcleos e SIM para avaliar a expressão e distribuição de Nup em células do SNC derivadas de iPSC humanas e tecidos post-mortem.

Introdução

A prevalência de doenças neurodegenerativas relacionadas à idade está aumentando à medida que a população envelhece1. Embora os fundamentos genéticos e as características patológicas sejam bem caracterizados, os eventos moleculares precisos que levam à lesão neuronal permanecem pouco compreendidos2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Recentemente, um G4C2 A expansão da repetição de hexanucleotídeos no primeiro íntron do gene C9orf72 foi identificada como a causa genética mais comum das doenças neurodegenerativas relacionadas Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) e Demência Frontotemporal (FTD)13,14. Vários estudos agora apóiam um papel central para interrupções na maquinaria de transporte nuclear, incluindo complexos de poros nucleares (NPCs) e receptores de transporte nuclear (NTRs, carioferinas), como causadores de C9orf72 ALS15,16. Em células que não se dividem dentro do cérebro de ratos, as nucleoporinas de andaime (Nups) têm vida extremamente longa. Como resultado, alterações nos NPCs e NCT foram relatadas durante o envelhecimento17,18,19,20. Além disso, algumas nucleoporinas ou transportinas, quando mutadas, estão ligadas a doenças neurológicas específicas21,22. Por exemplo, mutações no Nup62 têm sido associadas à Necrose Estriatal Bilateral Infantil (IBSN), um distúrbio neurológico que afeta o núcleo caudado e o putâmen23; mutações em Gle1 foram implicadas na doença do neurônio motor fetal Síndrome de Contratura Congênita Letal Humana-1 (LCCS1)24; e mutações em Aladin são causadoras da Síndrome Triplo A25. Alterações na NCT funcional são exacerbadas em doenças neurodegenerativas relacionadas à idade, como ELA, Doença de Huntington (HD) e Doença de Alzheimer (DA)16,26,27,28,29,30,31. Além disso, Nups e NTRs específicos foram relatados como modificadores da toxicidade mediada por C9orf72 no Drosophila olho28 ou modificar bioquimicamente o estado de agregação de proteínas ligadas a doenças, como FUS e tau27,32,33,34. Coletivamente, esses estudos iniciais sugerem que a NCT alterada pode ser uma característica patológica primária e precoce da ELA e da FTD. Estudos em sistema de modelo baseado em superexpressão sugeriram que a localização incorreta de Nups e carioferinas específicos pode afetar a NCT16,35,36,37,38. No entanto, esses estudos patológicos não vinculam realmente os acúmulos citoplasmáticos de proteínas NPC a defeitos na estrutura ou função do NPC. Por exemplo, essa patologia pode simplesmente refletir a desregulação de pools citoplasmáticos de proteínas Nup com pouco impacto na composição e função do NPC. Em contraste, um estudo recente empregando microscopia de iluminação estruturada de super-resolução (SIM) demonstra o surgimento de uma lesão significativa no próprio NPC, caracterizada pela redução nos níveis específicos de Nup no nucleoplasma e NPCs de neurônios humanos C9orf72 ALS / FTD, levando a uma função NPC alterada como um evento inicial precoce em cascatas de doenças patogênicas15.

A passagem de macromoléculas entre o núcleo e o citoplasma é governada pelo complexo de poros nucleares (NPC). O NPC é um grande complexo macromolecular embutido no envelope nuclear composto por múltiplas cópias de 30 proteínas nucleoporinas (Nups) 39 , 40 , 41 . Embora a estequiometria Nup varie entre os tipos de células 42,43,44, a manutenção da composição geral do NPC é crítica para NCT, organização do genoma e viabilidade celular geral 39,41,45,46. Como resultado, a composição alterada do NPC e os defeitos subsequentes no transporte funcional provavelmente afetarão uma infinidade de funções celulares a jusante. Os constituintes Nup do NPC são altamente organizados em múltiplos subcomplexos, incluindo o anel citoplasmático e filamentos, canal central, anel externo, anel interno, anel transmembrana e cesta nuclear. Coletivamente, os Nups de andaime dos anéis interno, externo e transmembrana ancoram NPCs dentro do envelope nuclear e fornecem pontos de ancoragem para Nups do anel citoplasmático, canal central e cesta nuclear. Enquanto moléculas pequenas (<40-60 kD) podem se difundir passivamente através do NPC, o transporte ativo de cargas maiores é facilitado por interações entre receptores de transporte nuclear (NTRs, carioferinas) e os Nups FG dos filamentos citoplasmáticos, canal central e cesta nuclear 39,40,41,45. Além disso, um punhado de Nups também pode funcionar fora do NPC, dentro do nucleoplasma, para regular a expressão gênica46,47.

