JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تمتلك البكتيريا المشقوقة قدرة جينومية فريدة من نوعها على انقسام N-glycan. سيكون إنتاج هذه الإنزيمات بشكل مؤتلف أداة جديدة واعدة لإطلاق N-glycans النشطة بيولوجيا من ركائز غنية بالبروتين السكري مثل اللبأ.

Abstract

الارتباط بالجليكوزيل للبروتين هو تعديل متنوع وشائع بعد الترجمة ارتبط بالعديد من الأدوار المهمة مثل وظيفة البروتين ، بما في ذلك طي البروتين ، والاستقرار ، والحماية الأنزيمية ، والتعرف البيولوجي. لا يمكن للمضيف هضم N-glycans المرتبطة بالبروتينات السكرية (مثل اللاكتوفيرين واللاكتاديرين والغلوبولين المناعي) والوصول إلى الأمعاء الغليظة ، حيث تستهلكها بعض الميكروبات المفيدة. لذلك ، فهي تعتبر مركبات البريبايوتيك من الجيل التالي التي يمكن أن تحفز بشكل انتقائي الكائنات الحية الدقيقة المفيدة لميكروبيوم الأمعاء. ومع ذلك ، فإن عزل هذه الفئات الجديدة من البريبايوتكس يتطلب إنزيمات جديدة. هنا ، نصف الإنتاج المؤتلف للجليكوسيدازات الجديدة من سلالات مختلفة من البكتيريا المشقوقة (معزولة من الرضع والأرانب والدجاج والنحل الطنان) لتحسين عزل N-glycan عن البروتينات السكرية. تتضمن الطريقة المقدمة في هذه الدراسة الخطوات التالية: الاستنساخ الجزيئي لجينات البيفيدوبكتيريا من خلال استراتيجية الاستنساخ لإعادة التركيب في الجسم الحي، والتحكم في نجاح التحول، وتحريض البروتين، وتنقية البروتين.

Introduction

الارتباط بالجليكوزيل هو تعديل مهم للغاية بعد الترجمة لوحظ في البروتينات. تم العثور على ما يقرب من 50٪ من البروتينات في أشكالها الغليكوزيلاتية في حقيقيات النوى. N- و O-glycosylation هما النوعان الرئيسيان من الارتباطبالجليكوزيل 1،2. ترتبط الجليكانات المرتبطة ب O (O-glycans) تساهميا بالبروتينات عبر N-acetylgalactosamine إلى مجموعة الهيدروكسيل من بقايا الأحماض الأمينية سيرين (Ser) أو ثريونين (Thr). الجليكان المرتبط ب N (N-glycans) عبارة عن قليل السكاريد المعقد ، والذي يرتبط تساهميا ببقايا الأحماض الأمينية الأسليوني (Asn) للبروتينات من خلال N-acetylglucosamine (GlcNAc) في تسلسل معين من الأحماض الأمينية مثلN-X-Ser / Thr وأقل شيوعا ، مثلN-X-Cys (السيستين) (حيث قد يكون X أي حمض أميني باستثناء البرولين) 3،4. يتكون قلب N-glycan الأساسي من اثنين من HexNAc وثلاثة بقايا مانوز. يحدد الاستطالة الإضافية لهذا اللب المشترك مع السكريات الأحادية الأخرى عبر إنزيمات الجليكوسيلترانسفيراز والجليكوزيداز نوع N-glycans بناء على درجة التفرع ونوع الارتباط5. يتم تجميع N-glycans بشكل عام في ثلاث فئات رئيسية: المانوز العالي (HM) ، والنوع المعقد (CT) ، والهجين (HY) 6.

