JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bifidobakteriler, N-glikan bölünmesi için benzersiz bir genomik yeteneğe sahiptir. Bu enzimlerin rekombinant olarak üretilmesi, kolostrum gibi glikoprotein açısından zengin substratlardan biyoaktif N-glikanları serbest bırakmak için umut verici yeni bir araç olacaktır.

Özet

Protein glikozilasyonu, protein katlanması, stabilite, enzimatik koruma ve biyolojik tanıma dahil olmak üzere protein fonksiyonu gibi birçok önemli rolle ilişkilendirilen çeşitli ve yaygın bir translasyon sonrası modifikasyondur. Glikoproteinlere (laktoferrin, laktadherin ve immünoglobulinler gibi) bağlı N-glikanlar, konakçı tarafından sindirilemez ve bazı faydalı mikroplar tarafından tüketildikleri kalın bağırsağa ulaşamaz. Bu nedenle, bağırsak mikrobiyomunun faydalı mikroorganizmalarını seçici olarak uyarabilen yeni nesil prebiyotik bileşikler olarak kabul edilirler. Bununla birlikte, bu yeni prebiyotik sınıflarının izolasyonu yeni enzimler gerektirir. Burada, glikoproteinlerden gelişmiş N-glikan izolasyonu için farklı Bifidobakteri suşlarından (bebeklerden, tavşanlardan, tavuklardan ve yaban arısından izole edilmiş) yeni glikozidazların rekombinant üretimini açıklıyoruz. Bu çalışmada sunulan yöntem aşağıdaki adımları içerir: Bifidobakteriyel genlerin in vivo rekombinasyonel klonlama stratejisi ile moleküler klonlanması, dönüşüm başarısının kontrolü, protein indüksiyonu ve protein saflaştırması.

Giriş

Glikozilasyon, proteinlerde gözlenen çok önemli bir translasyon sonrası modifikasyondur. Proteinlerin yaklaşık% 50'den fazlası ökaryotlarda glikosile formlarında bulunur. N- ve O-glikosilasyon, iki ana glikozilasyontürüdür 1,2. O-bağlı glikanlar (O-glikanlar), N-asetilgalaktozamin yoluyla bir serin (Ser) veya treonin (Thr) amino asit kalıntılarının hidroksil grubuna proteinlere kovalent olarak bağlanır. N-bağlı glikanlar (N-glikanlar), proteinlerin asparagin (Asn) amino asit kalıntısına N-asetilglukozamin (GlcNAc) yoluyla belirli bir amino asit dizisindeN-X-Ser/Thr ve daha az yaygın olanı, N-X-Cys (sistein) (burada X, prolin hariç herhangi bir amino asit olabilir)3,4. Bazik N-glikan çekirdeği, iki HexNAc ve üç mannoz kalıntısından oluşur. Bu ortak çekirdeğin glikosiltransferaz ve glikozidaz enzimleri yoluyla diğer monosakkaritlerle daha fazla uzaması, dallanma derecesine ve bağlantı tipine5 bağlı olarak N-glikanların tipini belirler. N-glikanlar genellikle üç ana sınıfa ayrılır: yüksek mannoz (HM), kompleks tip (BT) ve hibrit (HY)6.

N-glikanlar, glikozit hidrolaz enzimlerinin eksikliğinden dolayı konakçı organizmalar tarafından sindirilemeyen bileşiklerdir. Bu bileşikler, binlerce farklı bakteri türünün kullandığı sindirilmemiş bir formda ince / kalın bağırsağa ulaşır ve özellikle Bifidobacterium türleri7 olmak üzere özel bağırsak mikroplarını teşvik ederek prebiyotik görevi görebilirler. Son bulgular, N-glikanların belirli bakteri türlerinin 8,9 büyümesini seçici olarak uyardığını göstermiştir. Sığır sütü glikoproteinlerinden salınan N-glikanlar, bebeğin bağırsağında çok önemli bir Bifidobakteriyel tür olan Bifidobacterium longum subspecies infantis'in (B. infantis) büyümesini seçici olarak uyardı, ancak Bifidobacterium animalis (B. animalis) gibi diğer bifidobakteriyel türler bu bileşikleri kullanmadı9. Ek olarak, yakın tarihli bir in vivo çalışma, süt laktoferrin ve immünoglobulinlerden elde edilen 19 benzersiz N-glikanın, B. infantis 8'in büyümesini seçici olarak uyardığını göstermiştir. Özellikle, B. infantis glikan bölünmesi ve metabolizması için genomik bir yeteneğe sahiptir. B. infantis ATCC 15697'den rekombinant olarak üretilen glikosil hidrolaz ailesi 18'e ait bir Endo-β-N-asetilglukozaminidaz (EndoBI-1), in vitro koşullarda süt glikoproteinleri üzerinde yüksek aktivite göstermiştir 9,10. Bu yeni glikozit hidrolaz enzimi, N-glikanlarda bulunan N-N'-diasetilkitobaz kısımlarını parçalayabilir10,11. EndoBI-1'in aktivitesi, çekirdek fukosilasyonundan ve yüksek sıcaklık, pH, reaksiyon süresi vb.gibi farklı reaksiyon koşullarından etkilenmez 3,11,12. Bifidobakteriyel glikozit hidrolazların bu benzersiz özelliği, sığır kolostrumları13,14 gibi glikoprotein açısından zengin substratlardan N-glikanlar üretmek için umut verici bir araç sağlar.

Glikoproteinlerden N-glikanlar ve O-glikanlar elde etmek için kimyasal ve enzimatik olarak geliştirilmiş çeşitli deglikosilasyon yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır 2,15. Kimyasal yöntemler, kullanım kolaylığı, düşük maliyeti ve yüksek substrat özgüllüğü nedeniyle glikoproteinlerin deglikosilasyonu için glikobiyolojide yaygın olarak kullanılmaktadır16. En yaygın kimyasal deglikosilasyon yöntemleri β-eliminasyon ve hidrazinasyondur17. Bu yöntemler arasında β-eliminasyon, glikoproteinlerin alkali koşullara maruz bırakılmasıyla glikanların glikoproteinlerden ayrılması prensibine dayanmaktadır. Serbest bırakılan glikanlar, β-eliminasyon reaksiyonları nedeniyle işlem sırasında bozunabilir, ancak bu sorun sodyum borohidrür (NaBH4) gibi indirgeyici maddeler kullanılarak önlenebilir18,19,20. β eliminasyon yönteminde farklı sınırlamalar vardır. İndirgeyici ajanlar glikanları alditollere dönüştürür, bir florofor veya kromofor bağlamalarını önler. Bu nedenle, glikan salınımını izlemek zorlaşır 19,20. Yöntemin temizleme adımındaki yüksek tuz içeriği nedeniyle, elüsyon numune kayıplarınaneden olabilir 20. Glikoproteinlerden glikan salmak için başka bir yöntem, glikoproteine susuz hidrazin ilavesini takiben hidroliz reaksiyonu prensibine dayanan hidrazin yöntemidir. Sıcaklık gibi reaksiyon koşullarını değiştirerek glikanların izolasyonunu kontrol etmeye izin verdiği için hidrazinasyon yöntemi glikobiyolojide yaygın olarak kullanılmaktadır21. Kimyasal deglikosilasyon, diğer kimyasal deglikosilasyon yöntemlerine ek olarak hidrojen florür ve trifloroasetik asidin susuz formülasyonu kullanılarak da gerçekleştirilebilir 16,22,23. N-glikanların glikoproteinlerden enzimatik salınımı, yaygın olarak, boyutlarına ve yüklerine bakılmaksızın genellikle N-glikanları serbest bırakan peptidil-N-glikozidazlar (PNGazlar) tarafından gerçekleştirilir 24,25,26,27. Kimyasal deglikosilasyon yöntemlerine benzer şekilde, enzimatik deglikosilasyon işleminin farklı zorlukları vardır. PNGazlar, kullanılan çeşitli deterjanların varlığında aktivite gösterir ve bu da glikanlara enzim erişilebilirliğini arttırır. Bununla birlikte, bu sert tedaviler doğal glikanları ve kalan polipeptit yapılarını bozabilir28. PNGazlar, N-asetilglukozamin29'a bağlı bir fukoz olduğunda glikanları parçalayamaz. F1, F2 ve F3 gibi çeşitli endoglikozidazlar, doğal proteinler üzerinde PNGazlardan daha fazla aktivite gösterir. Bu endoglikozidazlar, çoklu antenli glikanlar üzerinde düşük aktiviteye sahipken, ısıya dirençli yeni EndoBI-1, tüm N-glikan tiplerinde etkilidir 10,11,28. Mevcut yöntemlerin sınırlamaları ile ilgili olarak, herhangi bir kısıtlama olmaksızın etkili bir glikan salınımı için yeni enzimlerin hala gerekli olduğu açıktır. Bu amaçla, çeşitli glikozit hidrolaz enzimlerini kodlayan büyük bir genomik adaya sahip olan Bifidobakteri türleri, glikoproteinlerden N-glikanların parçalanmasını sağlar30,31. Bu bağlam kapsamında, bu çalışmanın genel amacı, çeşitli Bifidobakteri türlerinden yeni glikozidazların keşfedilmesidir. Bu enzimleri rekombinant olarak üretmek için, farklı füzyon etiketlerinin üretimlerini ve aktivitelerini artırması amaçlanmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Bifidobakteriyel genlerin moleküler klonlanması

  1. Hedeflenen genlerin üç vektör primer seti (N-His, C-His ve N-His SUMO) ile PCR amplifikasyonu
    1. 100 μM stok primer (oligomer) solüsyonlarını firmanın belirlediği miktarlarda steril su ilave ederek yapınız. Hedef genlerin PCR amplifikasyonunda kullanılmak üzere bu stoklardan 10 μM yeni stoklar hazırlayın.
    2. PCR karışımını (toplam hacim 50 μL) 25 μL ana karışım, 0.2 μM'de 1 μL ileri ve geri primer, 21 μL DNaz/RNaz içermeyen damıtılmış su ve 2 μL şablon DNA (bakteri hücreleri) ile hazırlayın PCR tüplerinde. Karışımı yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın.
      NOT: PCR için kullanılan ana karışım (Lucigen), yüksek saflıkta ve yüksek aktiviteye sahip Taq DNA Polimeraz içerir ve şablonların 5 kb'ye kadar güvenilir amplifikasyonu için daha yüksek sıcaklıklarda çalışabilir.
    3. PCR programını şu şekilde ayarlayın: genomik DNA'nın serbest bırakılması için 5 dakika boyunca 95 ° C'de ilk denatürasyon adımı, daha sonra 30 saniye boyunca 95 ° C'de 40 döngü denatürasyon, 30 saniye boyunca 60 ° C'de tavlama ve 72 ° C'de 1 dakika uzama ve son uzatma 72 ° C'de 10 dakika.
    4. PCR ürünlerini% 1 agaroz jel üzerinde 60 dakika boyunca 100 V'ta çalıştırıldıktan sonra bir jel dokümantasyon sistemi ile agaroz jel elektroforezi yöntemiyle kontrol edin. Jel üzerine yüklemek için 1:5 oranında (5 μL PCR ürünü + 1 μL yükleme boyası ve 5 μL 1 kb DNA merdiveni + 1 μL yükleme boyası) karıştırarak PCR ürünlerini ve DNA merdivenini yükleme boyası ile karıştırın (Şekil 1).
    5. Moleküler klonlama adımından önce bir florometre kullanarak PCR ürünlerinin DNA konsantrasyonlarını ölçün.
      NOT: PCR ürünlerinin konsantrasyonları moleküler klonlama için gereken aralıkta olmalıdır (25-100 ng/μL).
  2. Moleküler klonlama için Lizojen Et Suyu (LB) agar ortamının hazırlanması
    1. 12.5 g LB ve 6 g agarozu 500 mL dH2O içinde çözün ve LB agar ortamını otoklavlayın (121 ° C'de 20 dakika boyunca sterilizasyon).
    2. 15 mg kanamisini 1 mL dH2O ile çözün ve -20 ° C'de saklayın.
    3. Otoklavlamadan sonra, steril 500 mL LB agar ortamı içeren şişeye 1 mL kanamisin ekleyin. Nihai kanamisin konsantrasyonu 30 μg/mL'dir. Laboratuvar dolabındaki her bir plakaya 25 mL LB agar kanamisin ortamı dökün.
  3. Kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerinin ısı şoku dönüşümü
    1. 40 μL kimyasal olarak yetkin E. coli hücreleri de dahil olmak üzere tüpe her suş için 1-3 μL (25 ila 100 ng) PCR ürünü ekleyin. Daha sonra, aynı tüpe 2 μL vektör DNA ekleyin. Pipet ucuyla hafifçe karıştırın ve karışımları 15 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın.
      NOT: Bu adımı buz üzerinde gerçekleştirin. Hava kabarcıklarını ve yanlışlıkla hücrelerin ısınmasını önlemek için karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetlemeyin.