Dado que a dimensão lateral de um único NPC humano é de aproximadamente 100-120 nm40, a microscopia de campo amplo ou confocal padrão é insuficiente para resolver NPCs individuais48. Técnicas de microscopia eletrônica (EM), como TEM ou SEM, são frequentemente usadas para avaliar a estrutura geral dos NPCs39,40. Apesar das vantagens dessas técnicas para resolver a ultraestrutura do NPC, elas são menos comumente usadas para avaliar a presença de proteínas Nup individuais dentro do NPC. As limitações técnicas de combinar anticorpos ou marcação baseada em tags com essas tecnologias de ponta, TEM e SEM, nem sempre permitem uma avaliação precisa e confiável dos próprios Nups individuais dentro dos NPCs ou do nucleoplasma. Além disso, essas técnicas podem ser tecnicamente desafiadoras e ainda não são amplamente acessíveis a todos os pesquisadores. No entanto, avanços recentes em microscopia de luz e fluorescência aumentaram a acessibilidade das tecnologias de imagem de super-resolução. Especificamente, o SIM oferece a oportunidade incomparável de obter imagens de Nups individuais com uma resolução que se aproxima das dimensões laterais de um NPC humano 40,48,49,50,51. Em contraste com outras abordagens de super-resolução, como microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) e depleção de emissão estimulada (STED), o SIM é compatível com a imunocoloração convencional baseada em anticorpos49. Assim, o SIM permite uma análise abrangente de todos os Nups para os quais um anticorpo Nup específico está disponível. A capacidade de amostrar e obter imagens de vários Nups diferentes na mesma preparação oferece vantagens significativas para outros métodos de imagem ao pesquisar as muitas proteínas que compõem o NPC. O procedimento a seguir detalha um protocolo otimizado para avaliar componentes Nup individuais do NPC usando núcleos isolados de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) (iPSNs) e tecidos post-mortem do sistema nervoso central humano (SNC).

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Protocolo

Todas as amostras de sangue para geração de iPSC e coletas de tecido autopsiado são aprovadas pelo Johns Hopkins IRB com supervisão ética da Johns Hopkins. Todas as informações do paciente são compatíveis com HIPPA. O protocolo a seguir segue todos os procedimentos de biossegurança da Johns Hopkins.

1. Preparação de lâminas para imunocoloração e imagem

  1. Posicione uma lâmina de microscópio de vidro carregada positivamente em um citofunil vazio e desenhe um círculo com uma caneta de barreira hidrofóbica para delinear uma área para depositar os núcleos.
  2. Adicione 50 μL de solução de colágeno 1 mg / mL (diluída em 1x PBS) ao centro do círculo desenhado na etapa 1.1 e incube em temperatura ambiente por 5 min.
  3. Aspire a solução de colágeno e deixe as lâminas secarem ao ar livre em temperatura ambiente por cerca de 1 h.

2. Preparação de tampão de lise e gradientes de sacarose

  1. Preparar as soluções de tampão de lise e gradiente de sacarose de acordo com o protocolo do kit de isolamento de núcleos.
    1. Para cada amostra, prepare um tubo cônico de 50 mL de tampão de lise combinando 11 mL do tampão de lise fornecido, 110 μL da solução Triton X-100 a 10% fornecida e 11 μL de DTT 1 M recém-preparado ou descongelado (Ditiotreitol).
    2. Para cada amostra, use um tubo cônico de 50 mL para preparar uma solução de almofada de sacarose 1,85 M, combinando 27,75 mL da solução de almofada de sacarose 2 M fornecida, 2,25 mL do tampão de almofada de sacarose fornecido e 30 μL de DTT 1 M recém-preparado ou descongelado.
      NOTA: Uma solução de almofada de sacarose de 1,85 M é ideal para iPSNs e tecido do SNC humano post-mortem, mas ajuste-a para outros tipos de células ou amostras de tecido. Detalhes adicionais para células HEK293, astrócitos derivados de iPSC e enriquecimento de núcleos de oligodendrócitos de tecidos do SNC post-mortem foram publicados recentemente15.
  2. Misture suavemente as soluções de tampão de lise e almofada de sacarose invertendo os tubos cônicos e armazene-os no gelo.

3. Lise de iPSNs e tecido humano do SNC post-mortem

  1. Antes de prosseguir com a lise, colocar o rotor da ultracentrífuga (sem porta-amostras) na ultracentrífuga e deixá-lo pré-arrefecer a 4 °C.
  2. Lise de iPSNs.
    NOTA: Os protocolos de lise diferem para iPSNs e tecido do SNC humano post-mortem. Siga o protocolo para o tipo de amostra especificado abaixo (etapa 3.2: iPSNs, etapa 3.3: tecido humano do SNC post-mortem).
    1. Remova os iPSNs da incubadora e aspire a mídia. Enxágue brevemente com 1x PBS e adicione o tampão de lise diretamente ao poço ou placa.
      NOTA: Tome cuidado para enxaguar adequadamente os iPSNs com uma quantidade suficiente de 1x PBS para remover detritos e células mortas. O volume de tampão de lise a ser adicionado às placas iPSN varia. Consulte a Tabela 1. Certifique-se de que o material de partida seja de > 2,5 milhões de iPSNs.
    2. Raspe os iPSNs com um raspador de células e transfira-os para o tampão de lise restante no tubo cônico de 50 mL.
    3. Tampe cada tubo cônico e vortex as amostras por 20 s para facilitar a lise do iPSN.
    4. Deixe as amostras no gelo por 1-2 min antes de prosseguir.
  3. Lise de tecidos humanos do SNC post-mortem.
    1. Pese ~ 100 mg de tecido humano do SNC post-mortem congelado cortando com uma lâmina de barbear em uma placa de Petri colocada sobre uma cama de gelo seco. Certifique-se de trabalhar em uma superfície cercada por absorventes descartáveis para evitar a contaminação local do tecido. Preste atenção às dissecções específicas da substância cinzenta versus substância branca (por exemplo, cornija de lareira cortical versus substância branca subjacente) visíveis no momento da dissecção do tecido.
      NOTA: Use o EPI apropriado, incluindo roupas de proteção para os olhos e luvas ao manusear amostras de tecido humano post-mortem congeladas. Esta etapa também pode ser concluída com antecedência e alíquotas de tecido armazenadas a -80 °C. 50 mg é uma quantidade suficiente para o isolamento dos núcleos. No entanto, mais de 100 mg de tecido geralmente produzem isolamento incompleto de núcleos, como evidenciado pela presença de citoplasma intacto ao redor de alguns núcleos.
    2. Prepare o homogeneizador Dounce limpando e enxaguando abundantemente com água destilada. Resfrie o homogeneizador colocando-o no gelo.
    3. Adicione 100 mg de tecido ao homogeneizador Dounce recém-limpo, enxaguado e resfriado (com gelo) contendo 2 mL do tampão de lise preparado.
    4. Homogeneizar no homogeneizador Dounce usando o procedimento padrão no gelo.
      NOTA: Normalmente, 10-20 golpes por pilão são suficientes para se mover através da amostra sem resistência.
    5. Transfira 2 mL de homogeneizado cerebral humano post-mortem para os 9 mL restantes de tampão de lise em tubos cônicos.
    6. Vortex vigorosamente por 30 s e deixe descansar no gelo por 5 min para facilitar a lise.

4. Isolamento de núcleos de iPSNs e tecido humano do SNC post-mortem

  1. Colocar 10 ml de solução de almofada de sacarose a 1,85 M (produzida no passo 2.1.2) no fundo de um tubo de ultracentrífuga e adicionar 18 ml de solução de almofada de sacarose a 1,85 M a cada lisado.
  2. Misture suavemente a solução de almofada de lisado / sacarose (combinada na etapa 4.1) invertendo o tubo cônico de 50 mL.
  3. Adicione lentamente 28 mL de mistura de solução de lisado / almofada de sacarose ao topo dos 10 mL de solução de almofada de sacarose 1,85 M no tubo de ultracentrífuga (da etapa 4.1).
    NOTA: Há um total de 29 mL de mistura de solução de lisado / almofada de sacarose no tubo cônico de 50 mL (etapas 4.1-4.2). Deixe 1 mL desta mistura de solução de lisado / almofada de sacarose no tubo cônico de 50 mL. Isso garante uma pipetagem precisa e consistente entre todas as amostras devido à viscosidade da solução de almofada de sacarose.
  4. Coloque os tubos de ultracentrífuga nos suportes e adicione uma solução adicional de almofada de sacarose 1,85 M (feita na etapa 2.1.2) conforme necessário para equilibrar as amostras.
  5. Colocar os porta-amostras no rotor da ultracentrífuga refrigerada e centrifugar a 30.000 x g, 4 °C durante 45 min.
  6. Retirar os tubos de ultracentrífuga dos porta-amostras e rejeitar os sobrenadantes. Os núcleos serão visíveis como pellets nas partes inferiores do tubo da ultracentrífuga.
  7. Ressuspenda os pellets de núcleos em 1 mL do tampão de armazenamento de núcleos fornecido por vórtice e transfira para um tubo de microcentrífuga.
  8. Centrifugue os tubos da microcentrífuga a 2.500 x g, 4 °C por 5 min.
  9. Remova o sobrenadante e ressuspenda os núcleos por vórtice em 1 mL fresco do tampão de armazenamento de núcleos fornecido.
  10. Proceder à imunocoloração ou armazenar os núcleos a -80 °C.
    NOTA: Os núcleos podem ser armazenados a -80 °C por até 6 meses e submetidos a dois ciclos de congelamento/descongelamento antes que a integridade estrutural seja comprometida.

5. Imunomarcação dos núcleos isolados

  1. Pegue uma alíquota de 10 μL da suspensão de núcleos e conte usando um hemacitômetro ou um contador de células automatizado.
  2. Monte as lâminas preparadas (da etapa 1.3) nos citofunis.
  3. Para cada citofunil, coloque 200 μL de tampão de armazenamento de núcleos frescos e ~ 100.000 núcleos.
  4. Gire suavemente os núcleos nas lâminas, colocando os citofunis em um citospin e centrifugando por 3 min a 100 x g.
  5. Solte os citofunis e adicione imediatamente ~ 100 μL de PFA (paraformaldeído) a 4% nas lâminas e incube por 15 min em temperatura ambiente.
    NOTA: Os núcleos também podem ser fixados com metanol. Use o método de fixação apropriado para cada anticorpo. Se estiver usando metanol, pule a etapa de permeabilização (5.7). Os citofunis são de uso único; descarte-os neste momento.
  6. Lave os núcleos 3x por 5 min com 1x PBS.
  7. Permeabilize os núcleos com 0,1% de Triton X-100 em 1x PBS por 10 min em temperatura ambiente.
  8. Bloqueie os núcleos em solução em bloco (soro de cabra ou burro a 10% em 1x PBS) por 30 min em temperatura ambiente.
  9. Incubar os núcleos com anticorpos primários diluídos em solução em bloco durante a noite a 4 °C.
  10. Lave os núcleos 3x por 5 min com 1x PBS.
  11. Incubar os núcleos com anticorpos secundários diluídos em solução em bloco por 1 h à temperatura ambiente.
    NOTA: Os anticorpos secundários Alexa Fluor 488, 568 e 647 são preferidos.
  12. Lave os núcleos 3x por 5 min com 1x PBS.
  13. OPCIONAL: Incube os núcleos por 5 min com DAPI ou Hoechst seguido por duas lavagens adicionais de 5 min com 1x PBS.
  14. Segure um pano sem fiapos na borda do círculo contendo núcleos para remover completamente a última lavagem PBS.
  15. Adicione 1 gota (~10 μL) de uma mídia de montagem antidesbotamento de montagem rígida (sem DAPI) a cada lâmina e coloque suavemente lamínulas quadradas de alta tolerância de 18 mm x 18 mm em cada lâmina.
    NOTA: Ao usar uma mídia de montagem rígida, a vedação da lâmina não é necessária se as lâminas forem fotografadas dentro de um período de tempo apropriado. A imunorreatividade de Nup normalmente permaneceu estável em lâminas não seladas armazenadas a 4 ° C por ~ 6 meses. No entanto, as bordas da lamínula podem ser seladas com uma fina camada de esmalte se for usada uma mídia de montagem úmida ou para armazenamento prolongado.
  16. Mantenha as lâminas protegidas da luz e deixe-as curar durante a noite à temperatura ambiente.
  17. A imagem dos núcleos pode ser obtida por microscopia de iluminação estruturada (SIM) de super-resolução.
    NOTA: Zeiss, Nikon e GE Healthcare fabricam microscópios SIM. Siga os protocolos específicos do sistema para aquisição e processamento de imagens. Use parâmetros de imagem (potência do laser, conjuntos de filtros, tempo de exposição) apropriados para cada Nup e fluoróforo. Ao obter imagens, evite bordas do círculo (da etapa 1.1), pois esses núcleos são normalmente achatados e espalhados como resultado da etapa de centrifugação (5.4). Imagens totalmente desconvolvidas e processadas podem ser submetidas a uma série de análises, incluindo detecção de pontos e medições de volume usando módulos de análise 3D padrão no software de análise de imagem FIJI ou Imaris. Detalhes adicionais sobre métodos de análise foram publicados recentemente15.

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Resultados

Para examinar a distribuição e expressão de NPC e nucleoplasmática de POM121 em núcleos neuronais humanos, os iPSNs de controle e C9orf72 foram diferenciados conforme descrito anteriormente15. O córtex motor humano post-mortem e os iPSNs do dia 32 foram lisados e submetidos ao isolamento dos núcleos e imunocoloração conforme descrito acima. Os núcleos isolados positivos de NeuN foram fotografados por microscopia de iluminação estruturada de super-resol...

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Discussão

Dada a recente identificação de déficits de NCT como um fenômeno precoce e proeminente em múltiplas doenças neurodegenerativas 16,27,28,30,31, existe uma necessidade crítica de examinar minuciosamente o mecanismo pelo qual essa patologia ocorre. Como o NPC e suas proteínas Nup individuais controlam criticamente o NCT f...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os tecidos humanos post-mortem do SNC foram fornecidos pelo Johns Hopkins ALS Autopsy Bank e pelo Target ALS Postmortem Tissue Core. Este trabalho foi apoiado pela ALSA Milton Safenowitz Postdoctoral Fellowship (ANC), bem como financiamento do NIH-NINDS, Departamento de Defesa, ALS Association, Muscular Dystrophy Association, F Prime, The Robert Packard Center for ALS Research Answer ALS Program e a Chan Zuckerberg Initiative.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL conical tubesFisher Scientific14-959-49A
Beckman UltracentrifugeBeckman Coulter
Cell ScrapersSarstedt83.183
CollagenAdvanced Biomatrix5005
CoverslipsMatTekPCS-170-1818
CytofunnelThermo Fisher ScientificA78710020
Cytospin 4Fisher ScientificA78300003
Dounce HomogenizersDWK Life Sciences357542
DTTSigma AldrichD0632
Eppendorf tubesFisher Scientific05-408-129
Goat Anti-Chicken Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21449
Goat Anti-Mouse Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11029
Goat Anti-Mouse Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11031
Goat Anti-Mouse Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21236
Goat Anti-Rabbit Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11034
Goat Anti-Rabbit Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11036
Goat Anti-Rabbit Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21245
Goat Anti-Rat Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11006
Goat Anti-Rat Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11077
Goat Anti-Rat Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21247
HemacytometerFisher Scientific267110
Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Normal Goat SerumVector LabsS-1000
Nuclei PURE Prep Nuclei Isolation KitSigma AldrichNUC201Contains Lysis Buffer, 10% Triton X-100, 2 M Sucrose Gradient, Sucrose Cushion Solution, and Nuclei Storage Buffer; Referenced in protocol as "nuclei isolation kit"
PBSThermo Fisher Scientific10010023
PFAElectron Microscopy Sciences15714-S
Prolong Gold AntifadeInvitrogenP36930Referenced in protocol as "hard mount antifade mounting media"
SW 32 Ti Ultracentrifuge RotorBeckman Coulter369694Referenced in protocol as "ultracentrifuge rotor"
Triton X-100Sigma AldrichT9284
Trypan BlueThermo Fisher Scientific15-250-061
Ultracentrifuge TubesBeckman Coulter344058
Nucleoporin Primary AntibodiesPrimary antibodies suitable for immunofluorescent detection of invidual nucleoporins are available from multiple companies 

Referências

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