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요약

이 프로토콜은 핵 분리 및 초해상도 구조 조명 현미경 검사에 최적화된 워크플로우를 설명하여 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런 및 사후 인간 조직의 핵질 및 NPC 내의 개별 뉴클레오포린을 평가합니다.

초록

핵공 복합체(NPC)는 ~30개의 서로 다른 뉴클레오포린 단백질(Nup)의 여러 사본으로 구성된 복잡한 고분자 구조입니다. 총체적으로 이러한 Nup는 게놈 조직, 유전자 발현 및 핵세포질 수송(NCT)을 조절하는 기능을 합니다. 최근 NCT의 결함 및 특정 Nup의 변형은 근위축성 측삭 경화증(ALS), 알츠하이머병(AD)/전두측두엽 치매(FTD), 헌팅턴병(HD)을 포함한 여러 신경퇴행성 질환에서 초기의 두드러진 병리로 확인되었습니다. 광 현미경과 전자 현미경의 발전으로 NPC와 Nup 구성 요소를 포함한 세포 내 구조를 향상된 정밀도와 해상도로 철저히 검사할 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 기술 중 초고해상도 구조화 조명 현미경(SIM)은 기존의 항체 기반 라벨링 전략을 사용하여 개별 Nup의 위치 파악 및 발현을 연구할 수 있는 최고의 기회를 제공합니다. SIM 이전에 핵을 분리하면 완전하고 정확하게 재구성된 3D 공간에서 NPC 및 핵질 내의 개별 Nup 단백질을 시각화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간 iPSC 유래 CNS 세포 및 사후 조직에서 Nup 발현 및 분포를 평가하기 위한 핵 분리 및 SIM 절차를 설명합니다.

서문

노화와 관련된 신경퇴행성 질환의 유병률은 인구가 고령화됨에 따라 증가하고 있습니다1. 유전적 토대와 병리학적 특징은 잘 규명되어 있지만, 신경 세포 손상으로 이어지는 정확한 분자 현상은 잘 이해되지 않고 있습니다2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. 최근에, G4C2 C9orf72 유전자의 첫 번째 인트론에서 헥사뉴클레오티드 반복 증식은 관련 신경퇴행성 질환인 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 전두측두엽 치매(FTD)의 가장 흔한 유전적 원인으로 확인되었습니다13,14. 현재 여러 연구에서 핵공극 복합체(NPC) 및 핵 수송 수용체(NTR, 카료페린)를 포함한 핵 수송 기계의 중단이 C9orf72 ALS의 원인이라고 주장하고 있습니다15,16. 쥐의 뇌 내에 있는 분열하지 않는 세포에서 비계(nups)는 수명이 매우 깁니다. 그 결과, 노화 과정에서 NPC와 NCT의 변화가 보고되고 있다17,18,19,20. 더욱이, 일부 뉴클레오포린(nucleoporins) 또는 트랜스포틴(transportin)은 돌연변이가 발생할 때 특정 신경 질환과 관련이 있습니다21,22. 예를 들어, Nup62의 돌연변이는 미상핵과 미상핵에 영향을 미치는 신경 질환인 영아 양측 선조체 괴사(IBSN)와 관련이 있습니다23; Gle1의 돌연변이는 태아 운동 뉴런 질환인 인간 치명적 선천성 구축 증후군-1(Human Lethal Congenital Contracture Syndrome-1, LCCS1)과 관련이 있습니다24; 알라딘의 돌연변이는 트리플 A 증후군의 원인입니다.25. 기능적 NCT의 변화는 ALS, 헌팅턴병(HD), 알츠하이머병(AD)과 같은 노화 관련 신경퇴행성 질환에서 악화됩니다16,26,27,28,29,30,31. 또한, 특정 Nups 및 NTR은 C9orf72 매개 독성의 변형제로 보고되었습니다. Drosophila 눈28 또는 FUS 및 tau와 같은 질병 관련 단백질의 응집 상태를 생화학적으로 변형합니다.27,32,33,34. 종합적으로, 이러한 초기 연구는 변형된 NCT가 ALS 및 FTD의 일차적이고 초기 병리학적 특징일 수 있음을 시사합니다. 과발현 기반 모델 시스템에 대한 연구는 특정 Nups 및 karyopherins의 오국소화가 NCT에 영향을 미칠 수 있음을 시사했습니다.16,35,36,37,38. 그러나 이러한 병리학 연구는 실제로 NPC 단백질의 세포질 축적을 NPC의 구조 또는 기능의 결함과 연결시키지 않습니다. 예를 들어, 이 병리학은 NPC 구성 및 기능에 거의 영향을 미치지 않는 Nup 단백질의 세포질 풀의 조절 장애를 단순히 반영할 수 있습니다. 이와는 대조적으로, 초고해상도 구조화 조명 현미경(SIM)을 사용한 최근 연구는 인간 C9orf72 ALS/FTD 뉴런의 핵질 및 NPC 내 특정 Nup 수준의 감소를 특징으로 하는 NPC 자체에 대한 심각한 손상의 출현을 보여주며, 궁극적으로 병원성 질병 연쇄 반응의 조기 시작 이벤트로서 NPC 기능의 변화를 초래합니다15.

핵과 세포질 사이의 거대분자의 통과는 핵공 복합체(NPC)에 의해 제어됩니다. NPC는 30 개의 뉴클레오포린 단백질 (Nups) 39 , 40 , 41 의 여러 사본으로 구성된 핵막에 내장 된 큰 고분자 복합체입니다. Nup 화학량론은 세포 유형에 따라 다르지만 42,43,44, 전체 NPC 구성의 유지는 NCT, 게놈 조직 및 전체 세포 생존율 39,41,45,46에 매우 중요합니다. 결과적으로, NPC 구성의 변화와 그에 따른 기능적 수송의 결함은 무수한 다운스트림 세포 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. NPC의 Nup 구성 요소는 세포질 고리 및 필라멘트, 중심 채널, 외부 고리, 내부 고리, 막관통 고리 및 핵 바구니를 포함한 여러 하위 복합체로 고도로 조직되어 있습니다. 총체적으로, 내부, 외부 및 막관통 고리의 골격 Nup은 핵 외피 내에 NPC를 고정하고 세포질 고리, 중심 채널 및 핵 바구니의 Nup에 대한 앵커 포인트를 제공합니다. 작은 분자 (<40-60 kD)는 NPC를 통해 수동적으로 확산 될 수 있지만, 더 큰화물의 적극적인 수송은 핵 수송 수용체 (NTR, karyopherins)와 세포질 필라멘트, 중심 채널 및 핵 바구니39 , 40 , 41 , 45의 FG Nups 사이의 상호 작용에 의해 촉진됩니다. 또한, 소수의 Nup은 유전자 발현을 조절하기 위해 NPC 외부, 핵질 내에서 추가로 기능할 수 있습니다46,47.

단일 인간 NPC의 측면 치수가 약 100-120nm40인 것을 감안할 때, 표준 광시야 또는 컨포칼 현미경은 개별 NPC(48)를 해결하기에 충분하지 않습니다. TEM 또는 SEM과 같은 전자 현미경 (EM) 기술은 종종 NPC39,40의 전체 구조를 평가하는 데 사용됩니다. NPC 미세구조를 분해하기 위한 이러한 기술의 장점에도 불구하고 NPC 내에서 개별 Nup 단백질의 존재를 평가하는 데 덜 일반적으로 사용됩니다. 항체 또는 태그 기반 라벨링을 이러한 최첨단 기술인 TEM 및 SEM과 결합하는 기술적 한계로 인해 NPC 또는 뉴클레오플라즘 내의 개별 Nups 자체에 대한 정확하고 신뢰할 수 있는 평가가 항상 가능한 것은 아닙니다. 또한 이러한 기술은 기술적으로 까다로울 수 있으며 아직 모든 연구자가 널리 접근할 수 있는 것은 아닙니다. 그러나 최근 광 및 형광 현미경 검사의 발전으로 초고해상도 이미징 기술의 접근성이 높아졌습니다. 특히 SIM은 한 인간 NPC 40,48,49,50,51의 측면 치수에 근접하는 해상도로 개별 Nup을 이미지화할 수 있는 비할 데 없는 기회를 제공합니다. 확률적 광학 재구성 현미경(STORM) 및 유도 방출 파괴(STED)와 같은 다른 초해상도 접근법과 달리 SIM은 기존 항체 기반 면역 염색과 호환됩니다49. 따라서 SIM을 사용하면 특정 Nup 항체를 사용할 수 있는 모든 Nup을 포괄적으로 분석할 수 있습니다. 동일한 제제에서 여러 개의 서로 다른 Nup을 샘플링하고 이미징할 수 있는 기능은 NPC를 구성하는 많은 단백질을 조사할 때 다른 이미징 방법에 상당한 이점을 제공합니다. 다음 절차는 유도만능줄기세포(iPSC), 유래 뉴런(iPSN) 및 사후 인간 중추신경계(CNS) 조직에서 분리된 핵을 사용하여 NPC의 개별 Nup 구성 요소를 평가하기 위한 최적화된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

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프로토콜

iPSC 생성 및 부검 조직 채취를 위한 모든 혈액 샘플은 존스 홉킨스 IRB의 승인을 받았으며 존스 홉킨스 윤리 감독을 받았습니다. 모든 환자 정보는 HIPPA를 준수합니다. 다음 프로토콜은 모든 존스 홉킨스 생물 안전성 절차를 준수합니다.

1. immunostaining 및 이미징을 위한 슬라이드 준비

  1. 빈 세포깔때기에 양전하를 띤 유리 현미경 슬라이드를 배치하고 소수성 장벽 펜으로 원을 그려 핵을 침전할 영역의 윤곽을 그립니다.
  2. 1.1단계에서 그린 원의 중심에 50μL의 1mg/mL 콜라겐 용액(1x PBS로 희석)을 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
  3. 콜라겐 용액을 흡입하고 슬라이드를 실온에서 약 1시간 동안 자연 건조시킵니다.

2. lysis buffer 및 sucrose gradients의 준비

  1. Nuclei isolation Kit 프로토콜에 따라 lysis buffer 및 sucrose gradient solution을 준비합니다.
    1. 각 샘플에 대해 제공된 용해 완충액 11mL, 제공된 10% Triton X-100 용액 110μL, 새로 준비되거나 해동된 1M DTT(Dithiothreitol) 11μL를 결합하여 용해 완충액의 50mL 원뿔형 튜브를 준비합니다.
    2. 각 샘플에 대해 50mL 원뿔형 튜브를 사용하여 제공된 2M 자당 쿠션 용액 27.75mL, 제공된 자당 쿠션 완충액 2.25mL, 갓 준비하거나 해동한 1M DTT 30μL를 결합하여 1.85M 자당 쿠션 용액을 준비합니다.
      참고: 1.85M 자당 쿠션 용액은 iPSN 및 사후 인간 CNS 조직에 최적이지만 다른 세포 유형 또는 조직 샘플에 맞게 조정합니다. HEK293 세포, iPSC 유래 성상세포, 사후 CNS 조직으로부터의 희소돌기아교세포 핵 농축에 대한 추가 세부 정보가 최근 발표되었습니다15.
  2. 원뿔형 튜브를 뒤집어 용해 완충액과 자당 쿠션 용액을 부드럽게 혼합하고 얼음에 보관합니다.

3. iPSN 및 사후 인간 CNS 조직의 용해

  1. 용해를 진행하기 전에 초원심분리기 로터(샘플 홀더 없음)를 초원심분리기에 넣고 4°C로 예냉각합니다.
  2. iPSN의 용해.
    참고: 용해 프로토콜은 iPSN과 사후 인간 CNS 조직에 따라 다릅니다. 아래에 지정된 샘플 유형에 대한 프로토콜을 따릅니다(3.2단계: iPSN, 3.3단계: 사후 인간 CNS 조직).
    1. 인큐베이터에서 iPSN을 제거하고 미디어를 흡인합니다. 1x PBS로 짧게 헹구고 용해 완충액을 웰 또는 플레이트에 직접 추가합니다.
      참고: 이물질과 죽은 세포를 제거하기 위해 충분한 양의 1x PBS로 iPSN을 적절하게 헹굽니다. iPSN 플레이트에 추가되는 용해 완충액의 부피는 다양합니다. 표 1을 참조하십시오. 시작 물질이 >250만 iPSN인지 확인합니다.
    2. 세포 스크레이퍼로 iPSN을 긁어내고 50mL 코니컬 튜브의 나머지 용해 완충액으로 옮깁니다.
    3. 각 원뿔형 튜브에 캡을 씌우고 iPSN 용해를 용이하게 하기 위해 샘플을 20초 동안 볼텍스합니다.
    4. 진행하기 전에 샘플을 얼음 위에 1-2분 동안 그대로 두십시오.
  3. 사후 인간 CNS 조직의 용해.
    1. 드라이아이스 바닥에 놓인 페트리 접시를 면도날로 잘라 냉동 사후 인간 CNS 조직의 무게를 잰다. 국소 조직 오염을 방지하기 위해 일회용 패드로 둘러싸인 표면에서 작업하십시오. 조직 해부 시 볼 수 있는 특정 회백질 대 백질 해부(예: 피질 맨틀 대 기저 백질)에 주의하십시오.
      참고: 냉동 사후 인체 조직 샘플을 취급할 때 눈 보호복과 장갑을 포함한 적절한 PPE를 착용하십시오. 이 단계는 또한 미리 완료할 수 있으며 조직 분취액은 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 50mg은 핵 분리에 충분한 양입니다. 그러나 100mg 이상의 조직은 종종 핵의 불완전한 분리를 초래하며, 이는 일부 핵을 둘러싼 온전한 세포질의 존재에 의해 입증됩니다.
    2. Dounce 균질화기를 세척하고 증류수로 철저히 헹궈 준비합니다. 균질기를 얼음 위에 올려 식히십시오.
    3. 준비된 용해 완충액 2mL가 포함된 갓 세척, 헹굼 및 식힌 (얼음 위) Dounce 균질기에 조직 100mg을 추가합니다.
    4. 얼음 위의 표준 절차를 사용하여 Dounce 균질화에서 균질화합니다.
      참고: 일반적으로 유봉당 10-20번의 스트로크는 저항 없이 샘플을 통과하기에 충분합니다.
    5. 사후 인간 뇌 균질화 2mL를 원뿔형 튜브의 나머지 9mL의 용해 완충액으로 옮깁니다.
    6. 30초 동안 격렬하게 소용돌이치고 용해를 용이하게 하기 위해 5분 동안 얼음 위에 두십시오.

4. iPSN 및 사후 인간 CNS 조직에서 핵 분리

  1. 초원심분리 튜브 바닥에 1.85M 자당 쿠션 용액(2.1.2단계에서 제작) 10mL를 층을 이루고 각 용해물에 1.85M 자당 쿠션 용액 18mL를 추가합니다.
  2. 50mL 원뿔형 튜브를 뒤집어 용해물/자당 쿠션 용액(4.1단계에서 결합)을 부드럽게 혼합합니다.
  3. 초원심분리기 튜브의 10mL 1.85M 자당 쿠션 용액 상단에 용해물/자당 쿠션 용액 혼합물 28mL를 천천히 추가합니다(4.1단계부터).
    알림: 29mL 원뿔형 튜브에 총 50mL 용해물/자당 쿠션 용액 혼합물이 있습니다(단계 4.1-4.2). 이 용해물/자당 쿠션 용액 혼합물 1mL를 50mL 원뿔형 튜브에 그대로 둡니다. 이는 자당 쿠션 용액의 점도로 인해 모든 샘플에서 정확하고 일관된 피펫팅을 보장합니다.
  4. 초원심분리기 튜브를 홀더에 놓고 필요에 따라 1.85M 자당 쿠션 용액(2.1.2단계에서 만든)을 추가로 추가하여 샘플의 균형을 맞춥니다.
  5. 냉각된 초원심분리기의 로터에 시료 홀더를 놓고 30,000 x g, 4°C에서 45분 동안 회전합니다.
  6. 샘플 홀더에서 초원심분리기 튜브를 제거하고 상층액을 버립니다. 핵은 초원심분리기 튜브의 바닥면에서 펠릿으로 볼 수 있습니다.
  7. 볼텍싱을 통해 제공된 핵 저장 버퍼 1mL에 핵 펠릿을 재현탁시키고 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
  8. 마이크로 원심분리기 튜브를 2,500 x g, 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
  9. 상층액을 제거하고 제공된 핵 저장 완충액 1mL를 새로 와류하여 핵을 재현탁합니다.
  10. 면역염색을 진행하거나 핵을 -80°C에서 보관합니다.
    참고: 핵은 -80°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있으며 구조적 무결성이 손상되기 전에 두 번의 동결/해동 주기를 거칠 수 있습니다.

5. 분리된 핵의 면역염색

  1. nuclei 현탁액의 10 μL 분취액을 취하고 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 계수합니다.
  2. 준비된 슬라이드(1.3단계부터)를 세포 퍼널에 조립합니다.
  3. 각 세포깔때기에 200μL의 새로운 핵 저장 완충액과 ~100,000개의 핵을 층을 이룹니다.
  4. cytofunnels를 cytospin에 넣고 100 x g에서 3분 동안 원심분리하여 nuclei를 슬라이드로 부드럽게 회전시킵니다.
  5. 세포 깔때기를 풀고 즉시 슬라이드에 ~100μL의 4% PFA(파라포름알데히드)를 추가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
    참고: 핵은 메탄올로 고정할 수도 있습니다. 항체 각각에 적합한 정착 방법을 사용한다. 메탄올을 사용하는 경우 투과화 단계(5.7)를 건너뜁니다. 사이토퍼널은 일회용입니다. 이 시점에서 폐기하십시오.
  6. 1x PBS로 핵을 3x 5분 동안 세척합니다.
  7. 실온에서 10분 동안 1x PBS에 0.1% Triton X-100으로 핵을 투과시킵니다.
  8. 블록 용액(10x PBS의 10% 염소 또는 당나귀 혈청)에서 실온에서 30분 동안 핵을 차단합니다.
  9. 블록 용액에 희석된 1차 항체로 핵을 4°C에서 밤새 배양합니다.
  10. 1x PBS로 핵을 3x 5분 동안 세척합니다.
  11. 블록 용액에 희석된 2차 항체로 핵을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
    참고: Alexa Fluor 488, 568 및 647 2차 항체가 선호됩니다.
  12. 1x PBS로 핵을 3x 5분 동안 세척합니다.
  13. 선택 사항: DAPI 또는 Hoechst로 핵을 5분 동안 배양한 다음 1x PBS로 5분 더 세척합니다.
  14. 핵이 포함된 원의 가장자리에 보푸라기가 없는 물티슈를 잡고 마지막 PBS 세척을 완전히 제거합니다.
  15. 각 슬라이드에 하드 마운트 페이드 방지 마운팅 미디어(DAPI 없음) 1방울(~10μL)을 추가하고 각 슬라이드에 높은 허용 오차 18mm x 18mm 정사각형 커버슬립을 부드럽게 배치합니다.
    참고: 하드 마운트 미디어를 사용할 때 슬라이드가 적절한 시간 프레임 내에 이미지화되는 경우 슬라이드 밀봉이 필요하지 않습니다. Nup 면역 반응은 일반적으로 4°C에서 ~6개월 동안 보관된 밀봉되지 않은 슬라이드에서 안정적으로 유지되었습니다. 그러나 커버슬립의 가장자리는 습식 마운트 매체를 사용하거나 장기간 보관하는 경우 얇은 매니큐어 층으로 밀봉할 수 있습니다.
  16. 슬라이드를 빛으로부터 보호하고 실온에서 밤새 경화시키십시오.
  17. 초해상도 구조화 조명 현미경(SIM)으로 핵이 할 수 있는 이미지를 이미지화합니다.
    참고: Zeiss, Nikon 및 GE Healthcare는 모두 SIM 현미경을 제조합니다. 이미지 획득 및 처리를 위한 시스템별 프로토콜을 따릅니다. 각 Nup 및 형광단에 적합한 이미징 매개변수(레이저 출력, 필터 세트, 노출 시간)를 사용합니다. 이미징할 때 원심분리 단계(5.4)의 결과로 이러한 핵이 일반적으로 평평해지고 퍼져 나가므로 원의 가장자리(1.1단계)를 피하십시오. 완전히 디컨볼루션 및 처리된 이미지는 FIJI 또는 Imaris 이미지 분석 소프트웨어의 표준 3D 분석 모듈을 사용하여 스폿 감지 및 부피 측정을 포함한 여러 분석을 수행할 수 있습니다. 분석 방법에 대한 추가 세부 정보가 최근에 발표되었습니다15.

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결과

인간 신경 세포핵에서 POM121의 NPC 및 핵질 분포 및 발현을 조사하기 위해 대조군 및 C9orf72 iPSN을 앞서 설명한 바와 같이 구별했습니다15. 사후 인간 운동 피질과 32일차 iPSN을 용해하고 상기한 바와 같이 핵 분리 및 면역 염색을 실시했습니다. NeuN 양성 분리핵은 초해상도 구조화 조명 현미경(Zeiss)을 사용하여 초고해상도 구조화 조명 현미경(SIM)으로 이미지?...

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토론

최근 여러 신경퇴행성 질환에서 NCT 결핍이 초기에 두드러진 현상으로 확인됨에 따라 16,27,28,30,31 이 병리학이 발생하는 메커니즘을 철저히 조사할 필요가 있습니다. NPC와 개별 Nup 단백질이 기능적 NCT39,41?...

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공개

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 말

사후 인간 CNS 조직은 Johns Hopkins ALS 부검 은행과 Target ALS 사후 조직 코어에서 제공했습니다. 이 연구는 ALSA Milton Safenowitz 박사후 연구원(ANC)과 NIH-NINDS, 국방부, ALS 협회, 근이영양증 협회, F Prime, ALS 연구를 위한 로버트 패커드 센터 ALS 프로그램 및 Chan Zuckerberg Initiative의 자금 지원을 받았습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL conical tubesFisher Scientific14-959-49A
Beckman UltracentrifugeBeckman Coulter
Cell ScrapersSarstedt83.183
CollagenAdvanced Biomatrix5005
CoverslipsMatTekPCS-170-1818
CytofunnelThermo Fisher ScientificA78710020
Cytospin 4Fisher ScientificA78300003
Dounce HomogenizersDWK Life Sciences357542
DTTSigma AldrichD0632
Eppendorf tubesFisher Scientific05-408-129
Goat Anti-Chicken Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21449
Goat Anti-Mouse Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11029
Goat Anti-Mouse Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11031
Goat Anti-Mouse Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21236
Goat Anti-Rabbit Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11034
Goat Anti-Rabbit Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11036
Goat Anti-Rabbit Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21245
Goat Anti-Rat Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11006
Goat Anti-Rat Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11077
Goat Anti-Rat Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21247
HemacytometerFisher Scientific267110
Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Normal Goat SerumVector LabsS-1000
Nuclei PURE Prep Nuclei Isolation KitSigma AldrichNUC201Contains Lysis Buffer, 10% Triton X-100, 2 M Sucrose Gradient, Sucrose Cushion Solution, and Nuclei Storage Buffer; Referenced in protocol as "nuclei isolation kit"
PBSThermo Fisher Scientific10010023
PFAElectron Microscopy Sciences15714-S
Prolong Gold AntifadeInvitrogenP36930Referenced in protocol as "hard mount antifade mounting media"
SW 32 Ti Ultracentrifuge RotorBeckman Coulter369694Referenced in protocol as "ultracentrifuge rotor"
Triton X-100Sigma AldrichT9284
Trypan BlueThermo Fisher Scientific15-250-061
Ultracentrifuge TubesBeckman Coulter344058
Nucleoporin Primary AntibodiesPrimary antibodies suitable for immunofluorescent detection of invidual nucleoporins are available from multiple companies 

참고문헌

  1. Hou, Y., et al. Ageing as a risk factor for neurodegenerative disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (10), 565-581 (2019).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Bang, J., Spina, S., Miller, B. L. Frontotemporal dementia. Lancet. 386 (10004), 1672-1682 (2015).
  4. Blauwendraat, C., Nalls, M. A., Singleton, A. B. The genetic architecture of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 19 (2), 170-178 (2020).
  5. Cacace, R., Sleegers, K., Van Broeckhoven, C. Molecular genetics of early-onset Alzheimer's disease revisited. Alzheimer's & Dementia. 12 (6), 733-748 (2016).
  6. Di Resta, C., Ferrari, M. New molecular approaches to Alzheimer's disease. Clinical Biochemistry. 72, 81-86 (2019).
  7. Karch, C. M., Cruchaga, C., Goate, A. M. Alzheimer's disease genetics: from the bench to the clinic. Neuron. 83 (1), 11-26 (2014).
  8. Kovacs, G. G. Molecular pathology of neurodegenerative diseases: principles and practice. Journal of Clinical Pathology. 72 (11), 725-735 (2019).
  9. McColgan, P., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: a clinical review. European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).
  10. Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. The Lancet. Neurology. 10 (1), 83-98 (2011).
  11. Dugger, B. N., Dickson, D. W. Pathology of neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 028035(2017).
  12. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
  13. DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72 (2), 245-256 (2011).
  14. Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72 (2), 257-268 (2011).
  15. Coyne, A. N., et al. G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD. Neuron. 107 (4), 1124-1140 (2020).
  16. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  17. D'Angelo, M. A., Raices, M., Panowski, S. H., Hetzer, M. W. Age-dependent deterioration of nuclear pore complexes causes a loss of nuclear integrity in postmitotic cells. Cell. 136 (2), 284-295 (2009).
  18. Hetzer, M. W. The role of the nuclear pore complex in aging of post-mitotic cells. Aging (Albany NY). 2 (2), 74-75 (2010).
  19. Savas, J. N., Toyama, B. H., Xu, T., Yates, J. R., Hetzer, M. W. Extremely long-lived nuclear pore proteins in the rat brain. Science. 335 (6071), 942(2012).
  20. Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
  21. Nofrini, V., Di Giacomo, D., Mecucci, C. Nucleoporin genes in human diseases. European Journal of Human Genetics. 24 (10), 1388-1395 (2016).
  22. Sakuma, S., D'Angelo, M. A. The roles of the nuclear pore complex in cellular dysfunction, aging and disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 68, 72-84 (2017).
  23. Basel-Vanagaite, L., et al. Mutated nup62 causes autosomal recessive infantile bilateral striatal necrosis. Annals of Neurology. 60 (2), 214-222 (2006).
  24. Nousiainen, H. O., et al. Mutations in mRNA export mediator GLE1 result in a fetal motoneuron disease. Nature Genetics. 40 (2), 155-157 (2008).
  25. Cronshaw, J. M., Matunis, M. J. The nuclear pore complex: disease associations and functional correlations. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15 (1), 34-39 (2004).
  26. Chou, C. C., et al. TDP-43 pathology disrupts nuclear pore complexes and nucleocytoplasmic transport in ALS/FTD. Nature Neuroscience. 21 (2), 228-239 (2018).
  27. Eftekharzadeh, B., et al. Tau protein disrupts nucleocytoplasmic transport in Alzheimer's disease. Neuron. 99 (5), 925-940 (2018).
  28. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  29. Gasset-Rosa, F., et al. Polyglutamine-expanded huntingtin exacerbates age-related disruption of nuclear integrity and nucleocytoplasmic transport. Neuron. 94 (1), 48-57 (2017).
  30. Grima, J. C., et al. Mutant huntingtin disrupts the nuclear pore complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
  31. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  32. Guo, L., et al. Nuclear-import receptors reverse aberrant phase transitions of RNA-binding proteins with prion-like domains. Cell. 173 (3), 677-692 (2018).
  33. Hofweber, M., et al. Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation. Cell. 173 (3), 706-719 (2018).
  34. Yoshizawa, T., et al. Nuclear Import Receptor Inhibits Phase Separation of FUS through Binding to Multiple Sites. Cell. 173 (3), 693-705 (2018).
  35. Chew, J., et al. Aberrant deposition of stress granule-resident proteins linked to C9orf72-associated TDP-43 proteinopathy. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 9(2019).
  36. Zhang, Y. J., et al. Poly(GR) impairs protein translation and stress granule dynamics in C9orf72-associated frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis. Nat Medicine. 24 (8), 1136-1142 (2018).
  37. Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nature Neuroscience. 19 (5), 668-677 (2016).
  38. Zhang, Y. J., et al. Heterochromatin anomalies and double-stranded RNA accumulation underlie C9orf72 poly(PR) toxicity. Science. 363 (6428), (2019).
  39. Beck, M., Hurt, E. The nuclear pore complex: understanding its function through structural insight. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (2), 73-89 (2017).
  40. Lin, D. H., Hoelz, A. The structure of the nuclear pore complex (an update). Annual Review of Biochemistry. 88, 725-783 (2019).
  41. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissue-specific and developmental functions. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (11), 687-699 (2012).
  42. Kinoshita, Y., Kalir, T., Dottino, P., Kohtz, D. S. Nuclear distributions of NUP62 and NUP214 suggest architectural diversity and spatial patterning among nuclear pore complexes. PLoS One. 7 (4), 36137(2012).
  43. Ori, A., et al. Cell type-specific nuclear pores: a case in point for context-dependent stoichiometry of molecular machines. Molecular Systems Biology. 9, 648(2013).
  44. Rajoo, S., Vallotton, P., Onischenko, E., Weis, K. Stoichiometry and compositional plasticity of the yeast nuclear pore complex revealed by quantitative fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), 3969-3977 (2018).
  45. Li, C., Goryaynov, A., Yang, W. The selective permeability barrier in the nuclear pore complex. Nucleus. 7 (5), 430-446 (2016).
  46. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complexes and regulation of gene expression. Current Opinion in Cell Biology. 46, 26-32 (2017).
  47. Pascual-Garcia, P., Capelson, M. Nuclear pores in genome architecture and enhancer function. Current Opinion in Cell Biology. 58, 126-133 (2019).
  48. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  49. Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nature Neuroscience. 16 (7), 790-797 (2013).
  50. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  51. Wu, Y., Shroff, H. Faster, sharper, and deeper: structured illumination microscopy for biological imaging. Nature Methods. 15 (12), 1011-1019 (2018).
  52. Hampoelz, B., et al. Pre-assembled nuclear pores insert into the nuclear envelope during early development. Cell. 166 (3), 664-678 (2016).
  53. Hampoelz, B., et al. Nuclear pores assemble from nucleoporin condensates during oogenesis. Cell. 179 (3), 671-686 (2019).
  54. Agote-Aran, A., et al. Spatial control of nucleoporin condensation by fragile X-related proteins. The EMBO Journal. 39 (20), 104467(2020).
  55. Colombi, P., Webster, B. M., Fröhlich, F., Lusk, C. P. The transmission of nuclear pore complexes to daughter cells requires a cytoplasmic pool of Nsp1. The Journal of Cell Biology. 203 (2), 215-232 (2013).
  56. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  57. Löschberger, A., Franke, C., Krohne, G., van de Linde, S., Sauer, M. Correlative super-resolution fluorescence and electron microscopy of the nuclear pore complex with molecular resolution. Journal of Cell Science. 127, Pt 20 4351-4355 (2014).
  58. Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. Journal of Cell Science. 125, Pt 3 570-575 (2012).

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