JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

לביפידובקטריה יש יכולת גנומית ייחודית למחשוף N-גליקן. ייצור רקומביננטי של אנזימים אלה יהיה כלי חדשני ומבטיח לשחרור N-גליקנים ביו-אקטיביים ממצעים עשירים בגליקופרוטאין כגון קולוסטרום.

Abstract

גליקוזילציה של חלבון היא שינוי מגוון ונפוץ לאחר תרגום שנקשר לתפקידים חשובים רבים כגון תפקוד חלבון, כולל קיפול חלבון, יציבות, הגנה אנזימטית וזיהוי ביולוגי. N-גליקנים המחוברים לגליקופרוטאינים (כגון לקטופרין, לקטדרין ואימונוגלובולינים) אינם יכולים להתעכל על ידי המארח ומגיעים למעי הגס, שם הם נצרכים על ידי חיידקים מועילים מסוימים. לכן, הם נחשבים לתרכובות פרה-ביוטיות מהדור הבא שיכולות לעורר באופן סלקטיבי את המיקרואורגניזמים המועילים של מיקרוביום המעי. עם זאת, הבידוד של סוגים חדשים אלה של פרה-ביוטיקה דורש אנזימים חדשים. כאן, אנו מתארים את הייצור הרקומביננטי של גליקוזידאזות חדשות מזני ביפידובקטריה שונים (שבודדו מתינוקות, ארנבות, תרנגולות ודבורים) לשיפור בידוד N-גליקן מגליקופרוטאינים. השיטה המוצגת במחקר זה כוללת את השלבים הבאים: שיבוט מולקולרי של גנים ביפידובקטריאליים על ידי אסטרטגיית שיבוט רקומבינציה in vivo, בקרה על הצלחת הטרנספורמציה, השראת חלבון וטיהור חלבונים.

Introduction

גליקוזילציה היא שינוי פוסט-תרגומי מכריע מאוד שנצפה בחלבונים. כ-50% מהחלבונים נמצאים בצורתם הגליקוזילית באיקריוטים. N- ו- O-glycosylation הם שני הסוגים העיקריים של גליקוזילציה 1,2. גליקנים המקושרים ל-O (O-גליקנים) מחוברים קוולנטית לחלבונים באמצעות N-אצטילגלקטוזאמין לקבוצת ההידרוקסיל של שאריות חומצות אמינו סרין (Ser) או תראונין (Thr). גליקנים מקושרים ל-N (N-גליקנים) הם אוליגוסכרידים מורכבים, המחוברים קוולנטית לשאריות חומצות אמינו אספרגין (Asn) של החלבונים באמצעות N-אצטיל גלוקוזאמין (GlcNAc) ברצף חומצות אמינו מסוים כ-N-X-Ser/Thr ופחות נפוץ, כמוN-X-Cys (ציסטאין) (כאשר X עשוי להיות כל חומצת אמינו מלבד פרולין)3,4. ליבת ה-N-גליקן הבסיסית מורכבת משני שאריות HexNAc ושלוש שאריות מנוז. התארכות נוספת של הליבה המשותפת הזו עם חד-סוכרים אחרים באמצעות אנזימי גליקוזילטרנספראז וגליקוזידאז קובעת את סוג ה-N-גליקנים על סמך מידת ההסתעפות וסוג הקישור5. N-גליקנים מקובצים בדרך כלל לשלוש מחלקות עיקריות: מנוז גבוה (HM), סוג מורכב (CT) והיברידי (HY)6.

