N-글라이칸 방출을 위한 비피더스박테리아 엔도글리코시다아제의 재조합 생산

요약

비피더스균은 N-글라이칸 절단을 위한 독특한 유전체 능력을 가지고 있습니다. 이러한 효소를 재조합적으로 생산하는 것은 초유와 같은 당단백질이 풍부한 기질에서 생체 활성 N-글리칸을 방출하는 유망한 새로운 도구가 될 것입니다.

초록

단백질 당화(glycosylation)는 다양하고 일반적인 번역 후 변형(post-translational modification)으로, 단백질 접힘(protein folding), 안정성(stability), 효소 보호(enzymatic protection) 및 생물학적 인식(biological recognition)을 포함한 단백질 기능과 같은 많은 중요한 역할과 관련이 있습니다. 당단백질(예: 락토페린, 락타데린, 면역글로불린)에 부착된 N-글리칸은 숙주에서 소화되지 못하고 대장에 도달하여 특정 유익한 미생물에 의해 섭취됩니다. 따라서 이들은 장내 마이크로바이옴의 유익한 미생물을 선택적으로 자극할 수 있는 차세대 프리바이오틱 화합물로 간주됩니다. 그러나 이러한 새로운 종류의 프리바이오틱스를 분리하려면 새로운 효소가 필요합니다. 여기에서는 당단백질에서 N-글리칸 분리를 개선하기 위해 다양한 비피더스균 균주(유아, 토끼, 닭 및 호박벌에서 분리)에서 새로운 글리코시다아제의 재조합 생산에 대해 설명합니다. 이 연구에서 제시된 방법에는 in vivo 재조합 클로닝 전략에 의한 비피더스박테리아 유전자의 분자 클로닝, 형질전환 성공 제어, 단백질 유도 및 단백질 정제 단계가 포함됩니다.

서문

당화(glycosylation)는 단백질에서 관찰되는 매우 중요한 번역 후 변형(post-translational modification)입니다. 단백질의 약 50% 이상이 진핵생물에서 당화(glycosylated) 형태로 발견됩니다. N- 및 O- 당화 (glycosylation)는 당화 (glycosylation)의 두 가지 주요 유형입니다 ^1,2. O-결합 글라이칸(O-글리칸)은 N-아세틸갈락토사민을 통해 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr) 아미노산 잔기의 하이드록실기에 공유 결합되어 단백질에 부착됩니다. N-결합 글라이칸(N-glycans)은 복잡한 올리고당으로, N-X-Ser/Thr과 같은 특정 아미노산 서열에서 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 통해 단백질의 아스파라긴(Asn) 아미노산 잔류물에 공유 결합되며,N-X-Cys(시스테인)와 같이 (여기서 X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산일 수 있음)^3,4. 염기성 N-글리칸 코어는 2개의 HexNAc와 3개의 만노스 잔기로 구성됩니다. 글리코실트랜스퍼라제(glycosyltransferase) 및 글리코시다아제(glycosidase) 효소를 통해 다른 단당류와 함께 이 공통 코어를 추가로 연장하면 분지 정도와 결합 유형에 따라 N-글리칸의 유형이 결정됩니다⁵. N-글리칸은 일반적으로 하이 만노스(High Mannose, HM), 복합형(complex type, CT), 하이브리드(hybrid, HY)의 세 가지 주요 부류로 분류됩니다⁶.