N-glycans هي مركبات غير قابلة للهضم من قبل الكائنات الحية المضيفة بسبب نقص إنزيمات هيدرولاز الجليكوزيد. تصل هذه المركبات إلى الأمعاء الدقيقة / الغليظة في شكل غير مهضوم حيث تستخدمها الآلاف من الأنواع البكتيرية المختلفة ، ويمكن أن تعمل كبريبايوتكس من خلال تعزيز ميكروبات الأمعاء المتخصصة ، وخاصة أنواع البيفيدوباكتريا 7. أظهرت النتائج الحديثة أن N-glycans تحفز بشكل انتقائي نمو أنواع بكتيريةمعينة 8،9. حفزت N-glycans المنبعثة من البروتينات السكرية لحليب الأبقار بشكل انتقائي نمو سلالات Bifidobacterium longum infantis (B. infantis) ، وهي نوع مهم من البكتيريا المشقوقة في أمعاء الرضيع ، لكن الأنواع الأخرى من البكتيريا المشقوقة مثل Bifidobacterium animalis (B. animalis) لم تستخدم هذهالمركبات 9. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت دراسة حديثة في الجسم الحي أن 19 N-glycans فريدا من lactoferrin الحليب والغلوبولين المناعي يحفز بشكل انتقائي نمو B. infantis8. على وجه الخصوص ، B. infantis تمتلك قدرة جينومية على انقسام الجليكان والتمثيل الغذائي. أظهر Endo-β-N-acetylglucosaminidase (EndoBI-1) ، الذي ينتمي إلى عائلة هيدرولاز الجليكوسيل 18 ، المنتج بشكل مؤتلف من B. infantis ATCC 15697 نشاطا عاليا على البروتينات السكرية للحليب في ظروف المختبر 9،10. يمكن لإنزيم هيدرولاز جليكوسيد الجديد هذا أن يشق أجزاء N-N ′-diacetylchitobiose الموجودة في N-glycans10،11. لا يتأثر نشاط EndoBI-1 بفوكوسيل القلب وظروف التفاعل المختلفة مثل درجة الحرارة المرتفعة ، ودرجة الحموضة ، ووقت التفاعل ، وما إلى ذلك3،11،12. توفر هذه الخاصية الفريدة لهيدرولاز الجليكوزيد المشقوق أداة واعدة لإنتاج N-glycans من ركائز غنية بالبروتين السكري مثل اللبأ البقري13،14.

تم استخدام العديد من طرق إزالة الجليكوزيلات المطورة كيميائيا وإنزيميا على نطاق واسع للحصول على N-glycans و O-glycans من البروتينات السكرية2،15. تستخدم الطرق الكيميائية على نطاق واسع في علم الأحياء السكرية لإزالة الجليكوزيل من البروتينات السكرية بسبب سهولة استخدامها وتكلفتها المنخفضة وخصوصية الركيزةالعالية 16. أكثر طرق إزالة الجليكوزيلات الكيميائية شيوعا هي التخلص من β والهيدرازيناسیون17. من بين هذه الطرق ، يعتمد التخلص β على مبدأ انقسام الجليكان من البروتينات السكرية عن طريق تعرض البروتينات السكرية للظروف القلوية. يمكن أن تتحلل الجليكان المنبعثة أثناء العملية بسبب تفاعلات التخلص من β ، ولكن يمكن منع هذه المشكلة باستخدام عوامل اختزال مثل بوروهيدريد الصوديوم (NaBH4) 18،19،20. هناك قيود مختلفة في طريقة التخلص من β. تقوم العوامل المختزلة بتحويل الجليكان إلى ألديتول ، وتمنعها من ربط الفلوروفور أو الكروموفور. وبالتالي ، يصبح التحدي لمراقبة إطلاق الجليكان أمرا صعبا19،20. بسبب ارتفاع محتوى الملح في خطوة التنظيف للطريقة ، قد يؤدي الشطف إلى فقدانالعينة 20. طريقة أخرى لإطلاق الجليكان من البروتينات السكرية هي طريقة الهيدرازين القائمة على مبدأ تفاعل التحلل المائي بعد إضافة الهيدرازين اللامائي إلى البروتين السكري. نظرا لأنه يسمح بالتحكم في عزل الجليكان عن طريق تغيير ظروف التفاعل مثل درجة الحرارة ، فقد تم استخدام طريقة الترطيب على نطاق واسع في علم الأحياء السكرية21. يمكن أيضا إجراء إزالة الجليكوزيلات الكيميائية باستخدام التركيبة اللامائية لفلوريد الهيدروجين وحمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، بالإضافة إلى طرق إزالة الجليكوزيلات الكيميائيةالأخرى 16،22،23. عادة ما يتم إجراء الإطلاق الأنزيمي ل N-glycans من البروتينات السكرية بواسطة peptidyl-N-glycosidases (PNGases) التي تطلق بشكل عام N-glycans ، بغض النظر عن حجمها وشحنتها24،25،26،27. على غرار طرق إزالة الجليكوزيلات الكيميائية ، فإن عملية إزالة السكر الأنزيمية لها تحديات مختلفة. تظهر PNGases نشاطا في وجود العديد من المنظفات المستخدمة ، مما يزيد من وصول الإنزيم إلى الجليكانات. ومع ذلك ، قد تؤدي هذه العلاجات القاسية إلى تعطيل الجليكان الأصلي وهياكل عديد الببتيد المتبقية28. قد لا تشق PNGases الجليكان عندما يكون هناك فوكوز مرتبط ب N-acetylglucosamine29. تظهر الجليكوزيزيزاتات المختلفة مثل F1 و F2 و F3 نشاطا أكبر على البروتينات الأصلية من PNGases. هذه الجليكوزيزيدات لها نشاط منخفض على الجليكانات متعددة الهوائيات ، في حين أن EndoBI-1 الجديد المقاوم للحرارة فعال في جميع أنواع N-glycans 10،11،28. فيما يتعلق بقيود الطرق الحالية ، من الواضح أن الإنزيمات الجديدة لا تزال مطلوبة لإطلاق الجليكان بشكل فعال دون أي قيود. لهذا الغرض ، تتيح أنواع البكتيريا المشقوقة ، التي تحتوي على جزيرة جينومية كبيرة تشفر إنزيمات هيدرولاز جليكوسيد مختلفة ، شق N-glycans من البروتينات السكرية30،31. في نطاق هذا السياق ، الهدف العام من هذه الدراسة هو اكتشاف جليكوسيدازات جديدة من أنواع البيفيدوبكتيريا المختلفة. لإنتاج هذه الإنزيمات بشكل مؤتلف ، تهدف علامات الاندماج المختلفة إلى تعزيز إنتاجها وكذلك نشاطها.

Protocol

1. الاستنساخ الجزيئي لجينات بيفيدوبكتيريا

  1. تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للجينات المستهدفة بواسطة ثلاث مجموعات أولية ناقلات (N-His و C-His و N-His SUMO)
    1. اصنع 100 ميكرومتر من محاليل التمهيدي (oligomers) عن طريق إضافة ماء معقم بالكميات التي تحددها الشركة. قم بإعداد مخزونات جديدة من 10 ميكرومتر من هذه المخزونات لاستخدامها في تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للجينات المستهدفة.
    2. تحضير خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل (الحجم الإجمالي 50 ميكرولتر) مع 25 ميكرولتر من المزيج الرئيسي ، و 1 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي والخلفي عند 0.2 ميكرومتر ، و 21 ميكرولتر من الماء المقطر الخالي من DNase / RNase و 2 ميكرولتر من قالب الحمض النووي (الخلايا البكتيرية) في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). حرك الخليط برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
      ملاحظة: يحتوي المزيج الرئيسي (Lucigen) المستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل على بوليميراز Taq DNA مع نقاء عال ونشاط عال ويمكن أن يعمل في درجات حرارة أعلى لتضخيم موثوق للقوالب حتى 5 كيلو بايت.
    3. اضبط برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل على النحو التالي: خطوة التمسخ الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإطلاق الحمض النووي الجيني ، ثم 40 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتلدين عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية والاستطالة عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، والتمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    4. تحقق من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق طريقة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز باستخدام نظام توثيق الهلامبعد تشغيله عند 100 فولت لمدة 60 دقيقة على هلام الاغاروز 1٪. امزج منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل وسلم الحمض النووي مع صبغة التحميل عن طريق الخلط بنسبة 1: 5 (5 ميكرولتر من منتج PCR + 1 ميكرولتر من صبغة التحميل و 5 ميكرولتر من سلم الحمض النووي 1 كيلو بايت + 1 ميكرولتر من صبغة التحميل) للتحميل على الجل (الشكل 1).
    5. قياس تركيزات الحمض النووي لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مقياس الفلور قبل خطوة الاستنساخ الجزيئي.
      ملاحظة: ينبغي أن تكون تركيزات منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في النطاق المطلوب للاستنساخ الجزيئي (25-100 نانوغرام/ميكرولتر).
  2. تحضير وسط أجار مرق Lysogeny (LB) للاستنساخ الجزيئي
    1. قم بإذابة 12.5 جم من LB و 6 جم من الاغاروز في 500 مل من dH2O وأتوكلاف وسط LB agar (التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة).
    2. قم بإذابة 15 مجم من الكاناميسين مع 1 مل من الدرجة الكريهية2O وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    3. بعد التعقيم ، أضف 1 مل من الكاناميسين إلى الزجاجة التي تحتوي على 500 مل معقمة من وسط أجار LB. التركيز النهائي للكاناميسين هو 30 ميكروغرام / مل. صب 25 مل من وسائط LB أجار كاناميسين في كل طبق في خزانة المختبر.
  3. تحول الصدمة الحرارية لخلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا
    1. أضف 1-3 ميكرولتر (25 إلى 100 نانوغرام) من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل لكل سلالة في الأنبوب، بما في ذلك 40 ميكرولتر من خلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا. ثم أضف 2 ميكرولتر من الحمض النووي الناقل إلى نفس الأنبوب. قلب برفق باستخدام طرف الماصة وانقل الخلطات إلى أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل.
      ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوة على الجليد. لا تقم بسحب الماصة لأعلى ولأسفل للخلط لتجنب فقاعات الهواء وتسخين الخلايا عن غير قصد.
    2. احتضان الأنابيب التي تحتوي على الخلايا المختصة والحمض النووي على الجليد لمدة 30 دقيقة. ضع صدمة حرارية على الخليط في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية. ضع هذه الأنابيب على الجليد على الفور واحتضانها لمدة دقيقتين.
    3. أضف 960 ميكرولتر من وسط الاسترداد ، المستخدم للتعافي السريع للخلايا بعد الاستنساخ الجزيئي ، إلى الخلايا الموجودة في الأنابيب واحتضان الأنابيب عند 250 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزازية.
    4. صفيحة 100 ميكرولتر من الخلايا المحولة على ألواح أجار LB تحتوي على 30 ميكروغرام / مل من الكاناميسين. استخدم فقط خلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا كعنصر تحكم سلبي.
      ملاحظة: ضع ألواح أجار LB التي تحتوي على 30 ميكروغرام / مل من الكاناميسين المحضرة في الخطوة 1.2.2 في الحاضنة عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    5. احتضان جميع الألواح طوال الليل عند 37 درجة مئوية تحت الغلاف الجوي المحيط (الشكل 2).
  4. تحضير وسط LB لمستعمرة PCR
    1. قم بإذابة 7.5 جم من LB مع 300 مل من dH2O في زجاجة وقم بتعقيم وسط LB (التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة).
    2. قم بإذابة 9 مجم من الكاناميسين (30 ميكروغرام / مل) مع 1 مل من dH2O وضعها في -20 درجة مئوية. بعد التعقيم ، أضف 1 مل من الكاناميسين إلى الزجاجة التي تحتوي على 300 مل معقمة من وسط LB. قم بتخزين وسط الاستزراع السائل عند +4 درجة مئوية حتى استخدامه.
  5. فحص المحولات عن طريق مستعمرة PCR
    1. للتأكد من أن جميع المحولات تحمل الجينات المؤتلفة ، حدد المستعمرات بشكل عشوائي وقم بتضخيم الجينات المستهدفة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات التسلسل المزودة بمجموعة الاستنساخ.
    2. قم بتنفيذ جميع الخطوات على الثلج وقم بتبريد جميع أنابيب PCR وأنابيب 15 مل قبل الاستخدام.
    3. باستخدام طرف الماصة، انقل نصف مستعمرة محددة إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل لكل عينة. خذ نصف آخر من المستعمرة بطرف الماصة وضعها في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من الوسط السائل LB + kanamycin (المحضر في الخطوة 1.4). قم بتدوير الأنابيب سعة 15 مل واحتضان المزارع السائلة عند 250 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية طوال الليل في حاضنة اهتزازية.
    4. ضع 50 ميكرولتر من خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (25 ميكرولتر من المزيج الرئيسي ، 1 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي ، 1 ميكرولتر من التمهيدي العكسي ، 23 ميكرولتر من الماء المقطر الخالي من DNase / RNase) في جميع أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل وتفريق الخلايا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل برفق.
    5. اضبط برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإطلاق الحمض النووي الجيني عن طريق تحلل الخلايا البكتيرية ، ما مجموعه 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية للتمسخ الأولي ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية للتلدين ، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة للاستطالة ، و 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للتمديد النهائي.
    6. تحقق من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بطريقة الرحلان الكهربائي للهلام بعد تشغيلها عند 100 فولت لمدة 60 دقيقة على هلام الاغاروز بنسبة 1٪ (الشكل 3). يتم وصف تفاصيل الرحلان الكهربائي لهلام الحمض النووي في الخطوة 1.1.3.
    7. تحضير 15٪ مخزون من الجلسرين من المحولات الناجحة. ضع 500 ميكرولتر من مخزون الجلسرين بنسبة 60٪ في الأنابيب المبردة وأضف 1,500 ميكرولتر من الثقافة السائلة للمحولات الناجحة. قم بتخزين المرق الجاهز عند -80 درجة مئوية.

2. تحريض L-rhamnose للتعبير عن البروتين

  1. قم بإعداد استزراع مسبق ب 1 لتر من وسط سائل LB يحتوي على 30 ميكروغرام / مل من الكاناميسين.
  2. ضع 8 مل من وسط LB في أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل. استخدم أحد الأنابيب كعنصر تحكم سلبي يحتوي فقط على الوسط السائل. للحصول على 20٪ L-rhamnose كمرق ، قم بإذابة 0.5 جم من L-rhamnose مع 2.5 مل من dH2O وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى استخدامه.
  3. ضع 10 ميكرولتر من مخزون البكتيريا في أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على 8 مل من الوسائط السائلة. قم بدوامها برفق واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل في حاضنة الاهتزاز.
  4. صب 250 مل من وسط سائل LB في قارورة Erlenmeyer معقمة سعة 2 لتر.
  5. قم بتلقيح 2.5 مل من المزرعة السائلة الليلية في قارورة سعة 2 لتر تحتوي على وسط سائل LB بنسبة 1:100 بين القارورة والوسط ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعات في حاضنة الاهتزاز.
  6. قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر (OD600) للخلايا البكتيرية بواسطة مقياس الطيف الضوئي. عندما تصل الخلايا إلى الكثافة البصرية من 0.5-0.6 ، أضف 2.5 مل من 20٪ رامنوز (التركيز النهائي 0.2٪) إلى 250 مل من ثقافة LB واحتضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل عند 250 دورة في الدقيقة في حاضنة الاهتزاز.
  7. انقل المزرعة السائلة إلى أنابيب 5 × 50 مل ، وعينات أجهزة الطرد المركزي 3724 × جم لمدة 15 دقيقة عند +4 درجة مئوية وتخلص من المادة الطافية. قم بتخزين الكريات عند -20 درجة مئوية حتى خطوة التنقية.
    ملاحظة: لتقييم تعبير البروتين باستخدام SDS-PAGE ، اجمع 1 مل من الثقافة غير المستحثة (عندما تكون المزارع بكثافة بصرية 600 نانومتر من 0.5-0.6 ، بدون L-rhamnose) كعنصر تحكم و 1 مل من الثقافة المستحثة (بعد الحضانة بين عشية وضحاها) كعينة مستحثة. أجهزة الطرد المركزي الدقيقة لجميع العينات عند 12,000 × جم لمدة دقيقة واحدة وإعادة تعليق العينات غير المستحثة والمستحثة ب 50 ميكرولتر و 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل SDS-PAGE ، على التوالي.

3. تحلل الخلايا للإشريكية القولونية المختصة كيميائيا التي تحتوي على إنزيمات موسومة

  1. تحضير المخزن المؤقت للتحلل درجة الحموضة 8.0 (50 ملي مولار Tris-HCl ، 200 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار إيميدازول ، 1٪ SDS) ، المخزن المؤقت للتوازن الرقم الهيدروجيني 7.4 (20 ملي مولار هيدروهيدروكلوريدالصوديوم 2PO4 ، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي مولار إيميدازول) ، المخزن المؤقت للغسيل 7.4 (20 ملي مولار هيدروهيدروكلوريدالصوديوم 2PO4 ، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 25 ملي مولار إيميدازول) ، ومحلول الشطف الرقم الهيدروجيني 7.4 (20 ملي مولار هيدروهيدراتهيدروكسيد 2PO4 ، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 250 ملي إيميدازول).
  2. ضع 50 مل الأنابيب التي تحتوي على كريات الخلية عند -80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للتجميد. ثم قم بإزالة الكريات من -80 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة.
  3. أضف 5 مل من dH2O إلى الكريات وقم بإذابتها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. جهاز طرد مركزي عند 3724 × جم لمدة 15 دقيقة عند +4 درجة مئوية وتخلص من المادة الطافية.
  4. بالنسبة إلى 50 مل من كريات الاستزراع ، أضف 6,300 ميكرولتر من محلول التحلل و 63 ميكرولتر من كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTA (نسبة 1: 100) في الكريات وقم بإذابتها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. احتضنها على الجليد لمدة 30 دقيقة ، دوامة كل 10 دقائق.
  5. اضبط وضع النبض للصوتنة على أنه 10 ثوان تشغيل و 59 ثانية إيقاف التشغيل ، والسعة على أنها 37٪. ضع الأنبوب في دورق يحتوي على ثلج واغمر مسبار الصوتنة في الأنبوب.
    ملاحظة: يجب غمر المسبار تماما دون لمس أي جانب من الأنبوب.
  6. بعد عملية الصوتنة (6 نبضات لمدة 10 ثوان مع تبريد دقيقة واحدة) ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 3،724 × جم لمدة 45 دقيقة عند +4 درجة مئوية. بعد ذلك ، اجمع جميع الأجزاء الطافية في أنبوب وجهاز طرد مركزي عند 3,724 × جم لمدة 5 دقائق عند +4 درجة مئوية.
  7. اجمع المادة الطافية في أنبوب وخذ 100 ميكرولتر من العينة للرحلان الكهربائي لجل دوديسيل كبريتات الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) في الخطوة 4.7. قم بقياس تركيزات البروتين في العينات باستخدام مقياس الفلور.

4. تنقية الإنزيمات الموسومة به بطريقة الدفعات

  1. أضف 1 مل من راتنج Ni-NTA إلى أنبوب الطرد المركزي وجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 700 × جم. قم بإزالة الأنبوب بعناية وتخلص من المادة الطافية المتكونة.
  2. أضف 2 مل (ضعف حجم الراتنج) من مخزن التوازن المؤقت في الأنبوب واخلطه جيدا حتى يتم تعليق الراتنج بالكامل. قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة دقيقتين عند 700 × جم وقم بإزالة المخزن المؤقت بعناية والتخلص منه.
  3. امزج مستخلص البروتين ومخزن التوازن بنسبة 1: 1 في أنبوب الطرد المركزي. نضيف الخليط إلى الأنبوب الذي يحتوي على الراتنج ونضعه على شاكر عند 150 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. جهاز الطرد المركزي للأنبوب لمدة دقيقتين عند 700 × جم وتخلص من المادة الطافية.
  4. اغسل الراتنج ب 5 مل من محلول الغسيل وقم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة دقيقتين عند 700 × جم. كرر خطوة الغسيل حتى ينخفض تركيز المادة الطافية إلى خط الأساس.
  5. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للشطف في الأنبوب لتصفية البروتينات المرتبطة بعلامة His. جهاز الطرد المركزي للأنبوب لمدة دقيقتين عند 700 × جم. احفظ المادة الطافية وخذ 100 ميكرولتر لتحليل SDS-PAGE في الخطوة 4.7. كرر خطوة الشطف ثلاث مرات. قم بقياس تركيزات كل مادة طافية باستخدام مقياس الفلور.
  6. اجمع كل المواد الطافية في أنبوب القطع 10 كيلو دالتون وقم بطردها لمدة دقيقتين عند 700 × جم. كرر الطرد المركزي حتى ينخفض حجم المادة الطافية إلى 200 ميكرولتر عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل من حين لآخر. قم بتخزين البروتينات المنقاة عند -20 درجة مئوية وخذ 100 ميكرولتر لتحليل SDS-PAGE في الخطوة 4.7.
    ملاحظة: يجب قياس تركيز البروتين ، وإذا كان التركيز منخفضا ، يجب قياس جهاز الطرد المركزي حتى يزداد.
  7. تحليل SDS-PAGE للبروتينات المنقاة
    1. قم بإعداد جل تكديس بنسبة 4٪ (40٪ أكريلاميد / بيساكريلاميد ، 1 M Tris pH 6.8 ، 10٪ SDS ، 10٪ بيرسلفات الأمونيوم ، TEMED ، dH2O) و 12٪ جل قابل للحل (40٪ أكريلاميد / بيساكريلاميد ، 1 M Tris pH 8.8 ، 10٪ SDS ، 10٪ بيرسلفات الأمونيوم ، TEMED ، dH2O).
    2. امزج العينة مع 2x عازلة عينة Laemmli بنسبة 1: 1 واحتضانها عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتشويه طبيعة البروتينات.
      ملاحظة: يجب قياس تركيز البروتين للعينات قبل التحميل ، وسيعتمد الحجم المحمل على تركيزها للتحميل المتساوي.
    3. أضف 1x عازلة تشغيل في الخزان وقم بتحميل العينات وسلم البروتين في الآبار. قم بتشغيل البروتينات أولا عند 80 فولت ، وارفع التيار إلى 120 فولت عندما تنتقل البروتينات من هلام التكديس إلى هلام الحل.
    4. ضعي الجل في صبغة تلطيخ كوماسي الزرقاء وضعيه في شاكر لمدة 30 دقيقة. اغسل الجل بمحلول إزالة البقع (250 مل dH2O + 50 مل حمض الأسيتيك (HOAc) + 200 مل من الميثانول) ، والتقط الصورة (الشكل 4).

النتائج

تم استهداف الإنزيمات الأعضاء في هيدرولاز الجليكوسيل المختارة من أصول مختلفة في هذه الدراسة. كان من المفترض أن التطبيق المشترك للإنزيمات المختلفة ذات الهياكل المختلفة يمكن أن يوفر إطلاقا أفضل للجليكان نظرا لأنها تطورت لتكون نشطة في البروتينات السكرية المختلفة. قائمة ا?...

Discussion

توفر استراتيجية الاستنساخ لإعادة التركيب في الجسم الحي المستخدمة في الاستنساخ الجزيئي للجينات المستهدفة نتائج سريعة وموثوقة مقارنة ببروتوكولات الاستنساخ التقليدية الأخرى. على الرغم من وجود العديد من الطرق الملائمة للاستنساخ الجزيئي ، إلا أن الطريقة الموضحة في ه...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

هذه الدراسة مدعومة من قبل TUBITAK #118z146 و Uluova Süt Ticaret A.Ş (شركة Uluova لتجارة الحليب).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
EconoTaq PLUS 2X Master MixLucigen30035-1Amplification of target genes (PCR)
DNase/RNase-free distilled waterInvitrogen10977035Amplification of target genes (PCR)
Safe-Red Loading DyeabmG108-RDNA gel electrophoresis
1 kb Plus DNA LadderGoldBioD011-500DNA gel electrophoresis
Qubit protein assay kitInvitrogenQ33211Measurement of DNA concentration
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)amrescoJ106-2KGBacterial culture media
AgaroseInvitrogen16500-500Bacterial culture mediaet al.
Kanamycin MonosulfateGoldBioK-120-5Antibiotic in bacterial culture media
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, N-HisLucigen49011-1Cloning Kit
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, SUMOLucigen49013-1Cloning Kit
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, C-HisLucigen49012-1Cloning Kit
Glycerol SolutionSigma-Aldrich15524-1L-RPreparation of glycerol stock
L-Rhamnose monohydrateSigma-Aldrich83650Induction of protein expression
2X Laemmli Sample BufferClearBandTGS10SDS-Page analysis
SureCast 40% (w/v) AcrylamideInvitrogenHC2040SDS-Page analysis
SureCast APSInvitrogenHC2005SDS-Page analysis
SureCast TEMEDInvitrogenHC2006SDS-Page analysis
10X Running BufferClearBandTGS10SDS-Page analysis
Triset al.BioShopTRS001.1SDS-Page analysis and cell lysis
10% SDSClearBandS100SDS-Page analysis
PageRuler Plus Prestained Protein LadderThermoFisher26619SDS-Page analysis
ImidazoleSigma-Aldrich56750Cell lysis
NaClSigma-Aldrich31434-5Kg-RCell lysis
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrousamresco0571-1KgSodium phosphate buffer for cell lysis
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrateet al.Sigma-Aldrich04272-1KgSodium phosphate buffer for cell lysis
10-kDa-cut-off centrifugal filterAmicon®- MERCKUFC9010Purification of enzymes

References

  1. Adlerova, L., Bartoskova, A., Faldyna, M. Lactoferrin: a review. Veterinarni Medicina. 53 (9), 457-468 (2008).
  2. Karav, S., German, J. B., Rouquié, C., Le Parc, A., Barile, D. Studying lactoferrin N-glycosylation. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 870 (2017).
  3. Le Parc, A., et al. A novel endo-β-N-acetylglucosaminidase releases specific N-glycans depending on different reaction conditions. Biotechnology Progress. 31 (5), 1323-1330 (2015).
  4. Lafite, P., Daniellou, R. Rare and unusual glycosylation of peptides and proteins. Natural Product Reports. 29 (7), 729 (2012).
  5. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  6. Varki, A., et al. Structures common to different glycans. Essentials of Glyobiology. , (2009).
  7. Koropatkin, N. M., Cameron, E. A., Martens, E. C. How glycan metabolism shapes the human gut microbiota. Nature Reviews Microbiology. 10 (5), 323 (2012).
  8. Karav, S., et al. N-glycans from human milk glycoproteins are selectively released by an infant gut symbiont in vivo. Journal of Functional Foods. 61, 103485 (2019).
  9. Karav, S., et al. Oligosaccharides released from milk glycoproteins are selective growth substrates for infant-associated bifidobacteria. Applied and Environmental Microbiology. 82 (12), 3622-3630 (2016).
  10. Garrido, D., et al. Endo-β-N-acetylglucosaminidases from infant gut-associated bifidobacteria release complex N-glycans from human milk glycoproteins. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 775-785 (2012).
  11. Karav, S., et al. Kinetic characterization of a novel endo-beta-N-acetylglucosaminidase on concentrated bovine colostrum whey to release bioactive glycans. Enzyme and Microbial Technology. 77, 46-53 (2015).
  12. Karav, S., et al. Characterizing the release of bioactive N- glycans from dairy products by a novel endo-β-N-acetylglucosaminidase. Biotechnology Progress. 31 (5), 1331-1339 (2015).
  13. Sahutoglu, A. S., Duman, H., Frese, S. A., Karav, S. Structural insights of two novel N-acetyl-glucosaminidase enzymes through in silico methods. Turkish Journal Of Chemistry. 44 (6), 1703-1712 (2020).
  14. Duman, H., et al. Potential applications of Endo-β-N-Acetylglucosaminidases from Bifidobacterium longum subspecies infantis in designing value-added, next generation infant formulas. Frontiers in Nutrition. 8, 646275 (2021).
  15. Karav, S. Application of a novel Endo-β-N-Acetylglucosaminidase to isolate an entirely new class of bioactive compounds: N-Glycans. Enzymes in Food Biotechnology. , 389-404 (2019).
  16. Sojar, H. T., Bahl, O. P. A chemical method for the deglycosylation of proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 259 (1), 52-57 (1987).
  17. Dwek, R. A., Edge, C. J., Harvey, D. J., Wormald, M. R., Parekh, R. B. Analysis of glycoprotein-associated oligosaccharides. Annual Review of Biochemistry. 62 (1), 65-100 (1993).
  18. Carlson, D. M. Structures and immunochemical properties of oligosaccharides isolated from pig submaxillary mucins. Journal of Biological Chemistry. 243 (3), 616-626 (1968).
  19. Roth, Z., Yehezkel, G., Khalaila, I. Identification and quantification of protein glycosylation. International Journal of Carbohydrate Chemistry. 2012, 1-10 (2012).
  20. Turyan, I., Hronowski, X., Sosic, Z., Lyubarskaya, Y. Comparison of two approaches for quantitative O-linked glycan analysis used in characterization of recombinant proteins. Analytical Biochemistry. 446, 28-36 (2014).
  21. Patel, T., et al. Use of hydrazine to release in intact and unreduced form both N-and O-linked oligosaccharides from glycoproteins. Biochemistry. 32 (2), 679-693 (1993).
  22. Edge, A. S. B., Faltynek, C. R., Hof, L., Reichert, L. E., Weber, P. Deglycosylation of glycoproteins by trifluoromethanesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 118 (1), 131-137 (1981).
  23. Fryksdale, B. G., Jedrzejewski, P. T., Wong, D. L., Gaertner, A. L., Miller, B. S. Impact of deglycosylation methods on two-dimensional gel electrophoresis and matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry for proteomic analysis. Electrophoresis. 23 (14), 2184-2193 (2002).
  24. Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
  25. Morelle, W., Faid, V., Chirat, F., Michalski, J. C. Analysis of N- and O-linked glycans from glycoproteins using MALDI-TOF mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 534, 5-21 (2009).
  26. O'Neill, R. A. Enzymatic release of oligosaccharides from glycoproteins for chromatographic and electrophoretic analysis. Journal of Chromatography. A. 720 (1-2), 201-215 (1996).
  27. Szabo, Z., Guttman, A., Karger, B. L. Rapid release of N-linked glycans from glycoproteins by pressure-cycling technology. Analytical Chemistry. 82 (6), 2588-2593 (2010).
  28. Trimble, R. B., Tarentino, A. L. Identification of distinct endoglycosidase (endo) activities in Flavobacterium meningosepticum: endo F1, endo F2, and endo F3. Endo F1 and endo H hydrolyze only high mannose and hybrid glycans. The Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1646 (1991).
  29. Tretter, V., Altmann, F., März, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
  30. Sela, D. A., et al. The genome sequence of Bifidobacterium longum subsp. infantis reveals adaptations for milk utilization within the infant microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18964-18969 (2008).
  31. Garrido, D., Kim, J. H., German, J. B., Raybould, H. E., Mills, D. A. Oligosaccharide binding proteins from Bifidobacterium longum subsp. infantis reveal a preference for host glycans. PLoS One. 6 (3), 17315 (2011).
  32. Butt, T. R., Edavettal, S. C., Hall, J. P., Mattern, M. R. SUMO fusion technology for difficult-to-express proteins. Protein Expression and Purification. 43 (1), 1-9 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

endoglycosidases N glycan

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved