Produção recombinante de endoglicosidases bifidobacterianas para liberação de N-glicano

Resumo

As bifidobactérias possuem uma capacidade genômica única para a clivagem de N-glicanos. A produção recombinante dessas enzimas seria uma nova ferramenta promissora para liberar N-glicanos bioativos de substratos ricos em glicoproteínas, como o colostro.

Resumo

A glicosilação de proteínas é uma modificação pós-traducional diversa e comum que tem sido associada a muitos papéis importantes, como a função da proteína, incluindo dobramento de proteínas, estabilidade, proteção enzimática e reconhecimento biológico. Os N-glicanos ligados às glicoproteínas (como lactoferrina, lactaderina e imunoglobulinas) não podem ser digeridos pelo hospedeiro e chegam ao intestino grosso, onde são consumidos por certos micróbios benéficos. Portanto, eles são considerados compostos prebióticos de última geração que podem estimular seletivamente os microrganismos benéficos do microbioma intestinal. No entanto, o isolamento dessas novas classes de prebióticos requer novas enzimas. Aqui, descrevemos a produção recombinante de novas glicosidases de diferentes cepas de Bifidobacteria (isoladas de bebês, coelhos, galinhas e abelhas) para melhorar o isolamento de N-glicanos de glicoproteínas. O método apresentado neste estudo inclui as seguintes etapas: clonagem molecular de genes de Bifidobactérias por uma estratégia de clonagem recombinacional in vivo, controle do sucesso da transformação, indução de proteínas e purificação de proteínas.

Introdução

A glicosilação é uma modificação pós-traducional muito importante observada em proteínas. Aproximadamente mais de 50% das proteínas são encontradas em suas formas glicosiladas em eucariotos. A N- e a O-glicosilação são os dois principais tipos de glicosilação ^1,2. Os glicanos ligados a O (O-glicanos) são ligados covalentemente a proteínas via N-acetilgalactosamina ao grupo hidroxila de resíduos de aminoácidos serina (Ser) ou treonina (Thr). Os glicanos ligados a N (N-glicanos) são oligossacarídeos complexos, que estão covalentemente ligados ao resíduo de aminoácido asparagina (Asn) das proteínas através da N-acetilglucosamina (GlcNAc) em uma sequência de aminoácidos específica comoN-X-Ser/Thr e uma menos comum, AsN-X-Cys (cisteína) (onde X pode ser qualquer aminoácido, exceto prolina)^3,4. O núcleo básico de N-glicano consiste em dois resíduos de HexNAc e três de manose. O alongamento adicional desse núcleo comum com outros monossacarídeos via enzimas glicosiltransferase e glicosidase determina o tipo de N-glicanos com base no grau de ramificação e no tipo de ligação⁵. Os N-glicanos são geralmente agrupados em três classes principais: manose alta (HM), tipo complexo (CT) e híbrido (HY)⁶.

Os N-glicanos são compostos indigestos pelos organismos hospedeiros devido à falta de enzimas glicosídeo hidrolase. Esses compostos chegam ao intestino delgado / grosso em uma forma não digerida, onde milhares de espécies bacterianas diferentes os utilizam, e podem atuar como prebióticos, promovendo micróbios intestinais especializados, especialmente espécies de Bifidobacterium ⁷. Descobertas recentes mostraram que os N-glicanos estimulam seletivamente o crescimento de certas espécies bacterianas ^8,9. Os N-glicanos liberados das glicoproteínas do leite bovino estimularam seletivamente o crescimento de Bifidobacterium longum subespécie infantis (B. infantis), que é uma espécie crucial de Bifidobactérias no intestino do bebê, mas outras espécies de bifidobactérias, como Bifidobacterium animalis (B. animalis) não utilizaram esses compostos⁹. Além disso, um estudo in vivo recente demonstrou que 19 N-glicanos únicos da lactoferrina e imunoglobulinas do leite estimulam seletivamente o crescimento de B. infantis⁸. Especialmente, B. infantis possui uma capacidade genômica para clivagem e metabolismo de glicanos. Uma Endo-β-N-acetilglucosaminidase (EndoBI-1), pertencente à família das glicosil hidrolases 18, produzida recombinantemente a partir de B. infantis ATCC 15697, mostrou alta atividade sobre glicoproteínas do leite em condições in vitro ^9,10. Esta nova enzima glicosídeo hidrolase pode clivar as partes N-N'-diacetilquitobiose encontradas nos N-glicanos ^10,11. A atividade do EndoBI-1 não é afetada pela fucosilação do núcleo e diferentes condições de reação, como alta temperatura, pH, tempo de reação, etc. ^3,11,12. Essa característica única das glicosídeos hidrolases bifidobacterianas fornece uma ferramenta promissora para a produção de N-glicanos a partir de substratos ricos em glicoproteínas, como o colostro bovino^13,14.

Vários métodos de desglicosilação desenvolvidos química e enzimaticamente têm sido amplamente utilizados para obter N-glicanos e O-glicanos a partir de glicoproteínas ^2,15. Os métodos químicos são amplamente utilizados em glicobiologia para desglicosilação de glicoproteínas devido à sua facilidade de uso, baixo custo e alta especificidade de substrato¹⁶. Os métodos de desglicosilação química mais comuns são a eliminação de β e a hidrazinação¹⁷. Dentre esses métodos, a eliminação β é baseada no princípio da clivagem dos glicanos das glicoproteínas por exposição das glicoproteínas a condições alcalinas. Os glicanos liberados podem ser degradados durante o processo devido às reações de β-eliminação, mas esse problema pode ser evitado com o uso de agentes redutores como o borohidreto de sódio (NaBH₄)18,19,20. Existem diferentes limitações no método de eliminação β. Os agentes redutores convertem glicanos em alditóis, impedindo-os de se ligarem a um fluoróforo ou cromóforo. Assim, torna-se difícil monitorar a liberação de glicanos^19,20. Devido ao alto teor de sal na etapa de limpeza do método, a eluição pode resultar em perdas amostrais²⁰. Outro método para liberar glicano das glicoproteínas é o método da hidrazina baseado no princípio da reação de hidrólise após a adição de hidrazina anidra à glicoproteína. Por permitir o controle do isolamento de glicanos por meio da alteração das condições de reação, como a temperatura, o método de hidrazinação tem sido amplamente utilizado na glicobiologia²¹. A desglicosilação química também pode ser realizada com a formulação anidra de fluoreto de hidrogênio e ácido trifluoroacético, além de outros métodos de desglicosilação química 16,22,23. A liberação enzimática de N-glicanos a partir de glicoproteínas é comumente realizada por peptidil-N-glicosidases (PNGases) que geralmente liberam N-glicanos, independentemente de seu tamanho e carga 24,25,26,27. Semelhante aos métodos de desglicosilação química, o processo de desglicosilação enzimática tem diferentes desafios. As PNGases apresentam atividade na presença de diversos detergentes utilizados, que aumentam a acessibilidade enzimática aos glicanos. No entanto, esses tratamentos agressivos podem interromper os glicanos nativos e as estruturas polipeptídicas restantes²⁸. As PNGases podem não clivar os glicanos quando há uma fucose ligada à N-acetilglucosamina²⁹. Várias endoglicosidases, como F1, F2 e F3, mostram mais atividade nas proteínas nativas do que as PNGases. Essas endoglicosidases têm baixa atividade nos glicanos de múltiplas antenas, enquanto o novo EndoBI-1 resistente ao calor é eficaz em todos os tipos de N-glicanos 10,11,28. Em relação às limitações dos métodos atuais, é óbvio que novas enzimas ainda são necessárias para uma liberação eficaz de glicanos sem quaisquer restrições. Para isso, as espécies de bifidobactérias, que possuem uma grande ilha genômica que codifica várias enzimas glicosídeos hidrolases, permitem a clivagem de N-glicanos das glicoproteínas^30,31. No âmbito deste contexto, o objetivo geral deste estudo é descobrir novas glicosidases das várias espécies de Bifidobactérias. Para produzir recombinantemente essas enzimas, diferentes etiquetas de fusão destinam-se a aumentar sua produção, bem como sua atividade.

Protocolo

1. Clonagem molecular de genes de bifidobactérias

1. Amplificação por PCR de genes-alvo por três conjuntos de primers vetoriais (N-His, C-His e N-His SUMO)
   1. Faça soluções de primer estoque de 100 μM (oligômeros) adicionando água estéril nas quantidades determinadas pela empresa. Preparar 10 μM de novas matérias-primas a partir dessas matérias-primas para serem utilizadas na amplificação dos genes-alvo por PCR.
   2. Prepare a mistura de PCR (volume total de 50 μL) com 25 μL de master mix, 1 μL de primer direto e reverso a 0,2 μM, 21 μL de água destilada livre de DNase / RNase e 2 μL de DNA molde (células bacterianas) nos tubos de PCR. Mexa delicadamente a mistura pipetando para cima e para baixo.
      NOTA: A mistura master (Lucigen) usada para PCR contém Taq DNA Polimerase com alta pureza e alta atividade e pode funcionar em temperaturas mais altas para amplificação confiável de modelos de até 5 kb.
   3. Defina o programa de PCR da seguinte forma: etapa inicial de desnaturação a 95 °C por 5 min para a liberação de DNA genômico, depois 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 s, recozimento a 60 °C por 30 s e alongamento a 72 °C por 1 min, e a extensão final a 72 °C por 10 min.
   4. Verifique os produtos de PCR pelo método de eletroforese em gel de agarose com um sistema de documentação de gel após ser executado a 100 V por 60 min com o gel de agarose a 1%. Misture os produtos de PCR e a escada de DNA com o corante de carga misturando na proporção de 1:5 (5 μL de produto de PCR + 1 μL de corante de carga e 5 μL de escada de DNA de 1 kb + 1 μL de corante de carga) para carregar no gel (Figura 1).
   5. Meça as concentrações de DNA dos produtos de PCR usando um fluorômetro antes da etapa de clonagem molecular.
      NOTA: As concentrações dos produtos de PCR devem estar na faixa necessária para a clonagem molecular (25-100 ng / μL).
2. Preparação de meio de ágar Caldo de Lisogenia (LB) para clonagem molecular
   1. Dissolver 12,5 g de LB e 6 g de agarose em 500 mL de dH₂O e autoclave o meio de ágar LB (esterilização a 121 °C por 20 min).
   2. Dissolver 15 mg de canamicina com 1 ml de dH₂O e conservar a -20 °C.
   3. Após a autoclavagem, adicione 1 mL de canamicina no frasco contendo os 500 mL estéreis de meio de ágar LB. A concentração final de canamicina é de 30 μg/mL. Despeje 25 mL de meio LB de ágar canamicina em cada placa no gabinete do laboratório.
3. Transformação por choque térmico de células de E. coli quimicamente competentes
   1. Adicione 1-3 μL (25 a 100 ng) dos produtos de PCR para cada cepa no tubo, incluindo 40 μL de células de E. coli quimicamente competentes. Em seguida, adicione 2 μL do DNA vetorial ao mesmo tubo. Agitar delicadamente com a ponta da pipeta e transferir as misturas para tubos de centrifugação de 15 ml.
      NOTA: Execute esta etapa no gelo. Não pipete para cima e para baixo para misturar para evitar bolhas de ar e aquecimento inadvertido das células.
   2. Incubar os tubos contendo as células competentes e o ADN em gelo durante 30 min. Aplicar choque térmico à mistura num banho-maria a 42 °C durante 45 s. Coloque esses tubos no gelo imediatamente e incube por 2 min.
   3. Adicione 960 μL do meio de recuperação, usado para a rápida recuperação de células após clonagem molecular, às células nos tubos e incube os tubos a 250 rpm por 1 h a 37 ° C em uma incubadora agitada.
   4. Placa 100 μL de células transformadas em placas de ágar LB contendo 30 μg/mL de canamicina. Utilizar apenas células de E. coli quimicamente competentes como controlo negativo.
      NOTA: Coloque placas de ágar LB contendo 30 μg / mL de canamicina preparada na etapa 1.2.2 na incubadora a 37 ° C antes de usar.
   5. Incubar todas as placas durante a noite a 37 °C em atmosfera ambiente (figura 2).
4. Preparação do meio LB para PCR de colônias
   1. Dissolva 7,5 g de LB com 300 mL de dH₂O em um frasco e autoclave o meio LB (esterilização a 121 ° C por 20 min).
   2. Dissolver 9 mg de canamicina (30 μg/ml) com 1 ml de dH₂O e colocar a -20 °C. Após a autoclavagem, adicione 1 mL de canamicina no frasco contendo os 300 mL estéreis de meio LB. Conservar o meio de cultura líquido a +4 °C até à sua utilização.
5. Triagem de transformantes por PCR de colônias
   1. Para confirmar que todos os transformantes carregam os genes recombinantes, selecione colônias aleatoriamente e amplifique os genes-alvo por PCR usando os primers de sequenciamento fornecidos com o kit de clonagem.
   2. Execute todas as etapas no gelo e pré-resfrie todos os tubos de PCR e tubos de 15 mL antes de usar.
   3. Usando uma ponta de pipeta, transfira metade de uma colônia selecionada para o tubo de PCR para cada amostra. Pegue outra metade da colônia com a ponta da pipeta e coloque-a no tubo de 15 mL contendo 5 mL de meio líquido LB + canamicina (preparado na etapa 1.4). Vortex os tubos de 15 mL e incubar as culturas líquidas a 250 rpm a 37 °C durante a noite em uma incubadora agitada.
   4. Coloque 50 μL de mistura de reação de PCR (25 μL de master mix, 1 μL de primer direto, 1 μL de primer reverso, 23 μL de água destilada livre de DNase / RNase) em todos os tubos de PCR e disperse as células pipetando para cima e para baixo suavemente.
   5. Defina o programa de PCR em 95 ° C por 5 min para a liberação de DNA genômico por lise de células bacterianas, um total de 40 ciclos de 95 ° C por 30 s para desnaturação inicial, 60 ° C por 30 s para recozimento, 72 ° C por 1 min para alongamento e 72 ° C por 10 min para a extensão final.
   6. Verifique os produtos de PCR pelo método de eletroforese em gel após ser executado a 100 V por 60 min no gel de agarose a 1% (Figura 3). Os detalhes da eletroforese em gel de DNA são descritos na etapa 1.1.3.
   7. Prepare estoques de glicerol a 15% dos transformantes bem-sucedidos. Coloque 500 μL de estoque de glicerol a 60% nos criotubos e adicione 1.500 μL da cultura líquida dos transformantes bem-sucedidos. Armazene os estoques preparados a -80 °C.

2. Indução de L-ramnose da expressão proteica

1. Preparar uma pré-cultura com 1 L de LB de meio líquido contendo 30 μg/ml de canamicina.
2. Coloque 8 mL do meio LB em tubos de centrífuga de 50 mL. Utilizar um dos tubos como controlo negativo contendo apenas o meio líquido. Para 20% de L-ramnose como estoque, dissolva 0,5 g de L-ramnose com 2,5 mL de dH₂O e armazene a -20 °C até usá-lo.
3. Coloque 10 μL dos estoques bacterianos nos tubos da centrífuga contendo 8 mL de meio líquido. Agite-os suavemente e incube a 37 °C durante a noite na incubadora agitada.
4. Despeje 250 mL de meio líquido LB em um frasco Erlenmeyer esterilizado de 2 L.
5. Inocular 2,5 ml da cultura líquida durante a noite num balão de 2 L contendo meio líquido LB na proporção de 1:100 entre o balão e o meio e incubar a 37 °C e 150 rpm durante 4 h na incubadora agitada.
6. Medir a densidade óptica a 600 nm (OD₆₀₀) das células bacterianas com um espectrofotómetro. Quando as células atingirem a densidade óptica de 0,5-0,6, adicione 2,5 mL de ramnose a 20% (a concentração final é de 0,2%) aos 250 mL de cultura LB e incube a 37 ° C durante a noite a 250 rpm na incubadora agitada.
7. Transferir a cultura líquida para os tubos de 5 x 50 ml, centrifugar amostras 3724 x g durante 15 min a +4 °C e rejeitar o sobrenadante. Conservar os pellets a -20 °C até à fase de depuração.
   NOTA: Para avaliar a expressão proteica com SDS-PAGE, colete 1 mL de cultura não induzida (quando culturas em densidade óptica de 600 nm de 0,5-0,6, sem L-ramnose) como controle e 1 mL de cultura induzida (após incubação durante a noite) como amostra induzida. Microcentrifugar todas as amostras a 12.000 x g por 1 min e ressuspender amostras não induzidas e induzidas com 50 μL e 100 μL de tampão de carregamento SDS-PAGE, respectivamente.

3. Lise celular de células de E. coli quimicamente competentes contendo enzimas marcadas com His

1. Prepare tampão de lise pH 8,0 (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM imidazol, 1% SDS), tampão de equilíbrio pH 7,4 (20 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol), tampão de lavagem pH 7,4 (20 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 25 mM imidazol) e tampão de eluição pH 7,4 (20 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol).
2. Coloque os tubos de 50 mL contendo os pellets de células a -80 °C por 15 min para congelar. Em seguida, remova os pellets de -80 °C e descongele à temperatura ambiente.
3. Adicione 5 mL de dH₂O aos pellets e dissolva pipetando para cima e para baixo. Centrifugar a 3724 x g durante 15 min a +4 °C e rejeitar o sobrenadante.
4. Para pellets de cultura de 50 mL, adicione 6.300 μL de tampão de lise e 63 μL de coquetel inibidor de protease sem EDTA (proporção de 1:100) nos pellets e dissolva pipetando para cima e para baixo. Incube-os no gelo por 30 min, vórtice a cada 10 min.
5. Defina o modo de pulso do sonicador como 10 s ON e 59 s OFF, e a amplitude como 37%. Coloque o tubo em um béquer contendo gelo e mergulhe a sonda do sonicador no tubo.
   NOTA: A sonda deve ser imersa completamente sem tocar em nenhum lado do tubo.
6. Após o processo de sonicação (6 pulsos por 10 s com resfriamento de 1 min), centrifugue as amostras a 3.724 x g por 45 min a +4 °C. Em seguida, recolher todas as partes sobrenadantes num tubo e centrifugar a 3.724 x g durante 5 min a +4 °C.
7. Recolher o sobrenadante para um tubo e recolher 100 μL da amostra para eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e poliacrilamida (SDS-PAGE) no passo 4.7. Meça as concentrações de proteínas das amostras usando um fluorômetro.

4. Purificação de enzimas marcadas com His pelo método em lote

1. Adicione 1 mL de resina Ni-NTA a um tubo de centrífuga e centrifugue por 2 min a 700 x g. Remova cuidadosamente o tubo e descarte o sobrenadante formado.
2. Adicione 2 mL (duas vezes o volume de resina) do tampão de equilíbrio no tubo e misture bem até que a resina esteja totalmente suspensa. Centrifugue o tubo por 2 min a 700 x g e remova e descarte cuidadosamente o tampão.
3. Misture o extrato de proteína e o tampão de equilíbrio na proporção de 1:1 em um tubo de centrífuga. Adicione a mistura ao tubo contendo resina e coloque-o em um shaker a 150 rpm por 30 min. Centrifugue o tubo por 2 min a 700 x g e descarte o sobrenadante.
4. Lave a resina com 5 mL de tampão de lavagem e centrifugue o tubo por 2 min a 700 x g. Repetir a etapa de lavagem até que a concentração do sobrenadante diminua até à linha de base.
5. Adicione 1 mL de tampão de eluição no tubo para eluir proteínas marcadas com His ligadas. Centrifugue o tubo por 2 min a 700 x g. Guarde o sobrenadante e tome 100 μL para análise SDS-PAGE na etapa 4.7. Repita a etapa de eluição três vezes. Meça as concentrações de cada sobrenadante usando um fluorômetro.
6. Recolher todos os sobrenadantes no tubo de corte de 10 kDa e centrifugá-lo durante 2 minutos a 700 x g. Repita a centrifugação até que o volume do sobrenadante diminua para 200 μL pipetando para cima e para baixo ocasionalmente. Armazenar as proteínas purificadas a -20 °C e tomar 100 μL para análise SDS-PAGE na etapa 4.7.
   NOTA: A concentração de proteína deve ser medida e, se a concentração for baixa, centrifugue até aumentar.
7. Análise SDS-PAGE das proteínas purificadas
   1. Prepare um gel de empilhamento a 4% (40% de acrilamida/bisacrilamida, 1 M Tris pH 6,8, 10% de SDS, 10% de persulfato de amônio, TEMED, dH₂O) e um gel de resolução de 12% (40% de acrilamida/bisacrilamida, 1 M Tris pH 8,8, 10% de SDS, 10% de persulfato de amônio, TEMED, dH₂O).
   2. Misture a amostra com 2x Tampão de amostra Laemmli na proporção de 1:1 e incube a 95 °C por 5 min para desnaturar as proteínas.
      NOTA: A concentração de proteína das amostras deve ser medida antes do carregamento, e o volume carregado será baseado em sua concentração para carga igual.
   3. Adicione 1x tampão de corrida no tanque e carregue as amostras e a escada de proteína nos poços. Execute as proteínas primeiro a 80 V e aumente a corrente para 120 V quando as proteínas se moverem do gel de empilhamento para o gel de resolução.
   4. Coloque o gel no corante azul coomassie e coloque em uma coqueteleira por 30 min. Lave o gel com uma solução de descoloração (250 mL dH₂O + 50 mL de ácido acético (HOAc) + 200 mL de metanol) e tire a imagem (Figura 4).

Resultados

Enzimas membros da glicosil hidrolase selecionadas de diferentes origens foram alvo deste estudo. Supôs-se que a co-aplicação de diferentes enzimas com diferentes estruturas poderia proporcionar uma melhor liberação de glicanos, uma vez que evoluíram para serem ativas em diferentes glicoproteínas. A lista de genes-alvo e sua origem está listada na Tabela 1. As cepas bacterianas foram obtidas de coleções coordenadas de microrganismos da Bélgica. Os conjuntos de...

Discussão

A estratégia de clonagem recombinacional in vivo usada para a clonagem molecular dos genes-alvo fornece resultados rápidos e confiáveis em comparação com outros protocolos tradicionais de clonagem. Embora existam muitos métodos convenientes para clonagem molecular, o método descrito neste artigo tem mais vantagens. O sistema de clonagem in vivo , ao contrário de outros sistemas de clonagem, não necessita de nenhum tratamento enzimático ou purificação dos pro...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
EconoTaq PLUS 2X Master Mix	Lucigen	30035-1	Amplification of target genes (PCR)
DNase/RNase-free distilled water	Invitrogen	10977035	Amplification of target genes (PCR)
Safe-Red Loading Dye	abm	G108-R	DNA gel electrophoresis
1 kb Plus DNA Ladder	GoldBio	D011-500	DNA gel electrophoresis
Qubit protein assay kit	Invitrogen	Q33211	Measurement of DNA concentration
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	amresco	J106-2KG	Bacterial culture media
Agarose	Invitrogen	16500-500	Bacterial culture mediaet al.
Kanamycin Monosulfate	GoldBio	K-120-5	Antibiotic in bacterial culture media
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, N-His	Lucigen	49011-1	Cloning Kit
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, SUMO	Lucigen	49013-1	Cloning Kit
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, C-His	Lucigen	49012-1	Cloning Kit
Glycerol Solution	Sigma-Aldrich	15524-1L-R	Preparation of glycerol stock
L-Rhamnose monohydrate	Sigma-Aldrich	83650	Induction of protein expression
2X Laemmli Sample Buffer	ClearBand	TGS10	SDS-Page analysis
SureCast 40% (w/v) Acrylamide	Invitrogen	HC2040	SDS-Page analysis
SureCast APS	Invitrogen	HC2005	SDS-Page analysis
SureCast TEMED	Invitrogen	HC2006	SDS-Page analysis
10X Running Buffer	ClearBand	TGS10	SDS-Page analysis
Triset al.	BioShop	TRS001.1	SDS-Page analysis and cell lysis
10% SDS	ClearBand	S100	SDS-Page analysis
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder	ThermoFisher	26619	SDS-Page analysis
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750	Cell lysis
NaCl	Sigma-Aldrich	31434-5Kg-R	Cell lysis
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous	amresco	0571-1Kg	Sodium phosphate buffer for cell lysis
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrateet al.	Sigma-Aldrich	04272-1Kg	Sodium phosphate buffer for cell lysis
10-kDa-cut-off centrifugal filter	Amicon®- MERCK	UFC9010	Purification of enzymes