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Resumen

Este protocolo describe un flujo de trabajo optimizado para el aislamiento de núcleos y la microscopía de iluminación estructurada de superresolución para evaluar nucleoporinas individuales dentro del nucleoplasma y NPC en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas y tejidos humanos postmortem.

Resumen

El complejo de poros nucleares (NPC) es una estructura macromolecular compleja compuesta por múltiples copias de ~ 30 proteínas nucleoporinas (Nups) diferentes. En conjunto, estas Nups funcionan para regular la organización del genoma, la expresión génica y el transporte nucleocitoplasmático (NCT). Recientemente, se han identificado defectos en la NCT y alteraciones en Nups específicos como patologías tempranas y destacadas en múltiples enfermedades neurodegenerativas, como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA), la Enfermedad de Alzheimer (EA)/Demencia Frontotemporal (DFT) y la Enfermedad de Huntington (EH). Los avances en microscopía óptica y electrónica permiten un examen exhaustivo de las estructuras subcelulares, incluida la NPC y sus constituyentes Nup, con mayor precisión y resolución. De las técnicas comúnmente utilizadas, la microscopía de iluminación estructurada (SIM) de superresolución ofrece una oportunidad sin precedentes para estudiar la localización y expresión de Nups individuales utilizando estrategias convencionales de etiquetado basadas en anticuerpos. El aislamiento de los núcleos antes de la SIM permite la visualización de las proteínas Nup individuales dentro de la NPC y el nucleoplasma en un espacio 3D reconstruido de forma completa y precisa. Este protocolo describe un procedimiento para el aislamiento de núcleos y SIM para evaluar la expresión y distribución de Nup en células del SNC humanas derivadas de iPSC y tejidos postmortem.

Introducción

La prevalencia de enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad está aumentando a medida que la población envejece1. Si bien los fundamentos genéticos y las características patológicas están bien caracterizados, los eventos moleculares precisos que conducen a la lesión neuronal siguen siendo poco conocidos2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Recientemente, una G4C2 La expansión de repeticiones de hexanucleótidos en el primer intrón del gen C9orf72 se identificó como la causa genética más común de las enfermedades neurodegenerativas relacionadas Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) y Demencia Frontotemporal (DFT)13,14. Varios estudios respaldan ahora el papel central de las interrupciones en la maquinaria de transporte nuclear, incluidos los complejos de poros nucleares (NPC) y los receptores de transporte nuclear (NTR, carioferinas), como causantes de la ELA C9orf7215,16. En las células que no se dividen dentro del cerebro de la rata, las nucleoporinas de andamio (Nups) son extremadamente longevas. Como resultado, se han reportado alteraciones en NPCs y NCT durante el envejecimiento17,18,19,20. Además, algunas nucleoporinas o transportinas, cuando mutan, están relacionadas con enfermedades neurológicas específicas21,22. Por ejemplo, las mutaciones en Nup62 se han relacionado con la necrosis estriada bilateral infantil (IBSN), un trastorno neurológico que afecta al núcleo caudado y al putamen23; Las mutaciones en Gle1 se han implicado en la enfermedad de la neurona motora fetal Síndrome de contractura congénita letal humana-1 (LCCS1)24; y las mutaciones en Aladin son causantes del síndrome de Triple-A25. Las alteraciones en la NCT funcional se exacerban en las enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad, como la ELA, la enfermedad de Huntington (EH) y la enfermedad de Alzheimer (EA)16,26,27,28,29,30,31. Además, se han reportado Nups y NTRs específicos como modificadores de la toxicidad mediada por C9orf72 en el Drosophila ojo28 o modificar bioquímicamente el estado de agregación de proteínas ligadas a enfermedades como FUS y tau27,32,33,34. En conjunto, estos estudios preliminares sugieren que la NCT alterada puede ser una característica patológica primaria y temprana de la ELA y la DFT. Los estudios en sistemas modelo basados en sobreexpresión han sugerido que la mala localización de Nups y carioferinas específicas puede afectar a la NCT16,35,36,37,38. Sin embargo, estos estudios de patología en realidad no relacionan las acumulaciones citoplasmáticas de proteínas NPC con defectos en la estructura o función de la NPC. Por ejemplo, esta patología puede reflejar simplemente la desregulación de los grupos citoplasmáticos de proteínas Nup con poco impacto en la composición y función de las NPC. Por el contrario, un estudio reciente que emplea microscopía de iluminación estructurada de súper resolución (SIM) demuestra la aparición de una lesión significativa en la propia NPC caracterizada por la reducción de los niveles específicos de Nup dentro del nucleoplasma y las NPC de las neuronas humanas C9orf72 ALS/FTD que en última instancia conducen a una alteración de la función de la NPC como un evento de inicio temprano en cascadas de enfermedades patógenas15.

El paso de macromoléculas entre el núcleo y el citoplasma está gobernado por el complejo de poros nucleares (NPC). El NPC es un gran complejo macromolecular incrustado en la envoltura nuclear compuesto por múltiples copias de 30 proteínas nucleoporinas (Nups)39,40,41. Aunque la estequiometría de Nup varía entre los tipos de células 42,43,44, el mantenimiento de la composición general de NPC es fundamental para la NCT, la organización del genoma y la viabilidad celular general 39,41,45,46. Como resultado, es probable que la composición alterada de las NPC y los defectos posteriores en el transporte funcional afecten a una miríada de funciones celulares posteriores. Los constituyentes Nup de la NPC están altamente organizados en múltiples subcomplejos, incluyendo el anillo citoplasmático y los filamentos, el canal central, el anillo exterior, el anillo interior, el anillo transmembrana y la cesta nuclear. En conjunto, los andamios Nups de los anillos internos, externos y transmembrana anclan las NPC dentro de la envoltura nuclear y proporcionan puntos de anclaje para los Nups del anillo citoplasmático, el canal central y la canasta nuclear. Mientras que las moléculas pequeñas (<40-60 kD) pueden difundirse pasivamente a través de la NPC, el transporte activo de cargas más grandes se ve facilitado por las interacciones entre los receptores de transporte nuclear (NTRs, carioferinas) y los FG Nups de los filamentos citoplasmáticos, el canal central y la cesta nuclear 39,40,41,45. Además, un puñado de Nups también pueden funcionar fuera del NPC, dentro del nucleoplasma, para regular la expresión génica 46,47.

Dado que la dimensión lateral de un solo NPC humano es de aproximadamente 100-120 nm40, la microscopía estándar de campo amplio o confocal es insuficiente para resolver NPC individuales48. Las técnicas de microscopía electrónica (EM) como TEM o SEM se utilizan a menudo para evaluar la estructura general de las NPC39,40. A pesar de las ventajas de estas técnicas para resolver la ultraestructura de las NPC, se utilizan con menos frecuencia para evaluar la presencia de proteínas Nup individuales dentro de la NPC. Las limitaciones técnicas de la combinación de marcadores o anticuerpos con estas tecnologías de vanguardia, TEM y SEM, no siempre permiten una evaluación precisa y fiable de las propias Nups individuales dentro de las NPC o el nucleoplasma. Además, estas técnicas pueden ser técnicamente desafiantes y aún no son ampliamente accesibles para todos los investigadores. Sin embargo, los avances recientes en microscopía óptica y fluorescencia han aumentado la accesibilidad de las tecnologías de imágenes de superresolución. Específicamente, SIM ofrece la oportunidad sin precedentes de obtener imágenes de Nups individuales con una resolución que se acerca a las dimensiones laterales de un NPC humano 40,48,49,50,51. A diferencia de otros enfoques de superresolución, como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) y la depleción de emisiones estimuladas (STED), la SIM es compatible con la inmunotinción convencional basada en anticuerpos49. Por lo tanto, SIM permite un análisis exhaustivo de todas las Nups para las que se dispone de un anticuerpo Nup específico. La capacidad de muestrear y obtener imágenes de múltiples Nups diferentes en la misma preparación proporciona ventajas significativas a otros métodos de imagen al estudiar las muchas proteínas que componen la NPC. El siguiente procedimiento detalla un protocolo optimizado para evaluar los componentes individuales de Nup de la NPC utilizando núcleos aislados de neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) (iPSN) y tejidos postmortem del sistema nervioso central (SNC) humano.

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Protocolo

Todas las muestras de sangre para la generación de iPSC y las colecciones de tejido con autopsia están aprobadas por el IRB de Johns Hopkins con la supervisión ética de Johns Hopkins. Toda la información del paciente cumple con HIPPA. El siguiente protocolo se adhiere a todos los procedimientos de bioseguridad de Johns Hopkins.

1. Preparación de portaobjetos para inmunotinción e imagen

  1. Coloque un portaobjetos de microscopio de vidrio cargado positivamente en un citembudo vacío y dibuje un círculo con un bolígrafo de barrera hidrofóbica para delinear un área para depositar los núcleos.
  2. Añadir 50 μL de 1 mg/mL de solución de colágeno (diluida en 1x PBS) en el centro del círculo dibujado en el paso 1.1 e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
  3. Aspire la solución de colágeno y deje que los portaobjetos se sequen al aire a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora.

2. Preparación de tampón de lisis y gradientes de sacarosa

  1. Prepare el tampón de lisis y las soluciones de gradiente de sacarosa de acuerdo con el protocolo del kit de aislamiento de núcleos.
    1. Para cada muestra, prepare un tubo cónico de 50 mL de tampón de lisis combinando 11 mL del tampón de lisis suministrado, 110 μL de la solución Triton X-100 al 10% suministrada y 11 μL de DTT (ditiotreitol) 1 M recién preparado o descongelado.
    2. Para cada muestra, utilice un tubo cónico de 50 mL para preparar una solución de almohadilla de sacarosa de 1,85 M combinando 27,75 mL de la solución de almohadilla de sacarosa 2 M suministrada, 2,25 mL del tampón de almohadilla de sacarosa suministrada y 30 μL de DTT 1 M recién preparado o descongelado.
      NOTA: Una solución de almohadilla de sacarosa de 1,85 M es óptima para iPSN y tejido postmortem del SNC humano, pero ajústela para otros tipos de células o muestras de tejido. Recientemente se han publicado detalles adicionales sobre las células HEK293, los astrocitos derivados de iPSC y el enriquecimiento de los núcleos de oligodendrocitos a partir de tejidos postmortem del SNC15.
  2. Mezcle suavemente las soluciones de tampón de lisis y almohadilla de sacarosa invirtiendo tubos cónicos y guárdelo en hielo.

3. Lisis de iPSNs y tejido postmortem del SNC humano

  1. Antes de proceder a la lisis, coloque el rotor de la ultracentrífuga (sin portamuestras) en la ultracentrífuga y deje que se preenfríe a 4 °C.
  2. Lisis de iPSNs.
    NOTA: Los protocolos de lisis difieren para las iPSN y el tejido postmortem del SNC humano. Siga el protocolo para el tipo de muestra especificado a continuación (paso 3.2: iPSN, paso 3.3: tejido del SNC humano post mortem).
    1. Retire los iPSN de la incubadora y aspire los medios. Enjuague brevemente con 1x PBS y agregue el tampón de lisis directamente al pocillo o placa.
      NOTA: Tenga cuidado de enjuagar adecuadamente las iPSN con una cantidad suficiente de 1x PBS para eliminar los residuos y las células muertas. El volumen de tampón de lisis que se añadirá a las placas de iPSN variará. Consulte la Tabla 1. Asegúrese de que el material de partida sea de >2,5 millones de iPSN.
    2. Raspe las iPSN con un raspador de células y transfiéralas al tampón de lisis restante en el tubo cónico de 50 ml.
    3. Tapar cada tubo cónico y agitar las muestras durante 20 s para facilitar la lisis de iPSN.
    4. Deje reposar las muestras en hielo durante 1-2 minutos antes de continuar.
  3. Lisis de tejidos postmortem del SNC humano.
    1. Pese ~ 100 mg de tejido postmortem del SNC humano congelado cortando con una cuchilla de afeitar en una placa de Petri colocada sobre un lecho de hielo seco. Asegúrese de trabajar sobre una superficie rodeada de almohadillas desechables para evitar la contaminación local de los tejidos. Preste atención a las disecciones específicas de materia gris frente a materia blanca (p. ej., manto cortical frente a materia blanca subyacente) visibles en el momento de la disección de tejido.
      NOTA: Use el EPP adecuado, incluyendo ropa protectora para los ojos y guantes cuando manipule muestras de tejido humano postmortem congeladas. Este paso también puede completarse con anticipación y las alícuotas tisulares se almacenan a -80 °C. 50 mg es una cantidad suficiente para el aislamiento de los núcleos. Sin embargo, más de 100 mg de tejido a menudo produce un aislamiento incompleto de los núcleos, como lo demuestra la presencia de citoplasma intacto alrededor de algunos núcleos.
    2. Prepare el homogeneizador Dounce limpiando y enjuagando a fondo con agua destilada. Enfríe el homogeneizador colocándolo sobre hielo.
    3. Agregue 100 mg de pañuelo al homogeneizador Dounce recién limpiado, enjuagado y enfriado (con hielo) que contiene 2 mL del tampón de lisis preparado.
    4. Homogeneizar en el homogeneizador Dounce utilizando el procedimiento estándar en hielo.
      NOTA: Por lo general, 10-20 golpes por mortero son suficientes para moverse a través de la muestra sin resistencia.
    5. Transfiera 2 mL de homogeneizado de cerebro humano post mortem a los 9 mL restantes de tampón de lisis en tubos cónicos.
    6. Agite el vórtice vigorosamente durante 30 s y déjelo reposar sobre el hielo durante 5 minutos para facilitar la lisis.

4. Aislamiento de núcleos de iPSNs y tejido postmortem del SNC humano

  1. Coloque 10 mL de solución de almohadilla de sacarosa 1,85 M (hecha en el paso 2.1.2) en el fondo de un tubo de ultracentrífuga y agregue 18 mL de solución de almohadilla de sacarosa 1,85 M a cada lisado.
  2. Mezcle suavemente la solución de almohadilla de lisado/sacarosa (combinada en el paso 4.1) invirtiendo el tubo cónico de 50 mL.
  3. Agregue lentamente 28 mL de mezcla de solución de almohadilla de lisado/sacarosa a la parte superior de los 10 mL de solución de almohadilla de sacarosa 1,85 M en el tubo de ultracentrífuga (del paso 4.1).
    NOTA: Hay un total de 29 mL de mezcla de solución de lisado/sacarosa en el tubo cónico de 50 mL (pasos 4.1-4.2). Deje 1 mL de esta mezcla de solución de lisado/sacarosa en el tubo cónico de 50 mL. Esto garantiza un pipeteo preciso y consistente entre todas las muestras debido a la viscosidad de la solución de almohadilla de sacarosa.
  4. Coloque los tubos de ultracentrífuga en los soportes y agregue una solución adicional de almohadilla de sacarosa de 1,85 M (hecha en el paso 2.1.2) según sea necesario para equilibrar las muestras.
  5. Coloque los portamuestras en el rotor de la ultracentrífuga refrigerada y haga girar a 30.000 x g, 4 °C durante 45 min.
  6. Retire los tubos de ultracentrífuga de los portamuestras y deseche los sobrenadantes. Los núcleos serán visibles como perdigones en los lados inferiores del tubo de ultracentrífuga.
  7. Vuelva a suspender los gránulos de núcleos en 1 mL del tampón de almacenamiento de núcleos suministrado mediante vórtice y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga.
  8. Centrifugar los tubos de microcentrífuga a 2.500 x g, 4 °C durante 5 min.
  9. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los núcleos mediante vórtice en 1 mL fresco del tampón de almacenamiento de núcleos suministrado.
  10. Proceda con la inmunotinción o almacene los núcleos a -80 °C.
    NOTA: Los núcleos pueden almacenarse a -80 °C durante un máximo de 6 meses y someterse a dos ciclos de congelación/descongelación antes de que la integridad estructural se vea comprometida.

5. Inmunotinción de los núcleos aislados

  1. Tome una alícuota de 10 μL de la suspensión de núcleos y cuente usando un hemacitómetro o un contador de células automatizado.
  2. Ensamble los portaobjetos preparados (del paso 1.3) en los citotros.
  3. A cada citoembudo, coloque una capa de 200 μL de tampón de almacenamiento de núcleos frescos y ~100.000 núcleos.
  4. Haga girar suavemente los núcleos sobre los portaobjetos colocando los citoembudos en un cytospin y centrifugando durante 3 minutos a 100 x g.
  5. Suelte los citoembudos e inmediatamente agregue ~ 100 μL de PFA (paraformaldehído) al 4% a los portaobjetos e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: Los núcleos también se pueden fijar con metanol. Utilice el método de fijación adecuado para cada anticuerpo. Si utiliza metanol, omita el paso de permeabilización (5.7). Los citoembudos son de un solo uso; Deséchalos en este punto.
  6. Lave los núcleos 3 veces durante 5 minutos con 1x PBS.
  7. Permeabilizar los núcleos con Triton X-100 al 0,1% en 1x PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
  8. Bloquee los núcleos en una solución en bloque (suero de cabra o burro al 10% en 1x PBS) durante 30 min a temperatura ambiente.
  9. Incubar los núcleos con anticuerpos primarios diluidos en solución en bloque durante la noche a 4 °C.
  10. Lave los núcleos 3 veces durante 5 minutos con 1x PBS.
  11. Incubar los núcleos con anticuerpos secundarios diluidos en solución en bloque durante 1 h a temperatura ambiente.
    NOTA: Se prefieren los anticuerpos secundarios Alexa Fluor 488, 568 y 647.
  12. Lave los núcleos 3 veces durante 5 minutos con 1x PBS.
  13. OPCIONAL: Incubar los núcleos durante 5 minutos con DAPI o Hoechst, seguido de dos lavados adicionales de 5 minutos con 1x PBS.
  14. Sostenga una toallita sin pelusa en el borde del círculo que contiene núcleos para eliminar por completo el último lavado de PBS.
  15. Agregue 1 gota (~ 10 μL) de un medio de montaje antidecoloración de montaje rígido (sin DAPI) a cada portaobjetos y coloque suavemente cubreobjetos cuadrados de alta tolerancia de 18 mm x 18 mm en cada portaobjetos.
    NOTA: Cuando se utiliza un medio de montaje rígido, no es necesario sellar las diapositivas si las diapositivas se visualizan dentro de un período de tiempo adecuado. Por lo general, la inmunorreactividad de Nup se ha mantenido estable en portaobjetos sin sellar almacenados a 4 °C durante ~ 6 meses. Sin embargo, los bordes del cubreobjetos se pueden sellar con una fina capa de esmalte de uñas si se utiliza un medio de montaje húmedo o para un almacenamiento prolongado.
  16. Mantenga los portaobjetos protegidos de la luz y déjelos curar durante la noche a temperatura ambiente.
  17. Tome imágenes de los núcleos mediante microscopía de iluminación estructurada (SIM) de superresolución.
    NOTA: Zeiss, Nikon y GE Healthcare fabrican microscopios SIM. Siga los protocolos específicos del sistema para la adquisición y el procesamiento de imágenes. Utilice los parámetros de imagen (potencia del láser, conjuntos de filtros, tiempo de exposición) adecuados para cada Nup y fluoróforo. Al tomar imágenes, evite los bordes del círculo (a partir del paso 1.1), ya que estos núcleos suelen estar aplanados y dispersos como resultado del paso de centrifugación (5.4). Las imágenes totalmente desconvolucionadas y procesadas pueden someterse a una serie de análisis, incluida la detección puntual y las mediciones de volumen mediante módulos de análisis 3D estándar en el software de análisis de imágenes FIJI o Imaris. Recientemente se han publicado detalles adicionales sobre los métodos de análisis15.

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Resultados

Para examinar la distribución y expresión de NPC y nucleoplásmica de POM121 en núcleos neuronales humanos, se diferenciaron las iPSN de control y C9orf72 como se describió anteriormente15. La corteza motora humana postmortem y las iPSN del día 32 se lisaron y se sometieron a aislamiento de núcleos e inmunotinción como se describió anteriormente. Se obtuvieron imágenes de núcleos aislados positivos de NeuN mediante microscopía de iluminación estructura...

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Discusión

Dada la reciente identificación de los déficits de NCT como un fenómeno temprano y prominente en múltiples enfermedades neurodegenerativas 16,27,28,30,31, existe una necesidad crítica de examinar a fondo el mecanismo por el cual ocurre esta patología. Dado que la NPC y sus proteínas Nup individuales controlan críticame...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Los tejidos postmortem del SNC humano fueron proporcionados por el Banco de Autopsias de ELA de Johns Hopkins y el Núcleo de Tejido Postmortem de la ELA Target. Este trabajo contó con el apoyo de la beca postdoctoral (ANC) Milton Safenowitz de ALSA, así como con la financiación de NIH-NINDS, el Departamento de Defensa, la Asociación de ELA, la Asociación de Distrofia Muscular, F Prime, el Programa de Respuesta a la ELA del Centro Robert Packard para la Investigación de la ELA y la Iniciativa Chan Zuckerberg.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL conical tubesFisher Scientific14-959-49A
Beckman UltracentrifugeBeckman Coulter
Cell ScrapersSarstedt83.183
CollagenAdvanced Biomatrix5005
CoverslipsMatTekPCS-170-1818
CytofunnelThermo Fisher ScientificA78710020
Cytospin 4Fisher ScientificA78300003
Dounce HomogenizersDWK Life Sciences357542
DTTSigma AldrichD0632
Eppendorf tubesFisher Scientific05-408-129
Goat Anti-Chicken Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21449
Goat Anti-Mouse Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11029
Goat Anti-Mouse Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11031
Goat Anti-Mouse Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21236
Goat Anti-Rabbit Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11034
Goat Anti-Rabbit Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11036
Goat Anti-Rabbit Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21245
Goat Anti-Rat Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11006
Goat Anti-Rat Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11077
Goat Anti-Rat Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21247
HemacytometerFisher Scientific267110
Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Normal Goat SerumVector LabsS-1000
Nuclei PURE Prep Nuclei Isolation KitSigma AldrichNUC201Contains Lysis Buffer, 10% Triton X-100, 2 M Sucrose Gradient, Sucrose Cushion Solution, and Nuclei Storage Buffer; Referenced in protocol as "nuclei isolation kit"
PBSThermo Fisher Scientific10010023
PFAElectron Microscopy Sciences15714-S
Prolong Gold AntifadeInvitrogenP36930Referenced in protocol as "hard mount antifade mounting media"
SW 32 Ti Ultracentrifuge RotorBeckman Coulter369694Referenced in protocol as "ultracentrifuge rotor"
Triton X-100Sigma AldrichT9284
Trypan BlueThermo Fisher Scientific15-250-061
Ultracentrifuge TubesBeckman Coulter344058
Nucleoporin Primary AntibodiesPrimary antibodies suitable for immunofluorescent detection of invidual nucleoporins are available from multiple companies 

Referencias

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