N-גליקנים הם תרכובות בלתי ניתנות לעיכול על ידי האורגניזמים המארחים בגלל היעדר אנזימי הידרולאז גליקוזידים. התרכובות הללו מגיעות למעי הדק/גס בצורה לא מעוכלת, שם אלפי זני חיידקים שונים משתמשים בהן, והן יכולות לשמש כפרה-ביוטיקה על ידי קידום חיידקי מעיים מיוחדים, במיוחד מיני ביפידובקטריום 7. ממצאים אחרונים הראו כי N-גליקנים מעוררים באופן סלקטיבי את הצמיחה של מיני חיידקים מסוימים 8,9. N-גליקנים ששוחררו מגליקופרוטאינים מחלב בקר עוררו באופן סלקטיבי את הצמיחה של תת-המין Bifidobacterium longum infantis (B. infantis), שהוא מין ביפידובקטריאלי חיוני במעיים של התינוק, אך מינים אחרים של ביפידובקטריאליס כגון Bifidobacterium animalis (B. animalis) לא השתמשו בתרכובות אלה9. בנוסף, מחקר in vivo שנערך לאחרונה הראה כי 19 N-גליקנים ייחודיים מלקטופרין חלב ואימונוגלובולינים מעוררים באופן סלקטיבי את הגדילה של ב. אינפנטיס8. במיוחד, ל-B. infantis יש יכולת גנומית למחשוף גליקן וחילוף חומרים. Endo-β-N-acetylglucosaminidase (EndoBI-1), השייך למשפחת גליקוזיל הידרולאז 18, המיוצר רקומביננטית מ-B. infantis ATCC 15697 הראה פעילות גבוהה על גליקופרוטאינים בחלב בתנאי מבחנה 9,10. אנזים הידרולאז גליקוזיד חדשני זה יכול לבקע את חלקי ה-N-N′-דיאצטילכיטוביוז הנמצאים ב-N-גליקנים10,11. הפעילות של EndoBI-1 אינה מושפעת מפוקוזילציה של הליבה ומתנאי תגובה שונים כגון טמפרטורה גבוהה, pH, זמן תגובה וכו' 3,11,12. מאפיין ייחודי זה של הידרולזות גליקוזיד ביפידובקטריאליות מספק כלי מבטיח לייצור N-גליקנים ממצעים עשירים בגליקופרוטאין כגון קולוסטרום בקר 13,14.

מספר שיטות דה-גליקוזילציה שפותחו כימית ואנזימטית היו בשימוש נרחב להשגת N-גליקנים ו-O-גליקנים מגליקופרוטאינים 2,15. שיטות כימיות נמצאות בשימוש נרחב בגליקוביולוגיה לדה-גליקוזילציה של גליקופרוטאינים בגלל קלות השימוש, העלות הנמוכה והספציפיות הגבוהה של המצע16. שיטות הדגליקוזילציה הכימיות הנפוצות ביותר הן חיסול β והידרזינציה17. בין שיטות אלה, חיסול β מבוסס על עקרון הפיצול של גליקנים מגליקופרוטאינים על ידי חשיפה של גליקופרוטאינים לתנאים אלקליין. הגליקנים המשתחררים יכולים להתפרק במהלך התהליך עקב תגובות חיסול β, אך ניתן למנוע בעיה זו באמצעות חומרים מפחיתים כגון נתרן בורוהידריד (NaBH4)18,19,20. ישנן מגבלות שונות בשיטת חיסול β. החומרים הרדוקטיביים ממירים גליקנים לאלדיטולים, ומונעים מהם לקשור פלואורופור או כרומופור. לפיכך, מאתגר לנטר את שחרור הגליקן הופך להיות קשה19,20. בגלל תכולת המלח הגבוהה בשלב הניקוי של השיטה, פליטה עלולה לגרום לאובדן דגימה20. שיטה נוספת לשחרור גליקן מגליקופרוטאינים היא שיטת ההידרזין המבוססת על עקרון תגובת ההידרוליזה לאחר הוספת הידרזין נטול מים לגליקופרוטאין. מכיוון שהיא מאפשרת שליטה בבידוד הגליקנים על ידי שינוי תנאי תגובה כגון טמפרטורה, שיטת ההידרזינציה נמצאת בשימוש נרחב בגליקוביולוגיה21. דה-גליקוזילציה כימית יכולה להתבצע גם באמצעות ניסוח נטול מים של מימן פלואוריד וחומצה טריפלואורואצטית, בנוסף לשיטות דה-גליקוזילציה כימיות אחרות 16,22,23. השחרור האנזימטי של N-גליקנים מגליקופרוטאינים מבוצע בדרך כלל על ידי פפטידיל-N-גליקוזידאזות (PNGases) המשחררים בדרך כלל N-גליקנים, ללא קשר לגודלם וטעינתם 24,25,26,27. בדומה לשיטות הדגליקוזילציה הכימיות, לתהליך הדגליקוזילציה האנזימטית יש אתגרים שונים. PNGases מראים פעילות בנוכחות מספר חומרי ניקוי המשמשים, המגבירים את נגישות האנזים לגליקנים. עם זאת, טיפולים קשים אלה עלולים לשבש את הגליקנים המקומיים ואת מבני הפוליפפטידים הנותרים28. ייתכן ש-PNGases לא יבקעו את הגליקנים כאשר יש פוקוז הקשור ל-N-אצטיל-גלוקוזאמין29. אנדוגליקוזידאזות שונות כגון F1, F2 ו-F3 מראים פעילות רבה יותר על החלבונים המקוריים מאשר PNGases. לאנדוגליקוזידאזות אלה יש פעילות נמוכה על הגליקנים מרובי האנטנות, בעוד ש-EndoBI-1 החדש העמיד בחום יעיל בכל סוגי ה-N-גליקנים 10,11,28. באשר למגבלות השיטות הנוכחיות, ברור כי עדיין נדרשים אנזימים חדשים לשחרור גליקן יעיל ללא כל הגבלה. למטרה זו, מינים ביפידובקטריאליים, שיש להם אי גנומי גדול המקודד אנזימים שונים של גליקוזידים הידרולאזים, מאפשרים לבקע N-גליקנים מגליקופרוטאינים 30,31. במסגרת הקשר זה, המטרה הכוללת של מחקר זה היא לגלות גליקוזידאזות חדשות ממיני הביפידובקטריאליים השונים. כדי לייצר אנזימים אלה באופן רקומביננטי, תגי היתוך שונים נועדו לשפר את ייצורם כמו גם את פעילותם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. שיבוט מולקולרי של גנים ביפידובקטריאליים

  1. הגברת PCR של גנים ממוקדים על ידי שלוש קבוצות פריימר וקטוריות (N-His, C-His ו-N-His SUMO)
    1. הכינו תמיסות פריימר מלאי של 100 מיקרומטר (אוליגומרים) על ידי הוספת מים סטריליים בכמויות שנקבעו על ידי החברה. הכן מלאי חדש של 10 מיקרומטר ממאגרים אלה שישמשו בהגברת PCR של גני המטרה.
    2. הכן את תערובת ה-PCR (נפח כולל 50 מיקרוליטר) עם 25 מיקרוליטר של תערובת מאסטר, 1 מיקרוליטר של פריימר קדימה ואחורה ב-0.2 מיקרומטר, 21 מיקרוליטר של מים מזוקקים ללא DNase/RNase ו-2 מיקרוליטר של תבנית DNA (תאי חיידקים) בצינורות ה-PCR. מערבבים בעדינות את התערובת על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
      הערה: תערובת המאסטר (Lucigen) המשמשת ל-PCR מכילה Taq DNA Polymerase עם טוהר גבוה ופעילות גבוהה ויכולה לעבוד בטמפרטורות גבוהות יותר להגברה אמינה של תבניות עד 5 kb.
    3. הגדר את תוכנית ה-PCR באופן הבא: שלב דנטורציה ראשוני ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לשחרור DNA גנומי, לאחר מכן 40 מחזורי דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, חישול ב-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות והתארכות ב-72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, וההארכה הסופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    4. בדוק את מוצרי ה-PCR בשיטת אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז עם מערכת תיעוד ג'ל לאחר הפעלה ב-100 וולט למשך 60 דקות על ג'ל אגרוז 1%. מערבבים את מוצרי ה-PCR וסולם ה-DNA עם צבע ההעמסה על ידי ערבוב ביחס של 1:5 (5 μL של מוצר PCR + 1 μL של צבע טעינה ו-5 μL של סולם DNA של 1 kb + 1 μL של צבע טעינה) כדי להעמיס על הג'ל (איור 1).
    5. מדוד את ריכוזי ה-DNA של מוצרי PCR באמצעות פלואורומטר לפני שלב השיבוט המולקולרי.
      הערה: ריכוזים של מוצרי PCR צריכים להיות בטווח הנדרש לשיבוט מולקולרי (25-100 ננוגרם/מיקרוליטר).
  2. הכנת מדיום אגר מרק ליזוגני (LB) לשיבוט מולקולרי
    1. ממיסים 12.5 גרם LB ו-6 גרם אגרוז ב-500 מ"ל של dH2O ומחטאים את מדיום האגר LB (עיקור ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות).
    2. יש להמיס 15 מ"ג קנמיצין עם 1 מ"ל של dH2O ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    3. לאחר החיטוי, הוסף 1 מ"ל של קנמיצין לבקבוק המכיל 500 מ"ל סטרילי של מדיום אגר LB. הריכוז הסופי של קנמיצין הוא 30 מיקרוגרם/מ"ל. יוצקים 25 מ"ל של מדיה LB agar kanamycin לכל צלחת בארון המעבדה.
  3. טרנספורמציה של הלם חום של תאי E. coli מוכשרים כימית
    1. הוסף 1-3 מיקרוליטר (25 עד 100 ננוגרם) מתוצרי ה-PCR עבור כל זן לתוך הצינור, כולל 40 מיקרוליטר של תאי E. coli בעלי יכולת כימית. לאחר מכן, הוסף 2 מיקרוליטר של ה-DNA הווקטורי לאותו צינור. מערבבים בעדינות עם קצה הפיפטה ומעבירים את התערובות לצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל.
      הערה: בצע שלב זה על קרח. אין לזרוק למעלה ולמטה כדי לערבב כדי למנוע בועות אוויר ותאים מתחממים בטעות.
    2. דגרו את הצינורות המכילים את התאים המוסמכים וה-DNA על קרח למשך 30 דקות. הפעל הלם חום על התערובת באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות. שים את הצינורות האלה על קרח מיד ודגירה למשך 2 דקות.
    3. הוסף 960 מיקרוליטר של מדיום ההתאוששות, המשמש להתאוששות מהירה של תאים לאחר שיבוט מולקולרי, לתאים בצינורות ודגר את הצינורות ב-250 סל"ד למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס בחממה רועדת.
    4. צלחת 100 מיקרוליטר של תאים שעברו טרנספורמציה על לוחות אגר LB המכילים 30 מיקרוגרם/מ"ל של קנמיצין. השתמש רק בתאי E. coli בעלי יכולת כימית כבקרה שלילית.
      הערה: שים צלחות אגר LB המכילות 30 מיקרוגרם/מ"ל של קנמיצין שהוכנו בשלב 1.2.2 לחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    5. דגרו את כל הלוחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה סביבתית (איור 2).
  4. הכנת מדיום LB ל-PCR מושבה
    1. ממיסים 7.5 גרם LB עם 300 מ"ל של dH2O בבקבוק ומחטאים את מדיום ה-LB (עיקור ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות).
    2. ממיסים 9 מ"ג קנמיצין (30 מיקרוגרם/מ"ל) עם 1 מ"ל של dH2O ומכניסים ל-20 מעלות צלזיוס. לאחר החיטוי, הוסף 1 מ"ל של קנמיצין לבקבוק המכיל 300 מ"ל סטרילי של מדיום LB. אחסן את מדיום התרבות הנוזלית בטמפרטורה של +4 מעלות צלזיוס עד השימוש בו.
  5. הקרנת טרנספורמנטים על ידי PCR מושבה
    1. כדי לאשר שכל הטרנספורמנטים נושאים את הגנים הרקומביננטיים, בחר מושבות באופן אקראי והגביר את גני המטרה על ידי PCR באמצעות פריימרים לריצוף המסופקים עם ערכת השיבוט.
    2. בצע את כל השלבים על קרח וצנן מראש את כל צינורות ה-PCR וצינורות 15 מ"ל לפני השימוש.
    3. בעזרת קצה פיפטה, העבירו מחצית ממושבה נבחרת לצינור ה-PCR עבור כל דגימה. קחו מחצית נוספת מהמושבה עם קצה הפיפטה והכניסו אותה לצינור של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום נוזלי LB+kanamycin (הוכן בשלב 1.4). מערבל את צינורות ה-15 מ"ל ודוגר על התרביות הנוזליות ב-250 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה באינקובטור רועד.
    4. הכניסו 50 מיקרוליטר של תערובת תגובת PCR (25 מיקרוליטר של תערובת מאסטר, 1 מיקרוליטר של פריימר קדימה, 1 מיקרוליטר של פריימר הפוך, 23 מיקרוליטר של מים מזוקקים ללא DNase/RNase) לכל צינורות ה-PCR ופזרו את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה בעדינות.
    5. הגדר את תוכנית ה-PCR ל-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לשחרור DNA גנומי על ידי ליזה של תאי חיידקים, סה"כ 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות לדנטורציה ראשונית, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות לחישול, 72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת להתארכות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להארכה הסופית.
    6. בדוק את מוצרי ה-PCR בשיטת אלקטרופורזה של ג'ל לאחר הפעלה ב-100 וולט למשך 60 דקות על ג'ל אגרוז 1% (איור 3). הפרטים של אלקטרופורזה של ג'ל DNA מתוארים בשלב 1.1.3.
    7. הכן 15% מלאי גליצרול של השנאים המוצלחים. הכניסו 500 מיקרוליטר של מלאי גליצרול של 60% לתוך הצינורות והוסיפו 1,500 מיקרוליטר מהתרבות הנוזלית של הטרנספורמנטים המוצלחים. אחסן מלאי מוכן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

2. אינדוקציה L-rhamnose של ביטוי חלבון

  1. הכינו קדם-תרבית עם 1 ליטר של מדיום נוזלי LB המכיל 30 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין.
  2. שים 8 מ"ל של מדיום LB בצינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל. השתמש באחד הצינורות כבקרה שלילית המכילה רק את המדיום הנוזלי. לקבלת 20% L-רמנוז כציר, ממיסים 0.5 גרם L-rhamnose עם 2.5 מ"ל של dH2O ושומרים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד השימוש.
  3. הכניסו 10 מיקרוליטר ממלאי החיידקים לתוך צינורות הצנטריפוגה המכילים 8 מ"ל של מדיה נוזלית. מערבלים אותם בעדינות ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך לילה באינקובטור הרועד.
  4. יוצקים 250 מ"ל של מדיום נוזלי LB לתוך בקבוק ארלנמאייר מעוקר בנפח 2 ליטר.
  5. יש לחסן 2.5 מ"ל מהתרבית הנוזלית הלילה לתוך בקבוק של 2 ליטר המכיל מדיום נוזלי LB ביחס של 1:100 בין הבקבוק למדיום, ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-150 סל"ד למשך 4 שעות בחממה הרועדת.
  6. מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD600) עבור תאי החיידקים על ידי ספקטרופוטומטר. כאשר התאים מגיעים לצפיפות אופטית של 0.5-0.6, הוסיפו 2.5 מ"ל של 20% רמנוז (הריכוז הסופי הוא 0.2%) ל-250 מ"ל של תרבית LB ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ב-250 סל"ד באינקובטור הרועד.
  7. העבירו את התרבית הנוזלית לצינורות 5 x 50 מ"ל, דגימות צנטריפוגות 3724 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של +4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט. אחסן את הכדורים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשלב הטיהור.
    הערה: כדי להעריך את ביטוי החלבון עם SDS-PAGE, אסוף 1 מ"ל של תרבית לא מושרית (כאשר תרביות בצפיפות אופטית 600 ננומטר של 0.5-0.6, ללא L-rhamnose) כביקורת ו-1 מ"ל של תרבית מושרית (לאחר דגירה של לילה) כדגימה מושרית. מיקרוצנטריפוגה כל הדגימות ב-12,000 x גרם למשך דקה אחת והשעיית דגימות לא מושרות ומושרות עם 50 מיקרוליטר ו-100 מיקרוליטר של מאגר טעינה SDS-PAGE, בהתאמה.

3. ליזה תאית של תאי E. coli בעלי יכולת כימית המכילים אנזימים מתויגים

  1. הכן מאגר ליזה pH 8.0 (50 מ"מ Tris-HCl, 200 מ"מ NaCl, 1 מ"מ אימידזול, 1% SDS), מאגר שיווי משקל pH 7.4 (20 מ"מ NaH2PO4, 300 מ"מ NaCl, 10 מ"מ אימידזול), מאגר כביסה pH 7.4 (20 מ"מ NaH2PO4, 300 מ"מ NaCl, 25 מ"מ אימידזול), ומאגר פליטה pH 7.4 (20 מ"מ NaH2PO4, 300 מ"מ NaCl, 250 מ"מ אימידזול).
  2. הנח את הצינורות של 50 מ"ל המכילים את כדורי התא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות להקפאה. לאחר מכן, הסר את הכדורים מ-80 מעלות צלזיוס והפשיר בטמפרטורת החדר.
  3. הוסף 5 מ"ל של dH2O לכדורים והמיס על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. צנטריפוגה ב-3724 x גרם למשך 15 דקות ב-+4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
  4. עבור כדורי תרבית של 50 מ"ל, הוסף 6,300 מיקרוליטר של מאגר ליזה ו-63 מיקרוליטר של קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA (יחס של 1:100) לתוך הכדורים והתמוסס על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. דגרו אותם על קרח למשך 30 דקות, מערבולת כל 10 דקות.
  5. הגדר את מצב הדופק של הסוניקטור כ-10 שניות מופעל ו-59 שניות כבוי, ואת המשרעת כ-37%. הנח את הצינור בכוס המכילה קרח וטבל את הגשושית של הסוניקטור בצינור.
    הערה: יש לטבול את הגשושית לחלוטין מבלי לגעת באף צד של הצינור.
  6. לאחר תהליך הסוניקציה (6 פולסים למשך 10 שניות עם קירור של דקה אחת), צנטריפוגה את הדגימות ב-3,724 x g למשך 45 דקות ב-+4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, אספו את כל חלקי הסופרנטנט בצינור ובצנטריפוגה ב-3,724 x גרם למשך 5 דקות ב-+4 מעלות צלזיוס.
  7. אספו את הסופרנטנט לתוך שפופרת וקחו 100 מיקרוליטר מהדגימה לאלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) בשלב 4.7. מדוד את ריכוזי החלבון של הדגימות באמצעות פלואורומטר.

4. טיהור אנזימים מתויגים בשיטת אצווה

  1. הוסף 1 מ"ל של שרף Ni-NTA לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה למשך 2 דקות ב-700 x גרם. הסר בזהירות את הצינור והשליך את הסופרנטנט שנוצר.
  2. מוסיפים 2 מ"ל (פי שניים מנפח השרף) של מאגר שיווי המשקל לתוך הצינור ומערבבים היטב עד שהשרף מושעה לחלוטין. צנטריפוגה את הצינור למשך 2 דקות ב-700 x גרם והסר בזהירות והשליך את המאגר.
  3. מערבבים את תמצית החלבון ומאגר שיווי המשקל ביחס של 1:1 בצינור צנטריפוגה. מוסיפים את התערובת לצינור המכיל שרף ומניחים אותה על שייקר ב -150 סל"ד למשך 30 דקות. צנטריפוגה את הצינור למשך 2 דקות ב-700 x גרם והשליכו את הסופרנטנט.
  4. שטפו את השרף עם 5 מ"ל של מאגר כביסה וצנטריפוגה את הצינור למשך 2 דקות בטמפרטורה של 700 x גרם. חזור על שלב הכביסה עד שריכוז הסופרנטנט יורד לקו הבסיס.
  5. הוסף 1 מ"ל של מאגר פליטה לתוך הצינור כדי לחסל חלבונים מתויגים His. צנטריפוגה את הצינור למשך 2 דקות בטמפרטורה של 700 x גרם. שמרו את ה-supernatant וקחו 100 מיקרוליטר לניתוח SDS-PAGE בשלב 4.7. חזור על שלב הפליטה שלוש פעמים. מדדו את הריכוזים של כל סופרנטנט באמצעות פלואורומטר.
  6. אספו את כל הסופרנטנטים בצינור החתך של 10 kDa וצנטריפוגה למשך 2 דקות ב-700 x גרם. חזור על הצנטריפוגה עד שנפח הסופרנטנט יורד ל-200 מיקרוליטר על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מדי פעם. אחסן את החלבונים המטוהרים ב-20 מעלות צלזיוס וקח 100 מיקרוליטר לניתוח SDS-PAGE בשלב 4.7.
    הערה: יש למדוד את ריכוז החלבון, ואם הריכוז נמוך, לצנטריפוגה עד שהוא עולה.
  7. ניתוח SDS-PAGE של החלבונים המטוהרים
    1. הכינו ג'ל ערימה של 4% (40% אקרילאמיד/ביסקרילאמיד, 1 M Tris pH 6.8, 10% SDS, 10% אמוניום פרסולפט, TEMED, dH2O) וג'ל ממיס 12% (40% אקרילאמיד/ביסקרילאמיד, 1 M Tris pH 8.8, 10% SDS, 10% אמוניום פרסולפט, TEMED, dH2O).
    2. מערבבים את הדגימה עם 2x מאגר דגימת Laemmli ביחס של 1:1 ודוגרים ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לנטרל את החלבונים.
      הערה: יש למדוד את ריכוז החלבון של הדגימות לפני הטעינה, והנפח הטעון יתבסס על ריכוזן לטעינה שווה.
    3. הוסף חיץ רץ 1x לתוך המיכל וטען את הדגימות ואת סולם החלבון לבארות. הפעל את החלבונים תחילה ב-80 וולט, והגביר את הזרם ל-120 וולט כאשר החלבונים עוברים מג'ל הערימה לג'ל הפתרון.
    4. הכניסו את הג'ל לצבע מכתים כחול של קומאסי והכניסו אותו לשייקר למשך 30 דקות. שטפו את הג'ל בתמיסת מניעת (250 מ"ל dH2O + 50 מ"ל חומצה אצטית (HOAc) + 200 מ"ל מתנול), וצלמו את התמונה (איור 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אנזימים החברים בגליקוזיל הידרולאז שנבחרו ממקורות שונים היו ממוקדים במחקר זה. ההנחה הייתה כי יישום משותף של אנזימים שונים בעלי מבנים שונים יכול לספק שחרור גליקן טוב יותר מכיוון שהם התפתחו להיות פעילים בגליקופרוטאינים שונים. רשימת גני המטרה ומקורם מפורטת בטבלה 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

אסטרטגיית השיבוט הרקומבינציונית in vivo המשמשת לשיבוט מולקולרי של גני המטרה מספקת תוצאות מהירות ואמינות בהשוואה לפרוטוקולי שיבוט מסורתיים אחרים. למרות שישנן שיטות נוחות רבות לשיבוט מולקולרי, לשיטה המתוארת במאמר זה יש יתרונות נוספים. מערכת שיבוט in vivo , בניגוד למע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי TUBITAK #118z146 ו-Uluova Süt Ticaret A.Ş (Uluova Milk Trading Co).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
EconoTaq PLUS 2X Master MixLucigen30035-1Amplification of target genes (PCR)
DNase/RNase-free distilled waterInvitrogen10977035Amplification of target genes (PCR)
Safe-Red Loading DyeabmG108-RDNA gel electrophoresis
1 kb Plus DNA LadderGoldBioD011-500DNA gel electrophoresis
Qubit protein assay kitInvitrogenQ33211Measurement of DNA concentration
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)amrescoJ106-2KGBacterial culture media
AgaroseInvitrogen16500-500Bacterial culture mediaet al.
Kanamycin MonosulfateGoldBioK-120-5Antibiotic in bacterial culture media
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, N-HisLucigen49011-1Cloning Kit
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, SUMOLucigen49013-1Cloning Kit
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, C-HisLucigen49012-1Cloning Kit
Glycerol SolutionSigma-Aldrich15524-1L-RPreparation of glycerol stock
L-Rhamnose monohydrateSigma-Aldrich83650Induction of protein expression
2X Laemmli Sample BufferClearBandTGS10SDS-Page analysis
SureCast 40% (w/v) AcrylamideInvitrogenHC2040SDS-Page analysis
SureCast APSInvitrogenHC2005SDS-Page analysis
SureCast TEMEDInvitrogenHC2006SDS-Page analysis
10X Running BufferClearBandTGS10SDS-Page analysis
Triset al.BioShopTRS001.1SDS-Page analysis and cell lysis
10% SDSClearBandS100SDS-Page analysis
PageRuler Plus Prestained Protein LadderThermoFisher26619SDS-Page analysis
ImidazoleSigma-Aldrich56750Cell lysis
NaClSigma-Aldrich31434-5Kg-RCell lysis
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrousamresco0571-1KgSodium phosphate buffer for cell lysis
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrateet al.Sigma-Aldrich04272-1KgSodium phosphate buffer for cell lysis
10-kDa-cut-off centrifugal filterAmicon®- MERCKUFC9010Purification of enzymes

References

  1. Adlerova, L., Bartoskova, A., Faldyna, M. Lactoferrin: a review. Veterinarni Medicina. 53 (9), 457-468 (2008).
  2. Karav, S., German, J. B., Rouquié, C., Le Parc, A., Barile, D. Studying lactoferrin N-glycosylation. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 870(2017).
  3. Le Parc, A., et al. A novel endo-β-N-acetylglucosaminidase releases specific N-glycans depending on different reaction conditions. Biotechnology Progress. 31 (5), 1323-1330 (2015).
  4. Lafite, P., Daniellou, R. Rare and unusual glycosylation of peptides and proteins. Natural Product Reports. 29 (7), 729(2012).
  5. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  6. Varki, A., et al. Structures common to different glycans. Essentials of Glyobiology. , (2009).
  7. Koropatkin, N. M., Cameron, E. A., Martens, E. C. How glycan metabolism shapes the human gut microbiota. Nature Reviews Microbiology. 10 (5), 323(2012).
  8. Karav, S., et al. N-glycans from human milk glycoproteins are selectively released by an infant gut symbiont in vivo. Journal of Functional Foods. 61, 103485(2019).
  9. Karav, S., et al. Oligosaccharides released from milk glycoproteins are selective growth substrates for infant-associated bifidobacteria. Applied and Environmental Microbiology. 82 (12), 3622-3630 (2016).
  10. Garrido, D., et al. Endo-β-N-acetylglucosaminidases from infant gut-associated bifidobacteria release complex N-glycans from human milk glycoproteins. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 775-785 (2012).
  11. Karav, S., et al. Kinetic characterization of a novel endo-beta-N-acetylglucosaminidase on concentrated bovine colostrum whey to release bioactive glycans. Enzyme and Microbial Technology. 77, 46-53 (2015).
  12. Karav, S., et al. Characterizing the release of bioactive N- glycans from dairy products by a novel endo-β-N-acetylglucosaminidase. Biotechnology Progress. 31 (5), 1331-1339 (2015).
  13. Sahutoglu, A. S., Duman, H., Frese, S. A., Karav, S. Structural insights of two novel N-acetyl-glucosaminidase enzymes through in silico methods. Turkish Journal Of Chemistry. 44 (6), 1703-1712 (2020).
  14. Duman, H., et al. Potential applications of Endo-β-N-Acetylglucosaminidases from Bifidobacterium longum subspecies infantis in designing value-added, next generation infant formulas. Frontiers in Nutrition. 8, 646275(2021).
  15. Karav, S. Application of a novel Endo-β-N-Acetylglucosaminidase to isolate an entirely new class of bioactive compounds: N-Glycans. Enzymes in Food Biotechnology. , 389-404 (2019).
  16. Sojar, H. T., Bahl, O. P. A chemical method for the deglycosylation of proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 259 (1), 52-57 (1987).
  17. Dwek, R. A., Edge, C. J., Harvey, D. J., Wormald, M. R., Parekh, R. B. Analysis of glycoprotein-associated oligosaccharides. Annual Review of Biochemistry. 62 (1), 65-100 (1993).
  18. Carlson, D. M. Structures and immunochemical properties of oligosaccharides isolated from pig submaxillary mucins. Journal of Biological Chemistry. 243 (3), 616-626 (1968).
  19. Roth, Z., Yehezkel, G., Khalaila, I. Identification and quantification of protein glycosylation. International Journal of Carbohydrate Chemistry. 2012, 1-10 (2012).
  20. Turyan, I., Hronowski, X., Sosic, Z., Lyubarskaya, Y. Comparison of two approaches for quantitative O-linked glycan analysis used in characterization of recombinant proteins. Analytical Biochemistry. 446, 28-36 (2014).
  21. Patel, T., et al. Use of hydrazine to release in intact and unreduced form both N-and O-linked oligosaccharides from glycoproteins. Biochemistry. 32 (2), 679-693 (1993).
  22. Edge, A. S. B., Faltynek, C. R., Hof, L., Reichert, L. E., Weber, P. Deglycosylation of glycoproteins by trifluoromethanesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 118 (1), 131-137 (1981).
  23. Fryksdale, B. G., Jedrzejewski, P. T., Wong, D. L., Gaertner, A. L., Miller, B. S. Impact of deglycosylation methods on two-dimensional gel electrophoresis and matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry for proteomic analysis. Electrophoresis. 23 (14), 2184-2193 (2002).
  24. Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
  25. Morelle, W., Faid, V., Chirat, F., Michalski, J. C. Analysis of N- and O-linked glycans from glycoproteins using MALDI-TOF mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 534, 5-21 (2009).
  26. O'Neill, R. A. Enzymatic release of oligosaccharides from glycoproteins for chromatographic and electrophoretic analysis. Journal of Chromatography. A. 720 (1-2), 201-215 (1996).
  27. Szabo, Z., Guttman, A., Karger, B. L. Rapid release of N-linked glycans from glycoproteins by pressure-cycling technology. Analytical Chemistry. 82 (6), 2588-2593 (2010).
  28. Trimble, R. B., Tarentino, A. L. Identification of distinct endoglycosidase (endo) activities in Flavobacterium meningosepticum: endo F1, endo F2, and endo F3. Endo F1 and endo H hydrolyze only high mannose and hybrid glycans. The Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1646(1991).
  29. Tretter, V., Altmann, F., März, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
  30. Sela, D. A., et al. The genome sequence of Bifidobacterium longum subsp. infantis reveals adaptations for milk utilization within the infant microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18964-18969 (2008).
  31. Garrido, D., Kim, J. H., German, J. B., Raybould, H. E., Mills, D. A. Oligosaccharide binding proteins from Bifidobacterium longum subsp. infantis reveal a preference for host glycans. PLoS One. 6 (3), 17315(2011).
  32. Butt, T. R., Edavettal, S. C., Hall, J. P., Mattern, M. R. SUMO fusion technology for difficult-to-express proteins. Protein Expression and Purification. 43 (1), 1-9 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

N

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved