N型糖鎖遊離のためのビフィズス菌エンドグリコシダーゼの組換え生産

要約

ビフィズス菌は、 N型糖鎖切断のためのユニークなゲノム能力を持っています。これらの酵素を組換えで作製することは、初乳などの糖タンパク質に富む基質から生理活性 N型糖鎖を遊離させるための有望な新規ツールとなるでしょう。

要約

タンパク質のグリコシル化は、多様で一般的な翻訳後修飾であり、タンパク質のフォールディング、安定性、酵素保護、生物学的認識などのタンパク質機能など、多くの重要な役割と関連しています。糖タンパク質に結合した N型糖鎖(ラクトフェリン、ラクタフェリン、免疫グロブリンなど)は、宿主によって消化されず、大腸に到達し、そこで特定の有益な微生物によって消費されます。したがって、それらは腸内細菌叢の有益な微生物を選択的に刺激することができる次世代のプレバイオティクス化合物と考えられています。しかし、これらの新しいクラスのプレバイオティクスを単離するには、新しい酵素が必要です。ここでは、糖タンパク質からの N型糖鎖単離を改善するための、異なるビフィズス菌株(乳児、ウサギ、ニワトリ、マルハナバチから単離)からの新規グリコシダーゼの組換え生産について説明します。この研究で提示された方法には、 in vivo 組換えクローニング戦略によるビフィズス菌遺伝子の分子クローニング、形質転換成功の制御、タンパク質誘導、およびタンパク質精製のステップが含まれます。

概要

グリコシル化は、タンパク質で観察される非常に重要な翻訳後修飾です。タンパク質の約50%以上が真核生物のグリコシル化形態で見られます。N-グリコシル化とO-グリコシル化は、グリコシル化の2つの主要なタイプです^1,2。O-結合型糖鎖(O-glycan)は、N-アセチルガラクトサミンを介して、セリン(Ser)またはスレオニン(Thr)アミノ酸残基のヒドロキシル基にタンパク質に共有結合しています。N-結合型糖鎖(N-glycans)は、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)を介してタンパク質のアスパラギン(Asn)アミノ酸残基に共有結合した複合オリゴ糖であり、N-X-Ser/Thrという特定のアミノ酸配列と、あまり一般的ではないN-X-Cys(システイン)(Xはプロリン以外の任意のアミノ酸)^3,4に結合しています。基本的なN型糖鎖コアは、2つのHexNAc残基と3つのマンノース残基で構成されています。この共通コアがグリコシルトランスフェラーゼやグリコシダーゼ酵素を介して他の単糖類とさらに伸長すると、分岐の程度と結合の種類に基づいてN型糖鎖の種類が決定^{される5。}N型糖鎖は一般に、ハイマンノース(HM)、コンプレックスタイプ(CT)、ハイブリッド(HY)の3つの主要なクラスに分類されます⁶。

N型糖鎖は、配糖体加水分解酵素が不足しているため、宿主生物によって難消化性化合物です。これらの化合物は、何千もの異なる細菌種がそれらを利用する未消化の形で小腸/大腸に到達し、特殊な腸内微生物、特にビフィズス菌種⁷を促進することにより、プレバイオティクスとして作用することができます。最近の知見では、N型糖鎖が特定の細菌種の成長を選択的に刺激することが示された^8,9。ウシ乳糖タンパク質から遊離したN型糖鎖は、乳児の腸内で重要なビフィズス菌種であるビフィドバクテリウム・ロンガム亜種インファンティス(B. infantis)の増殖を選択的に刺激したが、ビフィズス菌animalis(B. animalis)などの他のビフィズス菌種はこれらの化合物を利用していなかった⁹。さらに、最近のin vivo研究では、牛乳ラクトフェリンおよび免疫グロブリン由来の19のユニークなN型糖鎖が、B. infantis⁸の増殖を選択的に刺激することが実証されました。特に、B. infantisは糖鎖切断と代謝のゲノム能力を持っています。B. infantis ATCC 15697から組換えで作製したグリコシル加水分解酵素ファミリー18に属するEndo-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(EndoBI-1)は、in vitro条件で牛乳糖タンパク質に対して高い活性を示した^9,10。この新規グリコシド加水分解酵素は、N-グリカン^10,11に見られるN-N'-ジアセチルキトビオース部分を切断することができる。EndoBI-1の活性は、コアのフコース化や、高温、pH、反応時間などの異なる反応条件の影響を受けません^3,11,12。ビフィズス菌配糖体加水分解酵素のこのユニークな特性は、ウシ初乳などの糖タンパク質に富む基質からN型糖鎖を生成するための有望なツールを提供します^13,14。

糖タンパク質からN型糖鎖およびO型糖鎖を得るために、化学的および酵素的に開発されたいくつかの脱グリコシル化法が広く使用されてきました^2,15。化学的方法は、その使いやすさ、低コスト、および高い基質特異性のために、糖タンパク質の脱グリコシル化のために糖鎖生物学で広く使用されています¹⁶。最も一般的な化学的脱グリコシル化法は、β脱とヒドラジン化である¹⁷。これらの方法のうち、β脱離は、糖タンパク質をアルカリ性条件に曝露することにより、糖タンパク質から糖鎖を切断する原理に基づいています。放出された糖鎖は、β脱離反応によりプロセス中に分解される可能性がありますが、この問題は水素化ホウ素ナトリウム(_NaBH4)などの還元剤を使用して防ぐことができます18,19,20。β消去法にはさまざまな制限があります。還元剤は糖鎖をアルジトールに変換し、それらが蛍光色素分子や発色団に結合するのを防ぎます。したがって、糖鎖放出のモニタリングが困難になる^19,20。この分析法の洗浄ステップでは塩分含有量が高いため、溶出によりサンプル損失が発生する可能性があります²⁰。糖タンパク質から糖鎖を遊離させる別の方法は、糖タンパク質に無水ヒドラジンを添加した後の加水分解反応の原理に基づくヒドラジン法です。水分解法は、温度などの反応条件を変えることで糖鎖の単離を制御できることから、糖鎖生物学²¹において広く用いられてきた。化学的脱グリコシル化は、他の化学的脱グリコシル化方法16,22,23に加えて、フッ化水素およびトリフルオロ酢酸の無水製剤を用いても実施することができる。糖タンパク質からのN型糖鎖の酵素的放出は、一般に、そのサイズや電荷に関係なく、N型糖鎖を放出するペプチジル-N-グリコシダーゼ(PNGase)によって行われます24,25,26,27。化学的脱グリコシル化法と同様に、酵素による脱グリコシル化プロセスにはさまざまな課題があります。PNGaseは、いくつかの界面活性剤が使用されている中で活性を示し、糖鎖への酵素のアクセシビリティを高めます。しかし、これらの過酷な処理は、天然の糖鎖と残りのポリペプチド構造を破壊する可能性がある²⁸。PNGaseは、N-アセチルグルコサミン²⁹に結合したフコースがある場合、糖鎖を切断しない可能性がある。F1、F2、F3などのさまざまなエンドグリコシダーゼは、PNGaseよりも天然タンパク質に対してより多くの活性を示します。これらのエンドグリコシダーゼは、マルチアンテナ型糖鎖に対する活性が低いのに対し、耐熱性の新規EndoBI-1は、すべてのタイプのN型糖鎖に有効である10,11,28。現在の方法の限界については、制限なく効果的な糖鎖放出を得るためには、新規の酵素が依然として必要であることは明らかです。この目的のために、ビフィズス菌種は、種々の配糖体加水分解酵素をコードする大きなゲノム島を有しており、糖タンパク質からN型糖鎖を切断することを可能にする^30,31。このような状況の中で、この研究の全体的な目的は、さまざまなビフィズス菌種から新しいグリコシダーゼを発見することです。これらの酵素を組換え的に生産するために、さまざまな融合タグがそれらの産生と活性を強化することを目的としています。

プロトコル

1. ビフィズス菌遺伝子の分子クローニング

1. 3つのベクタープライマーセット(N-His、C-His、N-His SUMO)による標的遺伝子のPCR増幅
   1. 100 μMのストックプライマー(オリゴマー)溶液を、会社が定めた量の滅菌水を加えて作製します。これらのストックから10 μMの新しいストックを調製し、標的遺伝子のPCR増幅に使用します。
   2. PCR チューブに 25 μL のマスターミックス、1 μL のフォワードおよびリバースプライマー (0.2 μM)、21 μL の DNase/RNase フリー蒸留水、2 μL のテンプレート DNA(細菌細胞) を含む PCR 混合物 (総容量 50 μL) を調製します。ピペッティングで上下させて混合物を穏やかに攪拌します。
      注:PCR に使用されるマスターミックス(Lucigen)には、高純度で高活性の Taq DNA ポリメラーゼが含まれており、高温でも機能して最大 5 kb のテンプレートを高信頼性で増幅できます。
   3. PCRプログラムを次のように設定します:ゲノムDNAの放出のために95°Cで5分間の初期変性ステップ、次に95°Cで30秒間の40サイクルの変性、60°Cで30秒間のアニーリング、72°Cで1分間の伸長、および72°Cで10分間の伸長。
   4. 1%アガロースゲル上で100 Vで60分間実行した後、ゲルドキュメンテーションシステムを用いたアガロースゲル電気泳動法によりPCR産物を確認します。1:5の比率(5 μLのPCR産物+1 μLのローディング色素、5 μLの1 kb DNAラダー+1 μLのローディング色素)で混合して、PCR産物とDNAラダーをローディング色素と混合し、ゲルにロードします(図1)。
   5. 分子クローニングステップの前に、蛍光光度計を使用してPCR産物のDNA濃度を測定します。
      注:PCR産物の濃度は、分子クローニングに必要な範囲(25-100 ng /μL)である必要があります。
2. 分子クローニングのためのLysogeny Broth(LB)寒天培地の調製
   1. 12.5 gのLBと6 gのアガロースを500 mLのdH₂Oに溶解し、LB寒天培地をオートクレーブします(121°Cで20分間滅菌)。
   2. 15 mgのカナマイシンを1 mLのdH₂Oに溶解し、-20°Cで保存します。
   3. オートクレーブ後、滅菌した500mLのLB寒天培地が入ったボトルに1mLのカナマイシンを加えます。カナマイシンの最終濃度は30μg/mLです。25 mLのLB寒天カナマイシン培地を実験室キャビネットの各プレートに注ぎます。
3. 化学的にコンピテントな 大腸菌 細胞の熱ショック形質転換
   1. 各株のPCR産物1〜3 μL(25〜100 ng)をチューブに加え、40 μLの化学的にコンピテントな 大腸菌 細胞を含めます。次に、2 μLのベクターDNAを同じチューブに加えます。ピペットチップで静かに攪拌し、混合物を15mLの遠心分離チューブに移します。
      注:この手順は氷上で実行します。気泡や誤って細胞を温めないように、ピペットで上下させて混ぜないでください。
   2. コンピテントセルとDNAを含むチューブを氷上で30分間インキュベートします。混合物にヒートショックを42°Cのウォーターバスで45秒間加えます。これらのチューブをすぐに氷の上に置き、2分間インキュベートします。
   3. 分子クローニング後の細胞の迅速な回収に使用される回収培地960μLをチューブ内の細胞に加え、振とうインキュベーターでチューブを250rpmで37°C、1時間インキュベートします。
   4. 30 μg/mL のカナマイシンを含む LB 寒天プレートに形質転換細胞 100 μL をプレートします。ネガティブコントロールとしては、化学的にコンピテントな 大腸菌 細胞のみを使用してください。
      注:ステップ1.2.2で調製した30μg/mLのカナマイシンを含むLB寒天プレートをインキュベーターの37°Cに置いてから使用してください。
   5. すべてのプレートを周囲雰囲気下で37°Cで一晩インキュベートします(図2)。
4. コロニーPCR用LB培地の調製
   1. 7.5 gのLBを300 mLのdH₂Oとともにボトルに溶解し、LB培地をオートクレーブします(121°Cで20分間滅菌)。
   2. 9 mgのカナマイシン(30 μg/mL)を1 mLのdH₂Oとともに溶解し、-20°Cで静置します。 オートクレーブ後、滅菌した300 mLのLB培地が入ったボトルにカナマイシン1 mLを加えます。液体培地は、使用するまで+4°Cで保存してください。
5. コロニーPCRによる形質転換体のスクリーニング
   1. すべての形質転換体が組換え遺伝子を保有していることを確認するには、コロニーをランダムに選択し、クローニングキットに付属のシーケンシングプライマーを使用してPCRによって標的遺伝子を増幅します。
   2. 氷上ですべてのステップを実行し、使用前にすべてのPCRチューブと15mLチューブを事前に冷却します。
   3. ピペットチップを使用して、選択したコロニーの半分を各サンプルのPCRチューブに移します。ピペットチップでコロニーのさらに半分を取り、5 mLのLB +カナマイシン液体培地(ステップ1.4で調製)が入った15 mLチューブに入れます。15 mLチューブをボルテックスし、振とうインキュベーターで250 rpm、37°Cで一晩インキュベートします。
   4. PCR反応混合物50 μL(マスターミックス25 μL、フォワードプライマー1 μL、リバースプライマー1 μL、DNase/RNaseフリー蒸留水23 μL)をすべてのPCRチューブに入れ、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞を分散させます。
   5. PCRプログラムを95°Cで5分間設定し、細菌細胞を溶解してゲノムDNAを放出し、初期変性のために95°Cで30秒間、アニーリングで60°Cで30秒間、72°Cで1分間伸長し、72°Cで10分間の最終伸長を行います。
   6. 1%アガロースゲル上で100 Vで60分間分析した後、ゲル電気泳動法でPCR産物を確認します(図3)。DNAゲル電気泳動の詳細は、ステップ1.1.3で説明します。
   7. 成功した形質転換剤の15%グリセロールストックを調製します。クライオチューブに500 μLの60%グリセロールストックを入れ、成功した形質転換体の液体培養物1,500 μLを加えます。調製したストックは-80°Cで保存してください。

2. L-ラムノースのタンパク質発現誘導

1. 30 μg/mLのカナマイシンを含む1 LのLB液体培地で予備培養を調製します。
2. 8 mLのLB培地を50 mLの遠心チューブに入れます。チューブの1つを、液体媒体のみを含むネガティブコントロールとして使用します。20% L-ラムノースをストックする場合は、0.5 gのL-ラムノースを2.5 mLのdH₂Oに溶解し、使用するまで-20°Cで保存します。
3. 10 μLの細菌ストックを、8 mLの液体培地が入った遠心分離チューブに入れます。それらを穏やかにボルテックスし、37°Cで振とうインキュベーターで一晩インキュベートします。
4. 250 mLのLB液体培地を滅菌した2 L三角フラスコに注ぎます。
5. 2.5 mLの一晩の液体培養物を、LB液体培地を含む2 Lフラスコにフラスコと培地との間に1:100の比率で接種し、振とうインキュベーター内で37°Cおよび150rpmで4時間インキュベートします。
6. 分光光度計により、細菌細胞の600nm(_OD600)での光学密度を測定します。細胞が光学密度0.5〜0.6に達したら、250 mLのLB培養物に2.5 mLの20%ラムノース(最終濃度は0.2%)を加え、振とうインキュベーターで37°Cで250 rpmで一晩インキュベートします。
7. 液体培養物を5 x 50 mLチューブに移し、サンプル3724 x g を+4°Cで15分間遠心分離し、上清を捨てます。精製ステップまで、ペレットを-20°Cで保存します。
   注:SDS-PAGEでタンパク質発現を評価するには、コントロールとして1 mLの非誘導培養(光学密度600 nmの0.5-0.6で培養した場合、L-ラムノースなし)を、誘導サンプルとして1 mLの誘導培養(一晩インキュベーション後)を収集します。すべてのサンプルを12,000 x g で1分間微量遠心分離し、50 μLおよび100 μLのSDS-PAGEローディングバッファーで、非誘導サンプルおよび誘導サンプルをそれぞれ再懸濁します。

3. Hisタグ酵素を含むケミカルコンピテント 大腸菌 細胞の細胞溶解

1. 溶解緩衝液 pH 8.0 (50 mM Tris-HCl、200 mM NaCl、1 mM イミダゾール、1% SDS)、平衡緩衝液 pH 7.4 (20 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、10 mM イミダゾール)、洗浄緩衝液 pH 7.4 (20 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、25 mM イミダゾール)、溶出緩衝液 pH 7.4 (20 mM NaH₂PO₄、 300 mM NaCl、250 mMイミダゾール)。
2. 細胞ペレットを入れた50mLチューブを-80°Cで15分間放置し、凍結します。次に、ペレットを-80°Cから取り出し、室温で解凍します。
3. ペレットに5mLの_dH2Oを加え、ピペッティングで上下に溶解します。3724 x g で+4°Cで15分間遠心分離し、上清を捨てます。
4. 50 mLの培養ペレットの場合、6,300 μLの溶解バッファーと63 μLのEDTAフリー停止プロテアーゼ阻害剤カクテル(1:100の比率)をペレットに加え、ピペッティングで上下に溶解します。それらを氷の上で30分間インキュベートし、10分ごとに渦巻きます。
5. ソニケーターのパルスモードを10秒ONと59秒OFFに設定し、 ampリチュールを37%に。チューブを氷の入ったビーカーに入れ、ソニケーターのプローブをチューブに浸します。
   注意: プローブは、チューブのどの側面にも触れずに完全に浸す必要があります。
6. 超音波処理プロセス(1分間の冷却で10秒間の6パルス)の後、サンプルを3,724 x g で+4°Cで45分間遠心分離します。 次に、すべての上清部分をチューブに集め、3,724 x g で+4°Cで5分間遠心分離します。
7. 上清をチューブに集め、ステップ4.7でドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)用のサンプル100μLを採取します。蛍光光度計を使用してサンプルのタンパク質濃度を測定します。

4. バッチ法によるHisタグ酵素の精製

1. 遠心チューブにNi-NTA樹脂1 mLを加え、700 x gで2分間遠心分離します。チューブを慎重に取り外し、形成された上清を捨てます。
2. 2 mL(レジン容量の2倍)の平衡化バッファーをチューブに加え、レジンが完全に懸濁するまでよく混合します。チューブを700 x g で2分間遠心分離し、バッファーを慎重に取り外して廃棄します。
3. タンパク質抽出物と平衡化バッファーを遠心チューブ内で1:1の比率で混合します。樹脂の入ったチューブに混合物を加え、150rpmのシェーカーに30分間置きます。チューブを700 x g で2分間遠心分離し、上清を捨てます。
4. レジンを5 mLの洗浄バッファーで洗浄し、チューブを700 x gで2分間遠心分離します。上清の濃度がベースラインまで減少するまで、洗浄手順を繰り返します。
5. 1 mLの溶出バッファーをチューブに加え、結合したHisタグ付きタンパク質を溶出します。チューブを700 x gで2分間遠心分離します。上清を保存し、ステップ4.7のSDS-PAGE分析のために100μLを取ってください。溶出ステップを3回繰り返します。蛍光光度計を使用して、各上清の濃度を測定します。
6. 10 kDaカットオフチューブにすべての上清を回収し、700 x gで2分間遠心分離します。上清の量が200 μLに減少するまで、時々ピペッティングして遠心分離を繰り返します。精製したタンパク質を-20°Cで保存し、ステップ4.7のSDS-PAGE分析のために100μLを取っておきましょう。
   注:タンパク質濃度を測定し、濃度が低い場合は、増加するまで遠心分離する必要があります。
7. 精製タンパク質のSDS-PAGE解析
   1. 4% スタッキングゲル(40% アクリルアミド/ビスアクリルアミド、1 M Tris pH 6.8、10% SDS、10% 過硫酸アンモニウム、TEMED、dH₂O)と 12% 分離ゲル(40% アクリルアミド/ビスアクリルアミド、1 M Tris pH 8.8、10% SDS、10% 過硫酸アンモニウム、TEMED、dH₂O)を調製します。
   2. サンプルを2x Laemmli sample bufferと1:1の比率で混合し、95°Cで5分間インキュベートしてタンパク質を変性させます。
      注:サンプルのタンパク質濃度はロード前に測定する必要があり、ロード量は均等ローディングのための濃度に基づきます。
   3. 1xランニングバッファーをタンクに加え、サンプルとタンパク質ラダーをウェルにロードします。最初にタンパク質を80Vで実行し、タンパク質がスタッキングゲルから分離ゲルに移動するときに電流を120Vに上げます。
   4. ゲルをクーマシーブルー染色染料に入れ、シェーカーに30分間入れます。ゲルを脱染液(250 mL dH₂O + 50 mL 酢酸(HOAc)+ 200 mLメタノール)で洗浄し、画像を撮影します(図4)。

結果

この研究では、さまざまな起源から選択されたグリコシル加水分解酵素を標的としました。異なる構造を持つ異なる酵素を同時適用すると、それらは異なる糖タンパク質で活性を持つように進化しているため、より良い糖鎖放出が得られると考えられていました。標的遺伝子とその起源のリストを表1に示します。細菌株は、Belgium Co-ordinated Collections of Mic...

ディスカッション

標的遺伝子の分子クローニングに使用される in vivo 組換えクローニング戦略は、他の従来のクローニングプロトコルと比較して、迅速で信頼性の高い結果を提供します。分子クローニングには多くの便利な方法がありますが、この記事で説明する方法にはさらに多くの利点があります。 In vivo クローニングシステムは、他のクローニングシステムとは異...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
EconoTaq PLUS 2X Master Mix	Lucigen	30035-1	Amplification of target genes (PCR)
DNase/RNase-free distilled water	Invitrogen	10977035	Amplification of target genes (PCR)
Safe-Red Loading Dye	abm	G108-R	DNA gel electrophoresis
1 kb Plus DNA Ladder	GoldBio	D011-500	DNA gel electrophoresis
Qubit protein assay kit	Invitrogen	Q33211	Measurement of DNA concentration
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	amresco	J106-2KG	Bacterial culture media
Agarose	Invitrogen	16500-500	Bacterial culture mediaet al.
Kanamycin Monosulfate	GoldBio	K-120-5	Antibiotic in bacterial culture media
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, N-His	Lucigen	49011-1	Cloning Kit
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, SUMO	Lucigen	49013-1	Cloning Kit
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, C-His	Lucigen	49012-1	Cloning Kit
Glycerol Solution	Sigma-Aldrich	15524-1L-R	Preparation of glycerol stock
L-Rhamnose monohydrate	Sigma-Aldrich	83650	Induction of protein expression
2X Laemmli Sample Buffer	ClearBand	TGS10	SDS-Page analysis
SureCast 40% (w/v) Acrylamide	Invitrogen	HC2040	SDS-Page analysis
SureCast APS	Invitrogen	HC2005	SDS-Page analysis
SureCast TEMED	Invitrogen	HC2006	SDS-Page analysis
10X Running Buffer	ClearBand	TGS10	SDS-Page analysis
Triset al.	BioShop	TRS001.1	SDS-Page analysis and cell lysis
10% SDS	ClearBand	S100	SDS-Page analysis
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder	ThermoFisher	26619	SDS-Page analysis
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750	Cell lysis
NaCl	Sigma-Aldrich	31434-5Kg-R	Cell lysis
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous	amresco	0571-1Kg	Sodium phosphate buffer for cell lysis
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrateet al.	Sigma-Aldrich	04272-1Kg	Sodium phosphate buffer for cell lysis
10-kDa-cut-off centrifugal filter	Amicon®- MERCK	UFC9010	Purification of enzymes