    2. Yetkin hücreleri ve DNA'yı içeren tüpleri buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Karışıma 42 °C'lik bir su banyosunda 45 saniye boyunca ısı şoku uygulayın. Bu tüpleri hemen buzun üzerine koyun ve 2 dakika inkübe edin.
    3. Moleküler klonlamadan sonra hücrelerin hızlı bir şekilde geri kazanılması için kullanılan 960 μL Geri Kazanım Ortamını tüplerdeki hücrelere ekleyin ve tüpleri çalkalama inkübatörde 37 ° C'de 1 saat boyunca 250 rpm'de inkübe edin.
    4. 30 μg/mL kanamisin içeren LB agar plakaları üzerine 100 μL dönüştürülmüş hücre plakası. Negatif kontrol olarak sadece kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerini kullanın.
      NOT: Adım 1.2.2'de hazırlanan 30 μg/mL kanamisin içeren LB agar plakalarını kullanmadan önce 37 °C'de inkübatöre koyun.
    5. Tüm plakaları gece boyunca ortam atmosferi altında 37 °C'de inkübe edin (Şekil 2).
  4. Koloni PCR için LB besiyerinin hazırlanması
    1. 7.5 g LB'yi 300 mL dH2O ile bir şişede çözün ve LB ortamını otoklavlayın (121 ° C'de 20 dakika boyunca sterilizasyon).
    2. 9 mg kanamisini (30 μg/mL) 1 mL dH2O ile çözün ve -20 ° C'ye koyun. Otoklavlamadan sonra, steril 300 mL LB ortamı içeren şişeye 1 mL kanamisin ekleyin. Sıvı kültür ortamını kullanana kadar +4 °C'de saklayın.
  5. Transformantların koloni PCR ile taranması
    1. Tüm transformantların rekombinant genleri taşıdığını doğrulamak için, kolonileri rastgele seçin ve klonlama kiti ile birlikte verilen dizileme primerlerini kullanarak hedef genleri PCR ile çoğaltın.
    2. Tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirin ve kullanmadan önce tüm PCR tüplerini ve 15 mL tüpleri önceden soğutun.
    3. Bir pipet ucu kullanarak, seçilen bir koloninin yarısını her numune için PCR tüpüne aktarın. Pipet ucuyla koloninin diğer yarısını alın ve 5 mL LB+kanamisin sıvı ortamı içeren 15 mL'lik tüpe koyun (adım 1.4'te hazırlanmıştır). 15 mL'lik tüpleri vorteksleyin ve sıvı kültürleri gece boyunca 37 ° C'de 250 rpm'de çalkalanan bir inkübatörde inkübe edin.
    4. Tüm PCR tüplerine 50 μL PCR reaksiyon karışımını (25 μL ana karışım, 1 μL ileri astar, 1 μL ters astar, 23 μL DNaz/RNaz içermeyen damıtılmış su) koyun ve hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe dağıtın.
    5. PCR programını, bakteri hücrelerinin parçalanmasıyla genomik DNA'nın salınması için 5 dakika boyunca 95 ° C'ye, ilk denatürasyon için 30 saniye boyunca toplam 95 ° C'lik toplam 40 döngüye, tavlama için 30 saniye boyunca 60 ° C'ye, uzama için 1 dakika boyunca 72 ° C'ye ve son uzatma için 10 dakika boyunca 72 ° C'ye ayarlayın.
    6. %1 agaroz jel üzerinde 60 dakika boyunca 100 V'ta çalıştırıldıktan sonra PCR ürünlerini jel elektroforezi yöntemiyle kontrol edin (Şekil 3). DNA jel elektroforezinin detayları adım 1.1.3'te açıklanmıştır.
    7. Başarılı dönüştürücülerin %15 gliserol stoklarını hazırlayın. Kriyotüplere 500 μL %60 gliserol stoğu koyun ve başarılı dönüştürücülerin sıvı kültüründen 1.500 μL ekleyin. Hazırlanan stokları -80 °C'de saklayın.

2. Protein ekspresyonunun L-ramnoz indüksiyonu

  1. 30 μg/mL kanamisin içeren 1 L LB sıvı ortam içeren bir ön kültür hazırlayın.
  2. 8 mL LB ortamını 50 mL santrifüj tüplerine koyun. Tüplerden birini yalnızca sıvı ortamı içeren negatif kontrol olarak kullanın. Stok olarak% 20 L-ramnoz için, 0.5 g L-ramnozu 2.5 mL dH2O ile çözün ve kullanana kadar -20 ° C'de saklayın.
  3. 10 μL bakteri stoklarını 8 mL sıvı ortam içeren santrifüj tüplerine koyun. Onları nazikçe vorteksleyin ve çalkalama inkübatörde gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. 250 mL LB sıvı ortamı sterilize edilmiş 2 L Erlenmeyer şişesine dökün.
  5. Gece boyunca sıvı kültürün 2.5 mL'sini, şişe ile ortam arasında 1:100 oranında LB sıvı ortam içeren 2 L'lik bir şişeye aşılayın ve çalkalama inkübatörde 37 ° C ve 150 rpm'de 4 saat inkübe edin.
  6. Bakteri hücreleri için optik yoğunluğu 600 nm'de (OD600) bir spektrofotometre ile ölçün. Hücreler 0.5-0.6 optik yoğunluğa ulaştığında, 250 mL LB kültürüne 2.5 mL %20 ramnoz (nihai konsantrasyon %0.2'dir) ekleyin ve çalkalama inkübatörde gece boyunca 37 ° C'de 250 rpm'de inkübe edin.
  7. Sıvı kültürü 5 x 50 mL'lik tüplere aktarın, numuneleri 3724 x g'yi +4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peletleri saflaştırma adımına kadar -20 °C'de saklayın.
    NOT: SDS-PAGE ile protein ekspresyonunu değerlendirmek için, kontrol olarak 1 mL indüklenmemiş (kültürler 600 nm optik yoğunlukta 0.5-0.6 olduğunda, L-ramnoz olmadan) kültür ve indüklenmiş örnek olarak 1 mL indüklenmiş kültür (gece boyunca inkübasyondan sonra) toplayın. Tüm numuneleri 1 dakika boyunca 12.000 x g'da mikrosantrifüjleyin ve indüklenmemiş ve indüklenmiş numuneleri sırasıyla 50 μL ve 100 μL SDS-PAGE yükleme tamponu ile yeniden süspanse edin.

3. His etiketli enzimler içeren kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerinin hücre lizisi

  1. Lizis tamponu pH 8.0 (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM imidazol, %1 SDS), denge tamponu pH 7.4 (20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol), yıkama tamponu pH 7.4 (20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 25 mM imidazol) ve elüsyon tamponu pH 7.4 (20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol).
  2. Hücre peletlerini içeren 50 mL'lik tüpleri donması için -80 °C'de 15 dakika bekletin. Ardından, peletleri -80 °C'den çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün.
  3. Peletlere 5 mL dH2O ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek çözün. +4 °C'de 15 dakika boyunca 3724 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  4. 50 mL kültür peletleri için, peletlere 6.300 μL lizis tamponu ve 63 μL EDTA içermeyen halt proteaz inhibitör kokteyli (1:100 oran) ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek çözün. Onları 30 dakika buz üzerinde kuluçkaya yatırın, her 10 dakikada bir girdap yapın.
  5. Sonikatörün darbe modunu 10 s AÇIK ve 59 s KAPALI ve genliği% 37 olarak ayarlayın. Tüpü buz içeren bir behere yerleştirin ve sonikatörün probunu tüpe daldırın.
    NOT: Prob, tüpün herhangi bir tarafına dokunmadan tamamen daldırılmalıdır.
  6. Sonikasyon işleminden sonra (1 dakika soğutma ile 10 saniye boyunca 6 darbe), örnekleri +4 ° C'de 45 dakika boyunca 3.724 x g'da santrifüjleyin. Daha sonra, tüm süpernatan parçaları bir tüpte toplayın ve +4 °C'de 5 dakika boyunca 3.724 x g'da santrifüjleyin.
  7. Süpernatanı bir tüpe toplayın ve adım 4.7'de sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) için numuneden 100 μL alın. Numunelerin protein konsantrasyonlarını bir florometre kullanarak ölçün.

4. His etiketli enzimlerin toplu yöntemle saflaştırılması

  1. Bir santrifüj tüpüne 1 mL Ni-NTA reçinesi ekleyin ve 700 x g'da 2 dakika santrifüjleyin. Tüpü dikkatlice çıkarın ve oluşan süpernatanı atın.
  2. Tüpe 2 mL (reçine hacminin iki katı) dengeleme tamponu ekleyin ve reçine tamamen süspanse olana kadar iyice karıştırın. Tüpü 700 x g'da 2 dakika santrifüjleyin ve tamponu dikkatlice çıkarın ve atın.
  3. Protein ekstraktını ve dengeleme tamponunu bir santrifüj tüpünde 1: 1 oranında karıştırın. Karışımı reçine içeren tüpe ekleyin ve 30 dakika boyunca 150 rpm'de bir çalkalayıcıya koyun. Tüpü 700 x g'da 2 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  4. Reçineyi 5 mL yıkama tamponu ile yıkayın ve tüpü 700 x g'da 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatant konsantrasyonu taban çizgisine düşene kadar yıkama adımını tekrarlayın.
  5. Bağlı His etiketli proteinleri elüte etmek için tüpe 1 mL elüsyon tamponu ekleyin. Tüpü 700 x g'da 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı kaydedin ve adım 4.7'de SDS-PAGE analizi için 100 μL alın. Elüsyon adımını üç kez tekrarlayın. Bir florometre kullanarak her süpernatantın konsantrasyonlarını ölçün.
  6. Tüm süpernatanları 10 kDa'lık kesme tüpünde toplayın ve 700 x g'da 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatantın hacmi 200 μL'ye düşene kadar ara sıra yukarı ve aşağı pipetleyerek santrifüjlemeyi tekrarlayın. Saflaştırılmış proteinleri -20 °C'de saklayın ve adım 4.7'de SDS-PAGE analizi için 100 μL alın.
    NOT: Protein konsantrasyonu ölçülmeli ve konsantrasyon düşükse artana kadar santrifüj edilmelidir.
  7. Saflaştırılmış proteinlerin SDS-PAGE analizi
    1. %4 istifleme jeli (%40 akrilamid/bisakrilamid, 1 M Tris pH 6.8, %10 SDS, %10 amonyum persülfat, TEMED, dH2O) ve %12 çözünen jel (%40 akrilamid/bisakrilamid, 1 M Tris pH 8.8, %10 SDS, %10 amonyum persülfat, TEMED, dH2O) hazırlayın.
    2. Numuneyi 1:1 oranında 2x Laemmli numune tamponu ile karıştırın ve proteinleri denatüre etmek için 95 °C'de 5 dakika inkübe edin.
      NOT: Numunelerin protein konsantrasyonu yüklemeden önce ölçülmelidir ve yüklenen hacim, eşit yükleme için konsantrasyonlarına dayanacaktır.
    3. Tanka 1x çalışma tamponu ekleyin ve numuneleri ve protein merdivenini kuyucuklara yükleyin. Proteinleri ilk olarak 80 V'ta çalıştırın ve proteinler istifleme jelinden çözme jeline geçtiğinde akımı 120 V'a yükseltin.
    4. Jeli coomassie mavisi boyama boyasına koyun ve 30 dakika boyunca bir çalkalayıcıya koyun. Jeli leke giderici bir solüsyonla (250 mL dH2O + 50 mL asetik asit (HOAc) + 200 mL metanol) yıkayın ve görüntüyü alın (Şekil 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu çalışmada farklı kökenlerden seçilen glikosil hidrolaz üyesi enzimler hedeflenmiştir. Farklı yapılara sahip farklı enzimlerin birlikte uygulanmasının, farklı glikoproteinlerde aktif olacak şekilde evrimleştikleri için daha iyi bir glikan salınımı sağlayabileceği varsayılmıştır. Hedef genlerin listesi ve kökenleri Tablo 1'de listelenmiştir. Bakteri suşları, Belçika Koordineli Mikroorganizma Koleksiyonlarından elde edildi. Astar setleri, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Hedef genlerin moleküler klonlanması için kullanılan in vivo rekombinasyonel klonlama stratejisi, diğer geleneksel klonlama protokollerine kıyasla hızlı ve güvenilir sonuçlar sağlar. Moleküler klonlama için birçok uygun yöntem olmasına rağmen, bu makalede açıklanan yöntemin daha fazla avantajı vardır. İn vivo klonlama sistemi, diğer klonlama sistemlerinden farklı olarak, PCR ürünlerinin herhangi bir enzimatik işlemine veya saflaştırılması...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma TÜBİTAK #118z146 ve Uluova Süt Ticaret A.Ş. tarafından desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
EconoTaq PLUS 2X Master MixLucigen30035-1Amplification of target genes (PCR)
DNase/RNase-free distilled waterInvitrogen10977035Amplification of target genes (PCR)
Safe-Red Loading DyeabmG108-RDNA gel electrophoresis
1 kb Plus DNA LadderGoldBioD011-500DNA gel electrophoresis
Qubit protein assay kitInvitrogenQ33211Measurement of DNA concentration
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)amrescoJ106-2KGBacterial culture media
AgaroseInvitrogen16500-500Bacterial culture mediaet al.
Kanamycin MonosulfateGoldBioK-120-5Antibiotic in bacterial culture media
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, N-HisLucigen49011-1Cloning Kit
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, SUMOLucigen49013-1Cloning Kit
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, C-HisLucigen49012-1Cloning Kit
Glycerol SolutionSigma-Aldrich15524-1L-RPreparation of glycerol stock
L-Rhamnose monohydrateSigma-Aldrich83650Induction of protein expression
2X Laemmli Sample BufferClearBandTGS10SDS-Page analysis
SureCast 40% (w/v) AcrylamideInvitrogenHC2040SDS-Page analysis
SureCast APSInvitrogenHC2005SDS-Page analysis
SureCast TEMEDInvitrogenHC2006SDS-Page analysis
10X Running BufferClearBandTGS10SDS-Page analysis
Triset al.BioShopTRS001.1SDS-Page analysis and cell lysis
10% SDSClearBandS100SDS-Page analysis
PageRuler Plus Prestained Protein LadderThermoFisher26619SDS-Page analysis
ImidazoleSigma-Aldrich56750Cell lysis
NaClSigma-Aldrich31434-5Kg-RCell lysis
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrousamresco0571-1KgSodium phosphate buffer for cell lysis
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrateet al.Sigma-Aldrich04272-1KgSodium phosphate buffer for cell lysis
10-kDa-cut-off centrifugal filterAmicon®- MERCKUFC9010Purification of enzymes