N-글리칸은 배당체 가수분해효소가 없기 때문에 숙주 유기체에 의해 소화되지 않는 화합물입니다. 이 화합물은 소화되지 않은 형태로 소장/대장에 도달하여 수천 종의 다양한 박테리아가 이를 활용하며, 특히 비피도박테리움 종⁷의 특수 장내 미생물을 촉진하여 프리바이오틱스 역할을 할 수 있습니다. 최근의 연구 결과에 따르면 N- 글리칸은 특정 박테리아 종의 성장을 선택적으로 자극합니다^{8 , 9}. 소젖에서 방출된 당단백질은 유아의 장에서 중요한 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스(B. infantis)의 성장을 선택적으로 자극했지만, 비피도박테리움 애니멀리스(B. animalis)와 같은 다른 비피더세균 종은 이러한 화합물을 활용하지 않았다⁹. 또한, 최근의 생체 내 연구에서는 우유 락토페린과 면역글로불린에서 추출한 19종의 독특한 N-글리칸이 B. 인판티스⁸의 성장을 선택적으로 자극하는 것으로 나타났습니다. 특히 B. infantis는 글리칸 분열과 대사에 대한 유전체 능력을 가지고 있습니다. B. 인판티스 ATCC 15697에서 재조합 생산된 글리코실 가수분해효소 계열 18에 속하는 Endo-β-N-acetylglucosaminidase (EndoBI-1)는 in vitro 조건에서 우유 당단백질에 대한 높은 활성을 보여주었습니다 ^9,10. 이 새로운 배당체 가수분해효소는 N-글라이칸^10,11에서 발견되는 N-N'-디아세틸키토바이오오스 부분을 절단할 수 있습니다. EndoBI-1의 활성은 코어 푸코실화 및 고온, pH, 반응 시간 등과 같은 다양한 반응 조건의 영향을 받지 않습니다 ^3,11,12. 비피더스박테리아 배당체 가수분해효소의 이러한 독특한 특성은 소 초유^13,14와 같은 당단백질이 풍부한 기질에서 N-글리칸을 생산하기 위한 유망한 도구를 제공합니다.

당단백질로부터 N-글라이칸 및 O-글라이칸을 얻기 위해 화학적, 효소적으로 개발된 여러 탈당화 방법이 널리 사용되었습니다 ^2,15. 화학적 방법은 당단백질의 탈당화를 위해 당생물학에서 널리 사용되는데, 그 이유는 사용이 간편하고 비용이 저렴하며 기질 특이성이 높기 때문입니다¹⁶. 가장 일반적인 화학적 탈당화 방법은 β-제거(-Elimination)와 히드라진화(hydrazination)입니다¹⁷. 이러한 방법 중 β-제거는 당단백질을 알칼리성 조건에 노출시켜 당단백질에서 글라이칸을 절단하는 원리를 기반으로 합니다. 방출 된 글라이칸은 β 제거 반응으로 인해 공정 중에 분해 될 수 있지만,이 문제는 수화 붕소 나트륨 (NaBH₄) ^{18 , 19 , 20} 과 같은 환원제를 사용하여 예방할 수 있습니다. β 제거 방법에는 여러 가지 제한 사항이 있습니다. 환원제는 글리칸을 알디톨로 변환하여 형광단 또는 발색단과 결합하는 것을 방지합니다. 따라서 글라이칸 방출을 모니터링하기가 어려워집니다 ^19,20. 이 방법의 세척 단계에서 염분 함량이 높기 때문에 용출로 인해 샘플 손실이 발생할 수 있습니다²⁰. 당단백질에서 글리칸을 방출하는 또 다른 방법은 당단백질에 무수 히드라진을 첨가한 후 가수분해 반응의 원리에 기초한 히드라진 방법입니다. 온도와 같은 반응 조건을 변경하여 글라이칸의 분리를 제어할 수 있기 때문에 히드라진화 방법은 당생물학²¹에서 널리 사용되었습니다. 화학적 탈당화는 다른 화학적 탈당화 방법 외에도 불화수소 및 트리플루오로아세트산의 무수 제형을 사용하여 수행할 수도 있습니다 16,22,23. 당 단백질에서 N- 글리칸의 효소 방출은 일반적으로 펩티딜 -N- 글리코 시다 아제 (PNGase)에 의해 수행되며, 일반적으로 크기와 전하에 관계없이 N- 글리칸을 방출합니다^{24 , 25 , 26 , 27}. 화학적 탈당화 방법과 유사하게 효소 탈당화 공정에는 다양한 문제가 있습니다. PNGase는 여러 세제가 사용되었을 때 활성을 나타내며, 이는 글리칸에 대한 효소 접근성을 증가시킵니다. 그러나 이러한 가혹한 처리는 천연 글리칸과 나머지 폴리펩티드 구조를 파괴할 수 있습니다²⁸. PNGase는 N-아세틸글루코사민²⁹에 연결된 푸코스가 있을 때 글라이칸을 절단하지 않을 수 있습니다. F1, F2 및 F3와 같은 다양한 내화효소는 PNGase보다 천연 단백질에서 더 많은 활성을 보여줍니다. 이러한 엔데글리코시다아제는 다중 안테나 글라이칸에서 활성이 낮은 반면, 내열성 새로운 EndoBI-1은 모든 유형의 N-글라이칸에 효과적입니다 10,11,28. 현재 방법의 한계와 관련하여, 어떠한 제한 없이 효과적인 글라이칸 방출을 위해서는 새로운 효소가 여전히 필요하다는 것은 명백합니다. 이를 위해 다양한 배당체 가수분해효소를 암호화하는 큰 게놈섬을 가진 비피더박테리아 종은 당단백질에서 N-글라이칸을 절단할 수 있습니다^30,31. 이러한 맥락에서 이 연구의 전반적인 목적은 다양한 비피더스균 종에서 새로운 글리코시다아제를 발견하는 것입니다. 이러한 효소를 재조합적으로 생산하기 위해 다양한 융합 태그는 효소의 생산과 활성을 향상시키기 위한 것입니다.

프로토콜

1. 비피더스균 유전자의 분자 클로닝

1. 3개의 벡터 프라이머 세트(N-His, C-His, N-His SUMO)에 의한 표적 유전자의 PCR 증폭
   1. 회사에서 정한 양으로 멸균수를 첨가하여 100μM 스톡 프라이머(올리고머) 용액을 만듭니다. 이러한 스톡에서 10μM의 새로운 스톡을 준비하여 타겟 유전자의 PCR 증폭에 사용합니다.
   2. PCR 튜브에서 마스터 믹스 25μL, 0.2μM에서 정방향 및 역방향 프라이머 1μL, DNase/RNase가 없는 증류수 21μL 및 템플릿 DNA(박테리아 세포) 2μL가 포함된 PCR 혼합물(총 부피 50μL)을 준비합니다. 위아래로 피펫팅하여 혼합물을 부드럽게 저어줍니다.
      참고: PCR에 사용되는 마스터 믹스(Lucigen)에는 순도가 높고 활성이 높은 Taq DNA 중합효소가 포함되어 있으며 최대 5kb의 템플릿을 안정적으로 증폭하기 위해 더 높은 온도에서 작동할 수 있습니다.
   3. PCR 프로그램을 다음과 같이 설정하십시오 : 게놈 DNA의 방출을 위해 95 ° C에서 5 분 동안 초기 변성 단계, 30 초 동안 95 ° C에서 40 사이클의 변성, 60 ° C에서 30 초 동안 어닐링, 72 ° C에서 1 분 동안 연신, 72 ° C에서 10 분 동안 최종 연장.
   4. 1% 아가로스 겔에 대해 100V에서 60분 동안 실행한 후 겔 문서화 시스템으로 아가로스 젤 전기영동법으로 PCR 산물을 확인합니다. PCR 산물과 DNA ladder를 1:5(PCR 산물 5μL + 로딩 염료 1μL 및 1kb DNA ladder 5μL + 로딩 염료 1μL)의 비율로 혼합하여 겔에 로드합니다(그림 1).
   5. 분자 클로닝 단계 전에 형광측정기를 사용하여 PCR 산물의 DNA 농도를 측정합니다.
      참고: PCR 산물의 농도는 분자 클로닝(25-100ng/μL)에 필요한 범위 내에 있어야 합니다.
2. 분자 클로닝을 위한 Lysogeny Broth (LB) 한천 배지의 준비
   1. LB 12.5g과 아가로스 6g을 500mL의 dH₂O에 용해시키고 LB 한천 배지를 오토클레이브합니다(121°C에서 20분 동안 멸균).
   2. 카나마이신 15mg을 dH_2O1mL로 용해하고 -20°C에서 보관하십시오.
   3. 고압증기멸균 후 멸균 500mL의 LB 한천 배지가 들어 있는 병에 1mL의 카나마이신을 추가합니다. 카나마이신의 최종 농도는 30μg/mL입니다. 실험실 캐비닛의 각 플레이트에 25mL의 LB 한천 카나마이신 배지를 붓습니다.
3. 화학적으로 적극적인 대장균 세포의 열충격 변형
   1. 화학적으로 적합한 대장균 세포 40 μL를 포함하여 각 균주에 대한 PCR 산물 1-3 μL (25 - 100 ng)를 튜브에 추가합니다. 그런 다음 벡터 DNA 2 μL를 동일한 튜브에 추가합니다. 피펫 팁으로 부드럽게 저어주고 혼합물을 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
      참고: 얼음 위에서 이 단계를 수행합니다. 기포와 실수로 세포가 따뜻해지는 것을 방지하기 위해 혼합하기 위해 위아래로 피펫팅하지 마십시오.
   2. 유능한 세포와 DNA가 들어있는 튜브를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 42°C 수조에서 45초 동안 혼합물에 열 충격을 가합니다. 이 튜브를 즉시 얼음 위에 넣고 2분 동안 배양합니다.
   3. 분자 클로닝 후 세포의 빠른 회수에 사용되는 회수 배지 960 μL를 튜브의 세포에 추가하고 진탕 인큐베이터에서 37 °C에서 1시간 동안 250 rpm으로 튜브를 배양합니다.
   4. 30μg/mL의 카나마이신을 함유한 LB 한천 플레이트에 형질전환된 세포 100μL를 플레이트화합니다. 화학적으로 적극적인 대장균 세포만 음성 대조군으로 사용하십시오.
      참고: 사용하기 전에 1.2.2단계에서 준비한 30μg/mL의 카나마이신이 함유된 LB 한천 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 넣습니다.
   5. 모든 플레이트를 주변 대기에서 37°C에서 밤새 배양합니다(그림 2).
4. 콜로니 PCR을 위한 LB 배지의 준비
   1. 7.5g의 LB를 300mL의 dH₂O와 함께 병에 용해시키고 LB 배지를 오토클레이브합니다(121°C에서 20분 동안 멸균).
   2. 9mg의 카나마이신(30μg/mL)을 1mL의_dH2O에 녹이고 -20°C에 둔다. 오토클레이빙 후 멸균 300mL의 LB 배지가 들어 있는 병에 1mL의 카나마이신을 추가합니다. 액체 배양 배지를 사용할 때까지 +4°C에서 보관하십시오.
5. 콜로니 PCR에 의한 형질전환체의 스크리닝
   1. 모든 형질전환체가 재조합 유전자를 운반하는지 확인하기 위해, 콜로니를 무작위로 선택하고 클로닝 키트와 함께 제공된 염기서열분석 프라이머를 사용하여 PCR로 표적 유전자를 증폭합니다.
   2. 얼음 위에서 모든 단계를 수행하고 사용하기 전에 모든 PCR 튜브와 15mL 튜브를 사전 냉각합니다.
   3. 피펫 팁을 사용하여 선택한 콜로니의 절반을 각 샘플에 대한 PCR 튜브로 옮깁니다. 피펫 팁으로 콜로니의 다른 절반을 취하여 5mL의 LB+kanamycin 액체 배지가 들어 있는 15mL 튜브에 넣습니다(1.4단계에서 준비). 15mL 튜브를 소용돌이치고 진탕 인큐베이터에서 하룻밤 동안 37°C에서 250rpm으로 액체 배양물을 배양합니다.
   4. PCR 반응 혼합물 50 μL(마스터 믹스 25 μL, 순방향 프라이머 1 μL, 역방향 프라이머 1 μL, DNase/RNase-free 증류수 23 μL)을 모든 PCR 튜브에 넣고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 분산시킵니다.
   5. PCR 프로그램을 박테리아 세포를 용해시켜 게놈 DNA를 방출하기 위해 95°C에서 5분 동안 PCR 프로그램을 설정하고, 초기 변성을 위해 30초 동안 95°C, 어닐링을 위해 30초 동안 60°C, 연신율을 위해 72°C에서 1분, 최종 연장을 위해 10분 동안 72°C를 설정합니다.
   6. 1% 아가로스 겔에 대해 100V에서 60분 동안 실행한 후 겔 전기영동법으로 PCR 산물을 확인합니다(그림 3). DNA 젤 전기 이동법의 세부사항은 단계 1.1.3에서 기술됩니다.
   7. 성공적인 형질전환체의 15% 글리세롤 스톡을 제조한다. 500 μL의 60% 글리세롤 스톡을 cryotubes에 넣고 성공적인 형질전환체의 액체 배양 1,500 μL를 첨가합니다. 준비된 재고는 -80 °C에서 보관하십시오.

2. 단백질 발현의 L-람노스 유도

1. 30μg/mL의 카나마이신을 함유하는 1L의 LB 액체 배지로 사전 배양을 준비합니다.
2. LB 배지 8mL를 50mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 튜브 중 하나를 액체 매체만 포함하는 네거티브 대조군으로 사용하십시오. 20% L-람노스를 육수로 사용하는 경우, L-람노스 0.5g을 2.5mL의 dH_2O에 용해시키고 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
3. 10μL의 박테리아 스톡을 8mL의 액체 매체가 들어 있는 원심분리 튜브에 넣습니다. 부드럽게 소용돌이치고 37°C에서 흔들리는 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.
4. 250mL의 LB 액체 배지를 멸균된 2L 삼각 플라스크에 붓습니다.
5. 하룻밤 동안 배양한 액체 배양 2.5mL를 플라스크와 배지 사이의 1:100 비율로 LB 액체 배지가 포함된 2L 플라스크에 접종하고 진탕 인큐베이터에서 37시간 동안 150°C 및 4rpm에서 배양합니다.
6. 분광 광도계로 박테리아 세포에 대한 600nm(OD₆₀₀)의 광학 밀도를 측정합니다. 세포가 광학 밀도 0.5-0.6에 도달하면 250mL의 LB 배양액에 2.5mL의 20% 람노스(최종 농도는 0.2%)를 첨가하고 진탕 인큐베이터에서 37°C에서 250rpm으로 하룻밤 동안 배양합니다.
7. 액상 배양액을 5 x 50 mL 튜브로 옮기고 +4 °C에서 15분 동안 3724 x g 를 원심분리 샘플로 옮기고 상등액을 버립니다. 정제 단계까지 펠릿을 -20 °C에서 보관하십시오.
   참고: SDS-PAGE로 단백질 발현을 평가하려면 대조군으로 1mL의 비유도(L-rhamnose 없이 0.5-0.6의 광학 밀도 600nm에서 배양할 때) 배양물을 수집하고 유도 샘플로 1mL의 유도 배양(하룻밤 배양 후)을 수집합니다. 1분 동안 12,000 x g 에서 모든 시료를 미세 원심분리하고 각각 50 μL 및 100 μL의 SDS-PAGE 로딩 버퍼로 비유도 및 유도 시료를 재현탁합니다.

3. His-tagged 효소를 포함하는 화학적으로 적극적인 E. coli 세포의 세포 용해

1. 용해 완충액 pH 8.0(50mM Tris-HCl, 200mM NaCl, 1mM 이미다졸, 1% SDS), 평형 완충액 pH 7.4(20mM NaH_2PO4, 300mM NaCl, 10mM 이미다졸), 세척 완충액 pH 7.4(20mM NaH_2PO4, 300mM NaCl, 25mM 이미다졸) 및 용리 완충액 pH 7.4(20mM NaH_2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸).
2. 세포 펠릿이 들어 있는 50mL 튜브를 -80°C에서 15분 동안 얼립니다. 그런 다음 -80 °C에서 펠릿을 제거하고 실온에서 해동합니다.
3. 펠릿에 5mL의 dH₂O를 추가하고 위아래로 피펫팅하여 용해시킵니다. 3724 x g 에서 +4 °C에서 15분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다.
4. 50mL 배양 펠릿의 경우 6,300μL의 용해 완충액과 63μL의 EDTA-free 정지 프로테아제 억제제 칵테일(1:100 비율)을 펠릿에 추가하고 위아래로 피펫팅하여 용해합니다. 얼음 위에서 30분 동안 배양하고 10분마다 소용돌이치게 합니다.
5. 초음파 발생기의 펄스 모드를 10초 켜짐 및 59초 꺼짐으로 설정하고 amp위도를 37%로 설정합니다. 얼음이 들어있는 비커에 튜브를 넣고 초음파 발생기의 프로브를 튜브에 담그십시오.
   알림: 프로브는 튜브의 어느 면에도 닿지 않고 완전히 잠겨야 합니다.
6. 초음파 처리 공정 (1 분 냉각으로 10 초 동안 6 펄스) 후 + 4 ° C에서 45 분 동안 3,724 x g 에서 샘플을 원심 분리하십시오. 다음으로, 튜브와 원심분리기의 모든 상등액 부품을 3,724 x g 에서 +4 °C에서 5분 동안 수집합니다.
7. 상층액을 튜브에 모으고 4.7단계에서 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)용 샘플 100μL를 채취합니다. 형광측정기를 사용하여 샘플의 단백질 농도를 측정합니다.

4. 배치 방법에 의한 His 태그 효소의 정제

1. 원심분리기 튜브에 Ni-NTA 수지 1mL를 넣고 700 x g에서 2분 동안 원심분리합니다. 튜브를 조심스럽게 제거하고 형성된 상층액을 버립니다.
2. 평형 완충액 2mL(수지 부피의 2배)를 튜브에 넣고 수지가 완전히 현탁될 때까지 잘 혼합합니다. 700 x g 에서 튜브를 2분 동안 원심분리하고 완충액을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다.
3. 단백질 추출물과 평형 완충액을 원심분리 튜브에서 1:1의 비율로 혼합합니다. 수지가 들어 있는 튜브에 혼합물을 넣고 150rpm의 셰이커에 30분 동안 넣습니다. 700 x g 에서 튜브를 2분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
4. 5mL의 세척 버퍼로 수지를 세척하고 700 x g에서 2분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상층액의 농도가 기준선까지 감소할 때까지 세척 단계를 반복합니다.
5. 튜브에 1mL의 용리 완충액을 추가하여 결합된 His 태그 단백질을 용리합니다. 튜브를 700 x g에서 2분 동안 원심분리합니다. 상층액을 저장하고 4.7단계에서 SDS-PAGE 분석을 위해 100μL를 취합니다. 용리 단계를 세 번 반복합니다. 형광측정기를 사용하여 각 상층액의 농도를 측정합니다.
6. 10 kDa cut-off tube에 있는 모든 상층액을 모으고 700 x g에서 2분 동안 원심분리합니다. 상등액의 부피가 200 μL로 감소할 때까지 가끔 위아래로 피펫팅하여 원심분리를 반복합니다. 정제된 단백질을 -20°C에서 보관하고 4.7단계에서 SDS-PAGE 분석을 위해 100μL를 취합니다.
   참고: 단백질 농도를 측정해야 하며, 농도가 낮으면 농도가 증가할 때까지 원심분리해야 합니다.
7. 정제된 단백질의 SDS-PAGE 분석
   1. 4% 스태킹 겔(40% 아크릴아미드/비아크릴아미드, 1M 트리스 pH 6.8, 10% SDS, 10% 과황산암모늄, TEMED, dH₂O) 및 12% 분해 겔(40% 아크릴아미드/비아크릴아미드, 1M 트리스 pH 8.8, 10% SDS, 10% 과황산암모늄, TEMED, dH₂O).
   2. 샘플을 2x Laemmli 샘플 버퍼와 1:1 비율로 혼합하고 95°C에서 5분 동안 배양하여 단백질을 변성시킵니다.
      참고: 샘플의 단백질 농도는 로딩 전에 측정해야 하며, 로딩된 부피는 동일한 로딩을 위한 농도를 기반으로 합니다.
   3. 1x 러닝 버퍼를 탱크에 추가하고 샘플과 단백질 래더를 웰에 로드합니다. 먼저 80V에서 단백질을 실행하고 단백질이 스태킹 겔에서 분해 겔로 이동할 때 전류를 120V로 높입니다.
   4. 젤을 쿠마시 블루 염색 염료에 넣고 셰이커에 30분 동안 넣습니다. 탈색 용액(250mL dH₂O + 50mL 아세트산(HOAc) + 200mL 메탄올)으로 겔을 세척하고 이미지를 촬영합니다(그림 4).

결과

서로 다른 기원에서 선택된 글리코실 가수분해효소 구성원 효소가 이 연구에서 표적으로 삼았습니다. 서로 다른 구조를 가진 서로 다른 효소의 공동 적용은 서로 다른 당단백질에서 활성화되도록 진화했기 때문에 더 나은 글리칸 방출을 제공할 수 있다고 가정했습니다. 표적 유전자 및 그 기원의 목록은 표 1에 나열되어 있습니다. 박테리아 균주는 Belgium Co-or...

토론

표적 유전자의 분자 클로닝에 사용되는 in vivo 재조합 클로닝 전략은 다른 기존 클로닝 프로토콜에 비해 빠르고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다. 분자 클로닝을 위한 편리한 방법이 많이 있지만 이 기사에 설명된 방법에는 더 많은 장점이 있습니다. 생체 내 클로닝 시스템은 다른 클로닝 시스템과 달리 PCR 산물의 효소 처리나 정제가 필요하지 않습니다. 또...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
EconoTaq PLUS 2X Master Mix	Lucigen	30035-1	Amplification of target genes (PCR)
DNase/RNase-free distilled water	Invitrogen	10977035	Amplification of target genes (PCR)
Safe-Red Loading Dye	abm	G108-R	DNA gel electrophoresis
1 kb Plus DNA Ladder	GoldBio	D011-500	DNA gel electrophoresis
Qubit protein assay kit	Invitrogen	Q33211	Measurement of DNA concentration
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	amresco	J106-2KG	Bacterial culture media
Agarose	Invitrogen	16500-500	Bacterial culture mediaet al.
Kanamycin Monosulfate	GoldBio	K-120-5	Antibiotic in bacterial culture media
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, N-His	Lucigen	49011-1	Cloning Kit
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, SUMO	Lucigen	49013-1	Cloning Kit
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, C-His	Lucigen	49012-1	Cloning Kit
Glycerol Solution	Sigma-Aldrich	15524-1L-R	Preparation of glycerol stock
L-Rhamnose monohydrate	Sigma-Aldrich	83650	Induction of protein expression
2X Laemmli Sample Buffer	ClearBand	TGS10	SDS-Page analysis
SureCast 40% (w/v) Acrylamide	Invitrogen	HC2040	SDS-Page analysis
SureCast APS	Invitrogen	HC2005	SDS-Page analysis
SureCast TEMED	Invitrogen	HC2006	SDS-Page analysis
10X Running Buffer	ClearBand	TGS10	SDS-Page analysis
Triset al.	BioShop	TRS001.1	SDS-Page analysis and cell lysis
10% SDS	ClearBand	S100	SDS-Page analysis
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder	ThermoFisher	26619	SDS-Page analysis
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750	Cell lysis
NaCl	Sigma-Aldrich	31434-5Kg-R	Cell lysis
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous	amresco	0571-1Kg	Sodium phosphate buffer for cell lysis
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrateet al.	Sigma-Aldrich	04272-1Kg	Sodium phosphate buffer for cell lysis
10-kDa-cut-off centrifugal filter	Amicon®- MERCK	UFC9010	Purification of enzymes