JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücre türevli nöronlarda ve ölüm sonrası insan dokularında nükleoplazma ve NPC'ler içindeki bireysel nükleoporinleri değerlendirmek için çekirdek izolasyonu ve süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu için optimize edilmiş bir iş akışını tanımlar.

Özet

Nükleer gözenek kompleksi (NPC), ~30 farklı nükleoporin proteininin (Nup) çoklu kopyalarından oluşan karmaşık bir makromoleküler yapıdır. Toplu olarak, bu Nup'lar genom organizasyonunu, gen ekspresyonunu ve nükleositoplazmik taşımayı (NCT) düzenleme işlevi görür. Son zamanlarda, Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS), Alzheimer Hastalığı (AD)/Frontotemporal Demans (FTD) ve Huntington Hastalığı (HD) dahil olmak üzere çoklu nörodejeneratif hastalıklarda NCT'deki defektler ve spesifik Nup'lardaki değişiklikler erken ve belirgin patolojiler olarak tanımlanmıştır. Hem ışık hem de elektron mikroskobundaki gelişmeler, NPC ve Nup bileşenleri de dahil olmak üzere hücre altı yapıların daha yüksek hassasiyet ve çözünürlükle kapsamlı bir şekilde incelenmesine izin verir. Yaygın olarak kullanılan tekniklerden, süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM), geleneksel antikor bazlı etiketleme stratejilerini kullanarak bireysel Nup'ların lokalizasyonunu ve ekspresyonunu incelemek için eşsiz bir fırsat sunar. SIM'den önce çekirdeklerin izolasyonu, NPC ve nükleoplazma içindeki bireysel Nup proteinlerinin tam ve doğru bir şekilde yeniden yapılandırılmış 3B uzayda görselleştirilmesini sağlar. Bu protokol, insan iPSC'den türetilmiş CNS hücrelerinde ve postmortem dokularda Nup ekspresyonunu ve dağılımını değerlendirmek için çekirdek izolasyonu ve SIM için bir prosedürü tanımlar.

Giriş

Yaşa bağlı nörodejeneratif hastalıkların prevalansı, nüfus yaşlandıkça artmaktadır1. Genetik temeller ve patolojik özellikler iyi karakterize edilmiş olsa da, nöronal hasara yol açan kesin moleküler olaylar tam olarak anlaşılamamıştır2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Son zamanlarda, bir G4C2 C9orf72 geninin ilk intronunda heksannükleotid tekrar genişlemesi, ilgili nörodejeneratif hastalıklar olan Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) ve Frontotemporal Demans (FTD) 'nın en sık genetik nedeni olarak tanımlandı13,14. Nükleer gözenek kompleksleri (NPC'ler) ve nükleer taşıma reseptörleri (NTR'ler, karyoferinler) dahil olmak üzere nükleer taşıma mekanizmasındaki bozulmalar için C9orf72 ALS'ye neden olan birçok çalışma artık merkezi bir rolü desteklemektedir15,16. Sıçan beynindeki bölünmeyen hücrelerde, iskele nükleoporinleri (Nup'lar) son derece uzun ömürlüdür. Sonuç olarak, yaşlanma sırasında NPC'lerde ve NCT'de değişiklikler bildirilmiştir17,18,19,20. Ayrıca, bazı nükleoporinler veya transportinler, mutasyona uğradığında, spesifik nörolojik hastalıklarla bağlantılıdır21,22. Örneğin, Nup62'deki mutasyonlar, kaudat çekirdeği ve putamen'i etkileyen nörolojik bir bozukluk olan İnfantil Bilateral Striatal Nekroz (IBSN) ile ilişkilendirilmiştir23; Gle1'deki mutasyonlar, fetal motor nöron hastalığı İnsan Ölümcül Konjenital Konjenital Kontraktür Sendromu-1 (LCCS1) ile ilişkilendirilmiştir24; ve Aladin'deki mutasyonlar Triple-A Sendromuna neden olur25. ALS, Huntington Hastalığı (HD) ve Alzheimer Hastalığı (AD) gibi yaşa bağlı nörodejeneratif hastalıklarda fonksiyonel NCT'deki değişiklikler daha da kötüleşir16,26,27,28,29,30,31. Ek olarak, spesifik Nup'lar ve NTR'ler, C9orf72 aracılı toksisitenin değiştiricileri olarak rapor edilmiştir. Drosophila göz28 veya FUS ve tau gibi hastalığa bağlı proteinlerin agregasyon durumunu biyokimyasal olarak değiştirmek27,32,33,34. Toplu olarak, bu erken çalışmalar, değişmiş NCT'nin ALS ve FTD'nin birincil ve erken patolojik bir özelliği olabileceğini düşündürmektedir. Aşırı ekspresyon tabanlı model sisteminde yapılan çalışmalar, spesifik Nup'ların ve karyopherinlerin yanlış lokalizasyonunun NCT'yi etkileyebileceğini düşündürmektedir16,35,36,37,38. Bununla birlikte, bu patoloji çalışmaları aslında NPC proteinlerinin sitoplazmik birikimlerini NPC'nin yapısındaki veya işlevindeki kusurlarla ilişkilendirmez. Örneğin, bu patoloji, NPC bileşimi ve işlevi üzerinde çok az etkisi olan Nup proteinlerinin sitoplazmik havuzlarının düzensizliğini yansıtabilir. Buna karşılık, süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) kullanan yeni bir çalışma, insan C9orf72 ALS/FTD nöronlarının nükleoplazması ve NPC'leri içindeki spesifik Nup seviyelerinde azalma ile karakterize edilen NPC'nin kendisinde önemli bir yaralanmanın ortaya çıktığını göstermektedir15.

Makromoleküllerin çekirdek ve sitoplazma arasındaki geçişi, nükleer gözenek kompleksi (NPC) tarafından yönetilir. NPC, 30 nükleoporin proteininin (Nup) çoklu kopyalarından oluşan nükleer zarfa gömülü büyük bir makromoleküler komplekstir39,40,41. Nup stokiyometrisi hücre tipleri arasında farklılık göstersede 42,43,44, genel NPC bileşiminin sürdürülmesi NCT, genom organizasyonu ve genel hücresel canlılık için kritik öneme sahiptir 39,41,45,46. Sonuç olarak, değişmiş NPC bileşimi ve fonksiyonel taşımadaki müteakip kusurların sayısız aşağı akış hücresel fonksiyonunu etkilemesi muhtemeldir. NPC'nin Nup bileşenleri, sitoplazmik halka ve filamentler, merkezi kanal, dış halka, iç halka, transmembran halka ve nükleer sepet dahil olmak üzere çoklu alt kompleksler halinde yüksek oranda organize edilmiştir. Toplu olarak, iç, dış ve transmembran halkalarının iskele Nup'ları, NPC'leri nükleer zarf içinde sabitler ve sitoplazmik halka, merkezi kanal ve nükleer sepetin Nup'ları için bağlantı noktaları sağlar. Küçük moleküller (<40-60 kD) NPC boyunca pasif olarak yayılabilirken, daha büyük yüklerin aktif taşınması, nükleer taşıma reseptörleri (NTR'ler, karyoferinler) ve sitoplazmik filamentlerin, merkezi kanalın ve nükleer sepetin FG Nup'ları arasındaki etkileşimlerle kolaylaştırılır 39,40,41,45. Ayrıca, bir avuç Nup, gen ekspresyonunu düzenlemek için NPC'nin dışında, nükleoplazma içinde ek olarak işlev görebilir 46,47.

Tek bir insan NPC'sinin yanal boyutunun yaklaşık 100-120 nm40 olduğu göz önüne alındığında, standart geniş alan veya konfokal mikroskopi, bireysel NPC'leri48 çözmek için yetersizdir. TEM veya SEM gibi elektron mikroskobu (EM) teknikleri, NPC'lerin genel yapısını değerlendirmek için sıklıkla kullanılır39,40. NPC üst yapısını çözmek için bu tekniklerin avantajlarına rağmen, NPC içindeki bireysel Nup proteinlerinin varlığını değerlendirmek için daha az yaygın olarak kullanılırlar. Antikor veya etiket tabanlı etiketlemeyi bu en son teknolojiler, TEM ve SEM ile birleştirmenin teknik sınırlamaları, NPC'ler veya nükleoplazma içindeki bireysel Nup'ların kendilerinin her zaman doğru ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesine izin vermez. Ayrıca, bu teknikler teknik olarak zorlayıcı olabilir ve henüz tüm araştırmacılar için geniş çapta erişilebilir değildir. Bununla birlikte, ışık ve floresan mikroskobundaki son gelişmeler, süper çözünürlüklü görüntüleme teknolojilerinin erişilebilirliğini artırmıştır. Spesifik olarak, SIM, bir insan NPC40,48,49,50,51'in yanal boyutlarına yaklaşan bir çözünürlükle bireysel Nup'ları görüntülemek için benzersiz bir fırsat sunar. Stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) ve uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) gibi diğer süper çözünürlüklü yaklaşımların aksine, SIM geleneksel antikor bazlı immün boyama49 ile uyumludur. Böylece SIM, belirli bir Nup antikorunun mevcut olduğu tüm Nup'ların kapsamlı bir analizine izin verir. Aynı preparatta birden fazla farklı Nup'u örnekleme ve görüntüleme yeteneği, NPC'yi oluşturan birçok proteini incelerken diğer görüntüleme yöntemlerine önemli avantajlar sağlar. Aşağıdaki prosedür, indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevli nöronlardan (iPSN'ler) ve ölüm sonrası insan merkezi sinir sistemi (CNS) dokularından izole edilen çekirdekleri kullanarak NPC'nin bireysel Nup bileşenlerini değerlendirmek için optimize edilmiş bir protokolü detaylandırır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

iPSC üretimi ve otopsi doku koleksiyonları için tüm kan örnekleri, Johns Hopkins etik gözetimi ile Johns Hopkins IRB tarafından onaylanmıştır. Tüm hasta bilgileri HIPPA uyumludur. Aşağıdaki protokol tüm Johns Hopkins biyogüvenlik prosedürlerine uygundur.

1. İmmün boyama ve görüntüleme için slaytların hazırlanması

  1. Pozitif yüklü bir cam mikroskop slaytını boş bir hücre hunisine yerleştirin ve çekirdekleri biriktirmek için bir alanın ana hatlarını çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemle bir daire çizin.
  2. Adım 1.1'de çizilen dairenin merkezine 50 μL 1 mg / mL kollajen çözeltisi (1x PBS'de seyreltilmiş) ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  3. Kollajen solüsyonunu aspire edin ve slaytları oda sıcaklığında yaklaşık 1 saat kurumaya bırakın.

2. Lizis tamponu ve sükroz gradyanlarının hazırlanması

  1. Lizis tamponunu ve sükroz gradyan çözeltilerini çekirdek izolasyon kiti protokolüne göre hazırlayın.
    1. Her numune için, 11 mL verilen lizis tamponunu, 110 μL sağlanan %10 Triton X-100 solüsyonunu ve 11 μL taze hazırlanmış veya çözülmüş 1 M DTT'yi (Dithiothreitol) birleştirerek 50 mL'lik konik bir lizis tamponu tüpü hazırlayın.
    2. Her numune için, 27,75 mL verilen 2 M sükroz tampon solüsyonu, 2,25 mL verilen sükroz tampon tamponu ve 30 μL taze hazırlanmış veya çözülmüş 1 M DTT'yi birleştirerek 1,85 M sükroz yastık solüsyonu hazırlamak için 50 mL'lik bir konik tüp kullanın.
      NOT: 1.85 M'lik bir sükroz yastık çözeltisi, iPSN'ler ve ölüm sonrası insan CNS dokusu için idealdir, ancak diğer hücre tipleri veya doku örnekleri için ayarlayın. HEK293 hücreleri, iPSC'den türetilmiş astrositler ve postmortem CNS dokularından oligodendrosit çekirdeklerinin zenginleştirilmesi için ek ayrıntılar yakın zamanda yayınlanmıştır15.
  2. Lizis tamponu ve sükroz yastık çözeltilerini konik tüpleri ters çevirerek nazikçe karıştırın ve buz üzerinde saklayın.