Referanslar

  1. Adlerova, L., Bartoskova, A., Faldyna, M. Lactoferrin: a review. Veterinarni Medicina. 53 (9), 457-468 (2008).
  2. Karav, S., German, J. B., Rouquié, C., Le Parc, A., Barile, D. Studying lactoferrin N-glycosylation. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 870(2017).
  3. Le Parc, A., et al. A novel endo-β-N-acetylglucosaminidase releases specific N-glycans depending on different reaction conditions. Biotechnology Progress. 31 (5), 1323-1330 (2015).
  4. Lafite, P., Daniellou, R. Rare and unusual glycosylation of peptides and proteins. Natural Product Reports. 29 (7), 729(2012).
  5. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  6. Varki, A., et al. Structures common to different glycans. Essentials of Glyobiology. , (2009).
  7. Koropatkin, N. M., Cameron, E. A., Martens, E. C. How glycan metabolism shapes the human gut microbiota. Nature Reviews Microbiology. 10 (5), 323(2012).
  8. Karav, S., et al. N-glycans from human milk glycoproteins are selectively released by an infant gut symbiont in vivo. Journal of Functional Foods. 61, 103485(2019).
  9. Karav, S., et al. Oligosaccharides released from milk glycoproteins are selective growth substrates for infant-associated bifidobacteria. Applied and Environmental Microbiology. 82 (12), 3622-3630 (2016).
  10. Garrido, D., et al. Endo-β-N-acetylglucosaminidases from infant gut-associated bifidobacteria release complex N-glycans from human milk glycoproteins. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 775-785 (2012).
  11. Karav, S., et al. Kinetic characterization of a novel endo-beta-N-acetylglucosaminidase on concentrated bovine colostrum whey to release bioactive glycans. Enzyme and Microbial Technology. 77, 46-53 (2015).
  12. Karav, S., et al. Characterizing the release of bioactive N- glycans from dairy products by a novel endo-β-N-acetylglucosaminidase. Biotechnology Progress. 31 (5), 1331-1339 (2015).
  13. Sahutoglu, A. S., Duman, H., Frese, S. A., Karav, S. Structural insights of two novel N-acetyl-glucosaminidase enzymes through in silico methods. Turkish Journal Of Chemistry. 44 (6), 1703-1712 (2020).
  14. Duman, H., et al. Potential applications of Endo-β-N-Acetylglucosaminidases from Bifidobacterium longum subspecies infantis in designing value-added, next generation infant formulas. Frontiers in Nutrition. 8, 646275(2021).
  15. Karav, S. Application of a novel Endo-β-N-Acetylglucosaminidase to isolate an entirely new class of bioactive compounds: N-Glycans. Enzymes in Food Biotechnology. , 389-404 (2019).
  16. Sojar, H. T., Bahl, O. P. A chemical method for the deglycosylation of proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 259 (1), 52-57 (1987).
  17. Dwek, R. A., Edge, C. J., Harvey, D. J., Wormald, M. R., Parekh, R. B. Analysis of glycoprotein-associated oligosaccharides. Annual Review of Biochemistry. 62 (1), 65-100 (1993).
  18. Carlson, D. M. Structures and immunochemical properties of oligosaccharides isolated from pig submaxillary mucins. Journal of Biological Chemistry. 243 (3), 616-626 (1968).
  19. Roth, Z., Yehezkel, G., Khalaila, I. Identification and quantification of protein glycosylation. International Journal of Carbohydrate Chemistry. 2012, 1-10 (2012).
  20. Turyan, I., Hronowski, X., Sosic, Z., Lyubarskaya, Y. Comparison of two approaches for quantitative O-linked glycan analysis used in characterization of recombinant proteins. Analytical Biochemistry. 446, 28-36 (2014).
  21. Patel, T., et al. Use of hydrazine to release in intact and unreduced form both N-and O-linked oligosaccharides from glycoproteins. Biochemistry. 32 (2), 679-693 (1993).
  22. Edge, A. S. B., Faltynek, C. R., Hof, L., Reichert, L. E., Weber, P. Deglycosylation of glycoproteins by trifluoromethanesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 118 (1), 131-137 (1981).
  23. Fryksdale, B. G., Jedrzejewski, P. T., Wong, D. L., Gaertner, A. L., Miller, B. S. Impact of deglycosylation methods on two-dimensional gel electrophoresis and matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry for proteomic analysis. Electrophoresis. 23 (14), 2184-2193 (2002).
  24. Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
  25. Morelle, W., Faid, V., Chirat, F., Michalski, J. C. Analysis of N- and O-linked glycans from glycoproteins using MALDI-TOF mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 534, 5-21 (2009).
  26. O'Neill, R. A. Enzymatic release of oligosaccharides from glycoproteins for chromatographic and electrophoretic analysis. Journal of Chromatography. A. 720 (1-2), 201-215 (1996).
  27. Szabo, Z., Guttman, A., Karger, B. L. Rapid release of N-linked glycans from glycoproteins by pressure-cycling technology. Analytical Chemistry. 82 (6), 2588-2593 (2010).
  28. Trimble, R. B., Tarentino, A. L. Identification of distinct endoglycosidase (endo) activities in Flavobacterium meningosepticum: endo F1, endo F2, and endo F3. Endo F1 and endo H hydrolyze only high mannose and hybrid glycans. The Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1646(1991).
  29. Tretter, V., Altmann, F., März, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
  30. Sela, D. A., et al. The genome sequence of Bifidobacterium longum subsp. infantis reveals adaptations for milk utilization within the infant microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18964-18969 (2008).
  31. Garrido, D., Kim, J. H., German, J. B., Raybould, H. E., Mills, D. A. Oligosaccharide binding proteins from Bifidobacterium longum subsp. infantis reveal a preference for host glycans. PLoS One. 6 (3), 17315(2011).
  32. Butt, T. R., Edavettal, S. C., Hall, J. P., Mattern, M. R. SUMO fusion technology for difficult-to-express proteins. Protein Expression and Purification. 43 (1), 1-9 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Rekombinant retimBifidobakteriyel EndoglikozidazlarN glikan Sal n mProtein GlikozilasyonuPrebiyotik Bile iklerBa rsak MikrobiyomuGlikoproteinlerMolek ler KlonlamaEnzimatik KorumaProtein Safla t rma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır