用于 N-糖释放的双歧杆菌内切糖苷酶的重组生产

摘要

双歧杆菌具有独特的 N-糖切割基因组能力。重组生产这些酶将是一种很有前途的新型工具，可以从富含糖蛋白的底物（如初乳）中释放生物活性 N-糖。

摘要

蛋白质糖基化是一种多样且常见的翻译后修饰，与蛋白质功能等许多重要作用有关，包括蛋白质折叠、稳定性、酶保护和生物识别。附着在糖蛋白上的 N-糖（如乳铁蛋白、乳粘蛋白和免疫球蛋白）不能被宿主消化并到达大肠，在那里它们被某些有益微生物消耗。因此，它们被认为是下一代益生元化合物，可以选择性地刺激肠道微生物组的有益微生物。然而，分离这些新型益生元需要新型酶。在这里，我们描述了从不同的双歧杆菌菌株（从婴儿、兔子、鸡和大黄蜂中分离）重组生产新型糖苷酶，以改善从糖蛋白中分离 N-糖。本研究中提出的方法包括以下步骤：通过 体内 重组克隆策略对双歧杆菌基因进行分子克隆、转化成功的控制、蛋白质诱导和蛋白质纯化。

引言

糖基化是在蛋白质中观察到的非常关键的翻译后修饰。大约 50% 以上的蛋白质以糖基化形式存在于真核生物中。N- 和 O-糖基化是糖基化的两种主要类型 ^1,2.O-连接聚糖 （O-聚糖） 通过 N-乙酰半乳糖胺与丝氨酸 （Ser） 或苏氨酸 （Thr） 氨基酸残基的羟基共价连接到蛋白质上。N-连接聚糖 （N-聚糖） 是复杂的寡糖，通过 N-乙酰葡糖胺 （GlcNAc） 以特定的氨基酸序列 N-X-Ser/Thr 和不太常见的 N-X-Cys（半胱氨酸）共价连接到蛋白质的天冬酰胺 （Asn） 氨基酸残基上，为N-X-Cys（半胱氨酸）（其中 X 可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸）^3,4。碱性 N-糖核心由两个 HexNAc 和三个甘露糖残基组成。通过糖基转移酶和糖苷酶进一步延长该共同核心与其他单糖，根据支化程度和键类型确定 N-糖的类型⁵。N-糖通常分为三大类：高甘露糖 （HM）、复合物型 （CT） 和杂化型 （HY）⁶。

由于缺乏糖苷水解酶，N-糖是宿主生物体难以消化的化合物。这些化合物以未消化的形式到达小肠/大肠，数千种不同的细菌物种利用它们，它们可以通过促进专门的肠道微生物，尤其是双歧杆菌物种⁷ 来充当益生元。最近的研究结果表明，N-糖选择性地刺激某些细菌种类的生长 ^8,9。牛乳糖蛋白释放的 N-糖选择性地刺激婴儿双歧杆菌亚种 （B. infantis） 的生长，这是婴儿肠道中重要的双歧杆菌种类，但其他双歧杆菌种类，如动物双歧杆菌 （B. animalis） 没有利用这些化合物⁹。此外，最近的一项体内研究表明，来自牛奶乳铁蛋白和免疫球蛋白的 19 种独特 N-聚糖选择性地刺激婴儿双歧杆菌的生长 ⁸。特别是，婴儿双歧杆菌具有聚糖切割和代谢的基因组能力。由婴儿双歧杆菌 ATCC 15697 重组产生的一种属于糖基水解酶家族 18 的 Endo-β-N-乙酰葡糖苷酶 （EndoBI-1） 在体外条件下对牛奶糖蛋白具有高活性 ^9,10。这种新型糖苷水解酶可以裂解 N-聚糖中发现的 N-N′-二乙酰壳二糖部分^10,11。EndoBI-1 的活性不受核心岩藻糖基化和不同的反应条件（如高温、pH 值、反应时间等）的影响 ^3,11,12。双歧杆菌糖苷水解酶的这一独特特性为从富含糖蛋白的底物（如牛初乳）生产 N-糖提供了一种有前途的工具^13,14。

几种化学和酶促开发的去糖基化方法已被广泛用于从糖蛋白获得 N-糖和 O-糖 ^2,15。化学方法因其易用性、低成本和高底物特异性而广泛用于糖生物学中糖蛋白的去糖基化¹⁶。最常见的化学糖基释放方法是 β 消除和氢嗪化¹⁷。在这些方法中，β消除基于通过将糖蛋白暴露于碱性条件下从糖蛋白中裂解聚糖的原理。由于β消除反应，释放的游离寡糖可以在过程中降解，但可以使用硼氢化钠 （NaBH₄） 等还原剂来防止此问题18,19,20。β消元法有不同的限制。还原剂将聚糖转化为醛糖醇，阻止它们结合荧光团或发色团。因此，难以监测聚糖释放变得困难^19,20。由于该方法清洁步骤中的盐含量较高，洗脱可能会导致样品损失²⁰.另一种从糖蛋白中释放聚糖的方法是肼法，该方法基于向糖蛋白中加入无水肼后的水解反应原理。由于它允许通过改变反应条件（如温度）来控制游离寡糖的分离，因此氢化方法已广泛用于糖生物学²¹。除了其他化学糖基化方法外，还可以使用氟化氢和三氟乙酸的无水制剂进行化学糖基化 16,22,23。从糖蛋白中酶促释放 N-糖通常由肽基-N-糖苷酶 （PNGase） 进行，通常释放 N-糖，而不管其大小和电荷如何 24,25,26,27。与化学糖基释放方法类似，酶法糖基释放过程具有不同的挑战。PNGase 在使用多种去污剂的情况下显示出活性，这增加了酶对聚糖的可及性。然而，这些苛刻的处理可能会破坏天然聚糖和剩余的多肽结构²⁸。当存在与 N-乙酰葡糖胺²⁹ 相连的岩藻糖时，PNGase 可能不会裂解聚糖。各种内切糖苷酶（如 F1、F2 和 F3）对天然蛋白质的活性高于 PNGase。这些内切糖苷酶对多天线聚糖的活性较低，而耐热的新型 EndoBI-1 对所有类型的 N-糖都有效 10,11,28。关于当前方法的局限性，很明显，有效的游离寡糖释放仍然需要新型酶，没有任何限制。为此，双歧杆菌物种具有编码各种糖苷水解酶的大基因组岛，能够从糖蛋白中裂解 N-糖^30,31。在此背景下，本研究的总体目标是从各种双歧杆菌物种中发现新的糖苷酶。为了重组产生这些酶，不同的融合标签旨在提高它们的产生和活性。

研究方案

1. 双歧杆菌基因的分子克隆

1. 通过三种载体引物组（N-His、C-His 和 N-His SUMO）对目标基因进行 PCR 扩增
   1. 通过按公司确定的量添加无菌水，制备 100 μM 储备引物（低聚物）溶液。从这些原液中制备 10 μM 新原液，用于靶基因的 PCR 扩增。
   2. 在 PCR 管中用 25 μL 预混液、1 μL 0.2 μM 的正向和反向引物、21 μL 不含 DNase/RNase 的蒸馏水和 2 μL 模板 DNA（细菌细胞）制备 PCR 混合物（总体积 50 μL）。通过上下吹打轻轻搅拌混合物。
      注：用于 PCR 的预混液 （Lucigen） 含有高纯度和高活性的 Taq DNA 聚合酶，可在较高温度下工作，可可靠扩增长达 5 kb 的模板。
   3. 将PCR程序设置如下：在95°C下初始变性步骤5分钟以释放基因组DNA，然后在95°C下变性40个循环30秒，在60°C下退火30秒，在72°C下伸长1分钟，最后在72°C下延伸10分钟。
   4. 在 1% 琼脂糖凝胶上于 100 V 下运行 60 分钟后，使用凝胶记录系统通过琼脂糖凝胶电泳法检查 PCR 产物。将 PCR 产物和 DNA 分子量标准与上样染料以 1：5 的比例混合（5 μL PCR 产物 + 1 μL 上样染料和 5 μL 1 kb DNA 分子量标准 + 1 μL 上样染料）以加载到凝胶上（图 1）。
   5. 在分子克隆步骤之前，使用荧光计测量 PCR 产物的 DNA 浓度。
      注：PCR 产物的浓度应在分子克隆所需的范围内 （25-100 ng/μL）。
2. 用于分子克隆的溶原肉汤 （LB） 琼脂培养基的制备
   1. 将 12.5 g LB 和 6 g 琼脂糖溶于 500 mL dH₂O 中，并高压灭菌 LB 琼脂培养基（在 121 °C 下灭菌 20 分钟）。
   2. 将 15 mg 卡那霉素与 1 mL dH₂O 溶解并储存在 -20 °C。
   3. 高压灭菌后，将 1 mL 卡那霉素加入装有无菌 500 mL LB 琼脂培养基的瓶子中。卡那霉素的最终浓度为 30 μg/mL。将 25 mL LB 琼脂卡那霉素培养基倒入实验室柜中的每个板中。
3. 化学感受态 大肠杆菌 细胞的热休克转化
   1. 将每种菌株的 1-3 μL（25 至 100 ng）PCR 产物加入试管中，包括 40 μL 化学感受态 大肠杆菌 细胞。然后，将 2 μL 载体 DNA 添加到同一试管中。用移液器吸头轻轻搅拌，然后将混合物转移到 15 mL 离心管中。
      注意：在 ice 上执行此步骤。请勿上下移液混合，以避免气泡和无意中加热细胞。
   2. 将含有感受态细胞和 DNA 的试管在冰上孵育 30 分钟。在 42 °C 水浴中对混合物进行热休克 45 秒。立即将这些试管放在冰上并孵育 2 分钟。
   3. 将 960 μL 用于分子克隆后细胞快速回收的回收培养基添加到试管中的细胞中，并在摇动培养箱中以 250 rpm 的转速在 37 °C 下孵育试管 1 小时。
   4. 将 100 μL 转化的细胞接种在含有 30 μg/mL 卡那霉素的 LB 琼脂平板上。仅使用化学感受态 大肠 杆菌细胞作为阴性对照。
      注：使用前，将含有步骤 1.2.2 中制备的 30 μg/mL 卡那霉素的 LB 琼脂平板放入 37 °C 的培养箱中。
   5. 在环境气氛下，将所有板在37°C下孵育过夜（图2）。
4. 用于菌落 PCR 的 LB 培养基的制备
   1. 将 7.5 g LB 与 300 mL dH₂O 溶解在瓶子中，并高压灭菌 LB 培养基（在 121 °C 下灭菌 20 分钟）。
   2. 将 9 mg 卡那霉素 （30 μg/mL） 与 1 mL dH₂O 溶解，并置于 -20 °C 下。 高压灭菌后，将 1 mL 卡那霉素加入装有无菌 300 mL LB 培养基的瓶子中。将液体培养基储存在 +4 °C 直至使用。
5. 通过菌落 PCR 筛选转化体
   1. 为了确认所有转化体都携带重组基因，随机选择菌落，并使用克隆试剂盒随附的测序引物通过 PCR 扩增靶基因。
   2. 在冰上执行所有步骤，并在使用前预冷所有 PCR 管和 15 mL 管。
   3. 使用移液器吸头，将每个样品的一半选定菌落转移到 PCR 管中。用移液器吸头取出另一半菌落，将其放入含有 5 mL LB + 卡那霉素液体培养基（在步骤 1.4 中制备）的 15 mL 试管中。涡旋 15 mL 试管，并在振荡培养箱中以 250 rpm 的速度在 37 °C 下孵育液体培养物过夜。
   4. 将 50 μL PCR 反应混合物（25 μL 预混液、1 μL 正向引物、1 μL 反向引物、23 μL 不含 DNase/RNase 的蒸馏水）放入所有 PCR 管中，并通过轻轻上下吹打分散细胞。
   5. 将 PCR 程序设置为 95 °C 5 分钟，通过裂解细菌细胞释放基因组 DNA，总共 40 个循环，95 °C 30 秒用于初始变性，60 °C 30 秒用于退火，72 °C 1 分钟用于延伸，72 °C 10 分钟用于最终延伸。
   6. 在 1% 琼脂糖凝胶上以 100 V 运行 60 分钟后，通过凝胶电泳方法检查 PCR 产物（图 3）。DNA 凝胶电泳的细节在步骤 1.1.3 中描述。
   7. 制备成功转化体的 15% 甘油储备液。将 500 μL 的 60% 甘油原液放入冻存管中，并加入 1,500 μL 成功转化体的液体培养物。将制备好的原液储存在 -80 °C。

2. L-鼠李糖诱导蛋白表达

1. 用 1 L 含有 30 μg/mL 卡那霉素的 LB 液体培养基制备预培养物。
2. 将 8 mL LB 培养基放入 50 mL 离心管中。使用其中一个试管作为仅包含液体培养基的阴性对照。对于 20% L-鼠李糖作为原液，将 0.5 g L-鼠李糖与 2.5 mL dH₂O 溶解，并储存在 -20 °C 直至使用。
3. 将 10 μL 细菌原液放入含有 8 mL 液体培养基的离心管中。轻轻涡旋它们并在 37 °C 下在振荡培养箱中孵育过夜。
4. 将 250 mL LB 液体培养基倒入灭菌的 2 L 锥形瓶中。
5. 将 2.5 mL 过夜液体培养物接种到含有 LB 液体培养基的 2 L 培养瓶中，培养瓶与培养基之间的比例为 1：100，并在 37 °C 和 150 rpm 下在振荡培养箱中孵育 4 小时。
6. 用分光光度计测量细菌细胞在 600 nm 处的光密度 （OD₆₀₀）。当细胞达到 0.5-0.6 的光密度时，向 250 mL LB 培养物中加入 2.5 mL 的 20% 鼠李糖（终浓度为 0.2%），并在 37 °C 下以 250 rpm 在振荡培养箱中孵育过夜。
7. 将液体培养物转移到 5 x 50 mL 试管中，在 +4 °C 下以 3724 x g 离心样品 15 分钟，然后弃去上清液。将沉淀储存在 -20 °C 直至纯化步骤。
   注意：为了用 SDS-PAGE 评估蛋白质表达，收集 1 mL 未诱导（当培养物在 0.5-0.6 的光密度为 600 nm 时，无 L-鼠李糖）培养物作为对照，收集 1 mL 诱导培养物（过夜孵育后）作为诱导样品。将所有样品以 12,000 x g 的离心力微量离心 1 分钟，并分别用 50 μL 和 100 μL 的 SDS-PAGE 上样缓冲液重悬未诱导和诱导的样品。

3. 含有 His 标签酶的化学感受态 大肠杆菌 细胞的细胞裂解

1. 制备裂解缓冲液 pH 8.0（50 mM Tris-HCl、200 mM NaCl、1 mM 咪唑、1% SDS）、平衡缓冲液 pH 7.4（20 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、10 mM 咪唑）、洗涤缓冲液 pH 7.4（20 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、25 mM 咪唑）和洗脱缓冲液 pH 7.4（20 mM NaH₂PO₄、 300 mM NaCl，250 mM 咪唑）。
2. 将含有细胞沉淀的 50 mL 试管置于 -80 °C 下 15 分钟以冻结。然后，从 -80 °C 中取出沉淀并在室温下解冻。
3. 向沉淀中加入 5 mL dH₂O，上下移液溶解。在 +4 °C 下以 3724 x g 离心 15 分钟，然后弃去上清液。
4. 对于 50 mL 培养沉淀，向沉淀中加入 6,300 μL 裂解缓冲液和 63 μL 不含 EDTA 的终止蛋白酶抑制剂混合物（比例为 1：100），并通过上下吹打溶解。将它们在冰上孵育 30 分钟，每 10 分钟涡旋一次。
5. 将超声仪的脉冲模式设置为 10 s ON 和 59 s OFF，振幅为 37%。将试管放入装有冰的烧杯中，然后将超声仪的探头浸入试管中。
   注意： 探头应完全浸入，不要接触管子的任何一侧。
6. 超声处理过程（6 个脉冲，10 秒，冷却 1 分钟）后，在 +4 °C 下以 3,724 x g 离心样品 45 分钟。 接下来，将所有上清液部分收集在试管中，并在 +4 °C 下以 3,724 x g 离心 5 分钟。
7. 将上清液收集到试管中，并在步骤 4.7 中取 100 μL 样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）。使用荧光计测量样品的蛋白质浓度。

4. 通过批量法纯化 His 标签酶

1. 向离心管中加入 1 mL Ni-NTA 树脂，并以 700 x g 离心 2 分钟。小心地取出试管并丢弃形成的上清液。
2. 向试管中加入 2 mL（填料体积的两倍）平衡缓冲液，并充分混合直至填料完全悬浮。将试管以 700 x g 离心 2 分钟，然后小心取出并丢弃缓冲液。
3. 在离心管中以 1：1 的比例混合蛋白质提取物和平衡缓冲液。将混合物加入含有树脂的试管中，并将其以 150 rpm 的速度放在振荡器上 30 分钟。将试管以 700 x g 离心 2 分钟，弃去上清液。
4. 用 5 mL 洗涤缓冲液洗涤树脂，并以 700 x g 的速度离心管 2 分钟。重复洗涤步骤，直到上清液的浓度降低到基线。
5. 向试管中加入 1 mL 洗脱缓冲液，以洗脱结合的 His 标记蛋白。将试管以 700 x g 离心 2 分钟。保存上清液，在步骤 4.7 中取 100 μL 用于 SDS-PAGE 分析。重复洗脱步骤 3 次。使用荧光计测量每个上清液的浓度。
6. 收集 10 kDa 截止管中的所有上清液，并以 700 x g 离心 2 分钟。重复离心，直到上清液的体积偶尔上下移液减少到 200 μL。将纯化的蛋白质储存在 -20 °C 下，并在步骤 4.7 中取 100 μL 用于 SDS-PAGE 分析。
   注：应测量蛋白质浓度，如果浓度低，则离心直至浓度升高。
7. 纯化蛋白质的 SDS-PAGE 分析
   1. 制备 4% 浓缩胶（40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺、1 M Tris pH 6.8、10% SDS、10% 过硫酸铵、TEMED、dH₂O）和 12% 分离凝胶（40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺、1 M Tris pH 8.8、10% SDS、10% 过硫酸铵、TEMED、dH₂O）。
   2. 将样品与 2x Laemmli 样品缓冲液以 1：1 的比例混合，并在 95 °C 下孵育 5 分钟以使蛋白质变性。
      注：上样前应测量样品的蛋白质浓度，上样体积将基于其相等上样时的浓度。
   3. 向槽中加入 1x 电泳缓冲液，将样品和蛋白质分子量标准品加载到孔中。首先在 80 V 下运行蛋白质，当蛋白质从堆积凝胶移动到分离凝胶时，将电流提高到 120 V。
   4. 将凝胶放入考马斯蓝染色染料中，放入摇床中 30 分钟。用脱色溶液（250 mL dH₂O + 50 mL 乙酸 （HOAc） + 200 mL 甲醇）洗涤凝胶，并拍摄图像（图 4）。

结果

本研究靶向从不同来源选择的糖基水解酶成员酶。假设具有不同结构的不同酶的共应用可以提供更好的聚糖释放，因为它们被进化为在不同的糖蛋白中具有活性。表 1 中列出了靶基因及其来源的列表。细菌菌株来自比利时微生物协调收藏。引物组是根据制造商的指南设计的（补充表 1）。N-His Kan 载体的正向和反向引物设计为;F：5'-猫 CAC CAC CAC 猫 C...

讨论

与其他传统克隆方案相比，用于靶基因分子克隆的 体内 重组克隆策略可提供快速可靠的结果。尽管分子克隆有很多方便的方法，但本文中描述的方法具有更多优势。 与其他 克隆系统不同，体内克隆系统不需要对 PCR 产物进行任何酶处理或纯化。此外，没有与序列连接相关的限制或限制性内切酶的要求。在该系统中，可以通过将扩增的基因与细胞和载体（随...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
EconoTaq PLUS 2X Master Mix	Lucigen	30035-1	Amplification of target genes (PCR)
DNase/RNase-free distilled water	Invitrogen	10977035	Amplification of target genes (PCR)
Safe-Red Loading Dye	abm	G108-R	DNA gel electrophoresis
1 kb Plus DNA Ladder	GoldBio	D011-500	DNA gel electrophoresis
Qubit protein assay kit	Invitrogen	Q33211	Measurement of DNA concentration
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	amresco	J106-2KG	Bacterial culture media
Agarose	Invitrogen	16500-500	Bacterial culture mediaet al.
Kanamycin Monosulfate	GoldBio	K-120-5	Antibiotic in bacterial culture media
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, N-His	Lucigen	49011-1	Cloning Kit
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, SUMO	Lucigen	49013-1	Cloning Kit
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, C-His	Lucigen	49012-1	Cloning Kit
Glycerol Solution	Sigma-Aldrich	15524-1L-R	Preparation of glycerol stock
L-Rhamnose monohydrate	Sigma-Aldrich	83650	Induction of protein expression
2X Laemmli Sample Buffer	ClearBand	TGS10	SDS-Page analysis
SureCast 40% (w/v) Acrylamide	Invitrogen	HC2040	SDS-Page analysis
SureCast APS	Invitrogen	HC2005	SDS-Page analysis
SureCast TEMED	Invitrogen	HC2006	SDS-Page analysis
10X Running Buffer	ClearBand	TGS10	SDS-Page analysis
Triset al.	BioShop	TRS001.1	SDS-Page analysis and cell lysis
10% SDS	ClearBand	S100	SDS-Page analysis
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder	ThermoFisher	26619	SDS-Page analysis
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750	Cell lysis
NaCl	Sigma-Aldrich	31434-5Kg-R	Cell lysis
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous	amresco	0571-1Kg	Sodium phosphate buffer for cell lysis
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrateet al.	Sigma-Aldrich	04272-1Kg	Sodium phosphate buffer for cell lysis
10-kDa-cut-off centrifugal filter	Amicon®- MERCK	UFC9010	Purification of enzymes