3. iPSN'lerin ve postmortem insan CNS dokusunun parçalanması

  1. Parçalamaya devam etmeden önce, ultrasantrifüj rotorunu (numune tutucular olmadan) ultrasantrifüje yerleştirin ve 4 °C'ye kadar ön soğumaya bırakın.
  2. iPSN'lerin analizi.
    NOT: Lizis protokolleri, iPSN'ler ve postmortem insan CNS dokusu için farklılık gösterir. Aşağıda belirtilen numune tipi için protokolü izleyin (adım 3.2: iPSN'ler, adım 3.3: ölüm sonrası insan CNS dokusu).
    1. iPSN'leri inkübatörden çıkarın ve ortamı aspire edin. 1x PBS ile kısa bir süre durulayın ve lizis tamponunu doğrudan kuyuya veya plakaya ekleyin.
      NOT: Kalıntıları ve ölü hücreleri temizlemek için iPSN'leri yeterli miktarda 1x PBS ile yeterince durulamaya dikkat edin. iPSN plakalarına eklenecek lizis tamponunun hacmi değişecektir. Lütfen Tablo 1'e bakın. Başlangıç malzemesinin >2,5 milyon iPSN olduğundan emin olun.
    2. iPSN'leri bir hücre sıyırıcı ile kazıyın ve 50 mL konik tüpte kalan lizis tamponuna aktarın.
    3. Her bir konik tüpü kapatın ve iPSN lizizini kolaylaştırmak için numuneleri 20 saniye boyunca vorteksleyin.
    4. Devam etmeden önce numuneleri 1-2 dakika buz üzerinde bekletin.
  3. Postmortem insan CNS dokularının parçalanması.
    1. Kuru buz yatağına yerleştirilmiş bir Petri kabında bir tıraş bıçağıyla keserek ~ 100 mg donmuş ölüm sonrası insan CNS dokusunu tartın. Lokal doku kontaminasyonunu önlemek için tek kullanımlık pedlerle çevrili bir yüzeyde çalıştığınızdan emin olun. Doku diseksiyonu sırasında görülebilen spesifik gri cevhere karşı beyaz cevher diseksiyonlarına (örneğin, kortikal şömine rafına karşı altta yatan beyaz cevher) dikkat edin.
      NOT: Donmuş ölüm sonrası insan dokusu örneklerini kullanırken göz koruyucu giysi ve eldivenler de dahil olmak üzere uygun KKD'yi giyin. Bu adım ayrıca vaktinden önce tamamlanabilir ve -80 ° C'de saklanan doku alikotları da yapılabilir. 50 mg çekirdek izolasyonu için yeterli bir miktardır. Bununla birlikte, 100 mg'dan fazla doku, bazı çekirdekleri çevreleyen sağlam sitoplazmanın varlığı ile kanıtlandığı gibi, genellikle çekirdeklerin eksik izolasyonunu sağlar.
    2. Dounce homojenizatörü temizleyerek ve damıtılmış suyla iyice durulayarak hazırlayın. Homojenizatörü buzun üzerine koyarak soğutun.
    3. Hazırlanan lizis tamponundan 2 mL içeren taze temizlenmiş, durulanmış ve soğutulmuş (buz üzerinde) Dounce homojenizatöre 100 mg doku ekleyin.
    4. Dounce homojenizatörde buz üzerinde standart prosedürü kullanarak homojenize edin.
      NOT: Tipik olarak, numuneyi dirençsiz hareket ettirmek için havaneli başına 10-20 vuruş yeterlidir.
    5. 2 mL postmortem insan beyni homojenatını konik tüplerde kalan 9 mL lizis tamponuna aktarın.
    6. 30 saniye kuvvetlice girdap yapın ve lizizi kolaylaştırmak için 5 dakika buz üzerinde bekletin.

4. Çekirdeklerin iPSN'lerden ve ölüm sonrası insan CNS dokusundan izolasyonu

  1. Bir ultrasantrifüj tüpünün dibine 10 mL 1.85 M sükroz yastık çözeltisi (adım 2.1.2'de yapılmıştır) katmanlayın ve her lizata 18 mL 1.85 M sükroz yastık çözeltisi ekleyin.
  2. 50 mL konik tüpü ters çevirerek lizat / sükroz yastık çözeltisini (adım 4.1'de birleştirilmiştir) nazikçe karıştırın.
  3. Ultrasantrifüj tüpündeki 10 mL 1.85 M sükroz yastık çözeltisinin üstüne yavaşça 28 mL lizat/sükroz yastık çözeltisi karışımı ekleyin (adım 4.1'den itibaren).
    NOT: 50 mL konik tüpte toplam 29 mL lizat/sükroz yastık çözeltisi karışımı vardır (adım 4.1-4.2). Bu lizat / sükroz yastık çözeltisi karışımından 1 mL 50 mL konik tüpte bırakın. Bu, sakaroz yastık çözeltisinin viskozitesi nedeniyle tüm numuneler arasında doğru ve tutarlı pipetleme sağlar.
  4. Ultrasantrifüj tüplerini tutuculara yerleştirin ve numuneleri dengelemek için gerektiği gibi ek bir 1.85 M sükroz yastık çözeltisi (adım 2.1.2'de yapılmıştır) ekleyin.
  5. Numune tutucuları soğutulmuş ultrasantrifüjdeki rotora yerleştirin ve 30.000 x g, 4 °C'de 45 dakika döndürün.
  6. Ultrasantrifüj tüplerini numune tutuculardan çıkarın ve süpernatanları atın. Çekirdekler, ultrasantrifüj tüpünün alt taraflarında topaklar olarak görünecektir.
  7. Çekirdek peletlerini girdaplama yoluyla sağlanan çekirdek depolama tamponunun 1 mL'sinde yeniden süspanse edin ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  8. Mikrosantrifüj tüplerini 2.500 x g, 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  9. Süpernatanı çıkarın ve verilen çekirdek depolama tamponunun 1 mL'lik taze girdapını girerek çekirdeği yeniden süspanse edin.
  10. İmmün boyamaya devam edin veya çekirdekleri -80 ° C'de saklayın.
    NOT: Çekirdekler -80 °C'de 6 aya kadar saklanabilir ve yapısal bütünlük tehlikeye girmeden önce iki donma/çözülme döngüsüne tabi tutulabilir.

5. İzole edilmiş çekirdeklerin immün boyanması

  1. Çekirdek süspansiyonunun 10 μL'lik bir alikotunu alın ve bir hemasitometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak sayın.
  2. Hazırlanan slaytları (adım 1.3'ten itibaren) cytofunnels'a monte edin.
  3. Her bir hücre hunisine 200 μL taze çekirdek depolama tamponu ve ~100.000 çekirdek katmanı.
  4. Sitohunileri bir sitospinin içine yerleştirerek ve 100 x g'da 3 dakika santrifüjleyerek çekirdekleri slaytların üzerine nazikçe döndürün.
  5. Sitohunileri açın ve slaytlara hemen ~ 100 μL %4 PFA (paraformaldehit) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
    NOT: Çekirdekler metanol ile de sabitlenebilir. Her antikor için uygun fiksasyon yöntemini kullanın. Metanol kullanıyorsanız, geçirgenlik adımını (5.7) atlayın. Sitohuniler tek kullanımlıktır; Bu noktada onları atın.
  6. Çekirdekleri 3x PBS ile 5 dakika boyunca 1x yıkayın.
  7. Çekirdekleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1x PBS'de% 0.1 Triton X-100 ile geçirgen hale getirin.
  8. Çekirdekleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca blok solüsyonunda (1x PBS'de% 10 keçi veya eşek serumu) bloke edin.
  9. Çekirdekleri, gece boyunca 4 ° C'de blok çözelti içinde seyreltilmiş birincil antikorlarla inkübe edin.
  10. Çekirdekleri 3x PBS ile 5 dakika boyunca 1x yıkayın.
  11. Çekirdekleri, oda sıcaklığında 1 saat boyunca blok çözelti içinde seyreltilmiş ikincil antikorlarla inkübe edin.
    NOT: Alexa Fluor 488, 568 ve 647 ikincil antikorları tercih edilir.
  12. Çekirdekleri 3x PBS ile 5 dakika boyunca 1x yıkayın.
  13. İSTEĞE BAĞLI: Çekirdekleri DAPI veya Hoechst ile 5 dakika inkübe edin, ardından 1x PBS ile iki ek 5 dakika yıkayın.
  14. Son PBS yıkamasını tamamen çıkarmak için çekirdek içeren dairenin kenarında tüy bırakmayan bir mendil tutun.
  15. Her slayta 1 damla (~ 10 μL) sert montajlı antifade montaj ortamı (DAPI olmadan) ekleyin ve her slayta yüksek toleranslı 18 mm x 18 mm kare lameller yerleştirin.
    NOT: Sabit montajlı bir ortam kullanırken, slaytlar uygun bir zaman çerçevesi içinde görüntüleniyorsa slayt sızdırmazlığı gerekli değildir. Nup immünoreaktivitesi tipik olarak ~ 6 ay boyunca 4 ° C'de saklanan mühürsüz slaytlarda stabil kalmıştır. Bununla birlikte, lamel kenarları, ıslak montajlı bir ortam kullanılıyorsa veya uzun süreli saklama için ince bir oje tabakası ile kapatılabilir.
  16. Slaytları ışıktan koruyun ve gece boyunca oda sıcaklığında kürlenmelerine izin verin.
  17. Çekirdekleri süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) ile görüntüleyin.
    NOT: Zeiss, Nikon ve GE Healthcare'in tümü SIM mikroskopları üretmektedir. Görüntü alma ve işleme için sisteme özel protokolleri izleyin. Her Nup ve florofor için uygun görüntüleme parametrelerini (lazer gücü, filtre setleri, maruz kalma süresi) kullanın. Görüntüleme yaparken, dairenin kenarlarından kaçının (adım 1.1'den itibaren), çünkü bu çekirdekler tipik olarak düzleştirilir ve santrifüjleme adımının (5.4) bir sonucu olarak yayılır. Tamamen dekonvolvasyonlu ve işlenmiş görüntüler, FIJI veya Imaris görüntü analiz yazılımındaki standart 3D analiz modülleri kullanılarak nokta algılama ve hacim ölçümleri dahil olmak üzere bir dizi analize tabi tutulabilir. Analiz yöntemleriyle ilgili ek ayrıntılar yakın zamanda yayınlanmıştır15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

İnsan nöronal çekirdeklerinde POM121'in NPC ve nükleoplazmik dağılımını ve ekspresyonunu incelemek için, kontrol ve C9orf72 iPSN'ler daha önce tarif edildiği gibi farklılaştırıldı15. Postmortem insan motor korteksi ve 32. gün iPSN'leri parçalandı ve yukarıda tarif edildiği gibi çekirdek izolasyonu ve immün boyamaya tabi tutuldu. NeuN pozitif izole çekirdekler, bir süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (Zeiss...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

NCT eksikliklerinin çoklu nörodejeneratif hastalıklarda erken ve belirgin bir fenomen olarak yakın zamanda tanımlanması göz önüne alındığında 16,27,28,30,31, bu patolojinin ortaya çıktığı mekanizmanın kapsamlı bir şekilde incelenmesi için kritik bir ihtiyaç vardır. NPC ve bireysel Nup proteinleri, fonks...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Postmortem insan CNS dokuları, Johns Hopkins ALS Otopsi Bankası ve Hedef ALS Postmortem Doku Çekirdeği tarafından sağlandı. Bu çalışma, ALSA Milton Safenowitz Doktora Sonrası Bursu (ANC) tarafından desteklenmiştir ve ayrıca NIH-NINDS, Savunma Bakanlığı, ALS Derneği, Musküler Distrofi Derneği, F Prime, Robert Packard ALS Araştırma Merkezi Cevap ALS Programı ve Chan Zuckerberg Girişimi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL conical tubesFisher Scientific14-959-49A
Beckman UltracentrifugeBeckman Coulter
Cell ScrapersSarstedt83.183
CollagenAdvanced Biomatrix5005
CoverslipsMatTekPCS-170-1818
CytofunnelThermo Fisher ScientificA78710020
Cytospin 4Fisher ScientificA78300003
Dounce HomogenizersDWK Life Sciences357542
DTTSigma AldrichD0632
Eppendorf tubesFisher Scientific05-408-129
Goat Anti-Chicken Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21449
Goat Anti-Mouse Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11029
Goat Anti-Mouse Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11031
Goat Anti-Mouse Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21236
Goat Anti-Rabbit Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11034
Goat Anti-Rabbit Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11036
Goat Anti-Rabbit Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21245
Goat Anti-Rat Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11006
Goat Anti-Rat Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11077
Goat Anti-Rat Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21247
HemacytometerFisher Scientific267110
Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Normal Goat SerumVector LabsS-1000
Nuclei PURE Prep Nuclei Isolation KitSigma AldrichNUC201Contains Lysis Buffer, 10% Triton X-100, 2 M Sucrose Gradient, Sucrose Cushion Solution, and Nuclei Storage Buffer; Referenced in protocol as "nuclei isolation kit"
PBSThermo Fisher Scientific10010023
PFAElectron Microscopy Sciences15714-S
Prolong Gold AntifadeInvitrogenP36930Referenced in protocol as "hard mount antifade mounting media"
SW 32 Ti Ultracentrifuge RotorBeckman Coulter369694Referenced in protocol as "ultracentrifuge rotor"
Triton X-100Sigma AldrichT9284
Trypan BlueThermo Fisher Scientific15-250-061
Ultracentrifuge TubesBeckman Coulter344058
Nucleoporin Primary AntibodiesPrimary antibodies suitable for immunofluorescent detection of invidual nucleoporins are available from multiple companies 

Referanslar

  1. Hou, Y., et al. Ageing as a risk factor for neurodegenerative disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (10), 565-581 (2019).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Bang, J., Spina, S., Miller, B. L. Frontotemporal dementia. Lancet. 386 (10004), 1672-1682 (2015).
  4. Blauwendraat, C., Nalls, M. A., Singleton, A. B. The genetic architecture of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 19 (2), 170-178 (2020).
  5. Cacace, R., Sleegers, K., Van Broeckhoven, C. Molecular genetics of early-onset Alzheimer's disease revisited. Alzheimer's & Dementia. 12 (6), 733-748 (2016).
  6. Di Resta, C., Ferrari, M. New molecular approaches to Alzheimer's disease. Clinical Biochemistry. 72, 81-86 (2019).
  7. Karch, C. M., Cruchaga, C., Goate, A. M. Alzheimer's disease genetics: from the bench to the clinic. Neuron. 83 (1), 11-26 (2014).
  8. Kovacs, G. G. Molecular pathology of neurodegenerative diseases: principles and practice. Journal of Clinical Pathology. 72 (11), 725-735 (2019).
  9. McColgan, P., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: a clinical review. European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).
  10. Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. The Lancet. Neurology. 10 (1), 83-98 (2011).
  11. Dugger, B. N., Dickson, D. W. Pathology of neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 028035(2017).
  12. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
  13. DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72 (2), 245-256 (2011).
  14. Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72 (2), 257-268 (2011).
  15. Coyne, A. N., et al. G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD. Neuron. 107 (4), 1124-1140 (2020).
  16. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  17. D'Angelo, M. A., Raices, M., Panowski, S. H., Hetzer, M. W. Age-dependent deterioration of nuclear pore complexes causes a loss of nuclear integrity in postmitotic cells. Cell. 136 (2), 284-295 (2009).
  18. Hetzer, M. W. The role of the nuclear pore complex in aging of post-mitotic cells. Aging (Albany NY). 2 (2), 74-75 (2010).
  19. Savas, J. N., Toyama, B. H., Xu, T., Yates, J. R., Hetzer, M. W. Extremely long-lived nuclear pore proteins in the rat brain. Science. 335 (6071), 942(2012).
  20. Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
  21. Nofrini, V., Di Giacomo, D., Mecucci, C. Nucleoporin genes in human diseases. European Journal of Human Genetics. 24 (10), 1388-1395 (2016).
  22. Sakuma, S., D'Angelo, M. A. The roles of the nuclear pore complex in cellular dysfunction, aging and disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 68, 72-84 (2017).
  23. Basel-Vanagaite, L., et al. Mutated nup62 causes autosomal recessive infantile bilateral striatal necrosis. Annals of Neurology. 60 (2), 214-222 (2006).
  24. Nousiainen, H. O., et al. Mutations in mRNA export mediator GLE1 result in a fetal motoneuron disease. Nature Genetics. 40 (2), 155-157 (2008).
  25. Cronshaw, J. M., Matunis, M. J. The nuclear pore complex: disease associations and functional correlations. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15 (1), 34-39 (2004).
  26. Chou, C. C., et al. TDP-43 pathology disrupts nuclear pore complexes and nucleocytoplasmic transport in ALS/FTD. Nature Neuroscience. 21 (2), 228-239 (2018).
  27. Eftekharzadeh, B., et al. Tau protein disrupts nucleocytoplasmic transport in Alzheimer's disease. Neuron. 99 (5), 925-940 (2018).
  28. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  29. Gasset-Rosa, F., et al. Polyglutamine-expanded huntingtin exacerbates age-related disruption of nuclear integrity and nucleocytoplasmic transport. Neuron. 94 (1), 48-57 (2017).
  30. Grima, J. C., et al. Mutant huntingtin disrupts the nuclear pore complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
  31. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  32. Guo, L., et al. Nuclear-import receptors reverse aberrant phase transitions of RNA-binding proteins with prion-like domains. Cell. 173 (3), 677-692 (2018).
  33. Hofweber, M., et al. Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation. Cell. 173 (3), 706-719 (2018).
  34. Yoshizawa, T., et al. Nuclear Import Receptor Inhibits Phase Separation of FUS through Binding to Multiple Sites. Cell. 173 (3), 693-705 (2018).
  35. Chew, J., et al. Aberrant deposition of stress granule-resident proteins linked to C9orf72-associated TDP-43 proteinopathy. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 9(2019).
  36. Zhang, Y. J., et al. Poly(GR) impairs protein translation and stress granule dynamics in C9orf72-associated frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis. Nat Medicine. 24 (8), 1136-1142 (2018).
  37. Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nature Neuroscience. 19 (5), 668-677 (2016).
  38. Zhang, Y. J., et al. Heterochromatin anomalies and double-stranded RNA accumulation underlie C9orf72 poly(PR) toxicity. Science. 363 (6428), (2019).
  39. Beck, M., Hurt, E. The nuclear pore complex: understanding its function through structural insight. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (2), 73-89 (2017).
  40. Lin, D. H., Hoelz, A. The structure of the nuclear pore complex (an update). Annual Review of Biochemistry. 88, 725-783 (2019).
  41. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissue-specific and developmental functions. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (11), 687-699 (2012).
  42. Kinoshita, Y., Kalir, T., Dottino, P., Kohtz, D. S. Nuclear distributions of NUP62 and NUP214 suggest architectural diversity and spatial patterning among nuclear pore complexes. PLoS One. 7 (4), 36137(2012).
  43. Ori, A., et al. Cell type-specific nuclear pores: a case in point for context-dependent stoichiometry of molecular machines. Molecular Systems Biology. 9, 648(2013).
  44. Rajoo, S., Vallotton, P., Onischenko, E., Weis, K. Stoichiometry and compositional plasticity of the yeast nuclear pore complex revealed by quantitative fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), 3969-3977 (2018).
  45. Li, C., Goryaynov, A., Yang, W. The selective permeability barrier in the nuclear pore complex. Nucleus. 7 (5), 430-446 (2016).
  46. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complexes and regulation of gene expression. Current Opinion in Cell Biology. 46, 26-32 (2017).
  47. Pascual-Garcia, P., Capelson, M. Nuclear pores in genome architecture and enhancer function. Current Opinion in Cell Biology. 58, 126-133 (2019).
  48. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  49. Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nature Neuroscience. 16 (7), 790-797 (2013).
  50. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  51. Wu, Y., Shroff, H. Faster, sharper, and deeper: structured illumination microscopy for biological imaging. Nature Methods. 15 (12), 1011-1019 (2018).
  52. Hampoelz, B., et al. Pre-assembled nuclear pores insert into the nuclear envelope during early development. Cell. 166 (3), 664-678 (2016).
  53. Hampoelz, B., et al. Nuclear pores assemble from nucleoporin condensates during oogenesis. Cell. 179 (3), 671-686 (2019).
  54. Agote-Aran, A., et al. Spatial control of nucleoporin condensation by fragile X-related proteins. The EMBO Journal. 39 (20), 104467(2020).
  55. Colombi, P., Webster, B. M., Fröhlich, F., Lusk, C. P. The transmission of nuclear pore complexes to daughter cells requires a cytoplasmic pool of Nsp1. The Journal of Cell Biology. 203 (2), 215-232 (2013).
  56. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  57. Löschberger, A., Franke, C., Krohne, G., van de Linde, S., Sauer, M. Correlative super-resolution fluorescence and electron microscopy of the nuclear pore complex with molecular resolution. Journal of Cell Science. 127, Pt 20 4351-4355 (2014).
  58. Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. Journal of Cell Science. 125, Pt 3 570-575 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

ekirdek zolasyonuS per z n rl kl MikroskopiN kleer G zenek KompleksiN kleoporin ProteinleriN rodejenerasyonAmyotrofik Lateral SklerozAlzheimer HastalFrontotemporal DemansHuntington HastalN kleositoplazmik Ta maMikroskopi Teknikleri3D G rselle tirmeIPSC Kaynakl CNS H creleri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır