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Method Article
Bifidobakterien besitzen eine einzigartige genomische Fähigkeit zur Spaltung von N-Glykanen. Die rekombinante Herstellung dieser Enzyme wäre ein vielversprechendes neuartiges Werkzeug, um bioaktive N-Glykane aus Glykoprotein-reichen Substraten wie Kolostrum freizusetzen.
Die Proteinglykosylierung ist eine vielfältige und häufige posttranslationale Modifikation, die mit vielen wichtigen Funktionen wie der Proteinfunktion, einschließlich Proteinfaltung, Stabilität, enzymatischem Schutz und biologischer Erkennung, in Verbindung gebracht wird. N-Glykane, die an Glykoproteine (wie Lactoferrin, Lactadherin und Immunglobuline) gebunden sind, können vom Wirt nicht verdaut werden und gelangen in den Dickdarm, wo sie von bestimmten nützlichen Mikroben verzehrt werden. Daher gelten sie als präbiotische Verbindungen der nächsten Generation, die die nützlichen Mikroorganismen des Darmmikrobioms selektiv stimulieren können. Die Isolierung dieser neuen Klassen von Präbiotika erfordert jedoch neuartige Enzyme. Hier beschreiben wir die rekombinante Produktion neuartiger Glykosidasen aus verschiedenen Bifidobakterienstämmen (isoliert aus Säuglingen, Kaninchen, Hühnern und Hummeln) für eine verbesserte N-Glykanisolierung aus Glykoproteinen. Die in dieser Studie vorgestellte Methode umfasst die folgenden Schritte: molekulare Klonierung von Bifidobakterien-Genen durch eine in vivo rekombinatorische Klonierungsstrategie, Kontrolle des Transformationserfolgs, Proteininduktion und Proteinreinigung.
Die Glykosylierung ist eine sehr wichtige posttranslationale Modifikation, die in Proteinen beobachtet wird. Etwa mehr als 50% der Proteine kommen in ihrer glykosylierten Form in Eukaryoten vor. Die N- und O-Glykosylierung sind die beiden Hauptarten der Glykosylierung 1,2. O-verknüpfte Glykane (O-Glykane) werden über N-Acetylgalactosamin kovalent an Proteine an die Hydroxylgruppe eines Serin- (Ser) oder Threonin (Thr)-Aminosäurerests gebunden. N-verknüpfte Glykane (N-Glykane) sind komplexe Oligosaccharide, die kovalent an den Asparagin (Asn)-Aminosäurerest der Proteine durch N-Acetylglucosamin (GlcNAc) in einer bestimmten Aminosäuresequenz alsN-X-Ser/Thr und einer weniger häufigen, alsN-X-Cys (Cystein) gebunden sind (wobei X jede Aminosäure außer Prolin sein kann)3,4. Der basische N-Glykankern besteht aus zwei HexNAc- und drei Mannoseresten. Eine weitere Verlängerung dieses gemeinsamen Kerns mit anderen Monosacchariden über Glykosyltransferase und Glykosidase-Enzyme bestimmt die Art der N-Glykane basierend auf dem Grad der Verzweigung und der Art der Bindung5. N-Glykane werden im Allgemeinen in drei Hauptklassen eingeteilt: hohe Mannose (HM), komplexer Typ (CT) und Hybrid (HY)6.
N-Glykane sind für die Wirtsorganismen aufgrund des Mangels an Glykosidhydrolase-Enzymen unverdauliche Verbindungen. Diese Verbindungen gelangen in unverdauter Form in den Dünn-/Dickdarm, wo sie von Tausenden verschiedener Bakterienarten verwertet werden, und sie können als Präbiotika wirken, indem sie spezialisierte Darmmikroben fördern, insbesondere Bifidobacterium-Spezies 7. Jüngste Erkenntnisse zeigen, dass N-Glykane selektiv das Wachstum bestimmter Bakterienarten stimulieren 8,9. N-Glykane, die aus Glykoproteinen von Rindermilch freigesetzt wurden, stimulierten selektiv das Wachstum von Bifidobacterium longum subspecies infantis (B. infantis), einer wichtigen Bifidobakterienart im Darm des Säuglings, aber andere Bifidobakterienarten wie Bifidobacterium animalis (B. animalis) nutzten diese Verbindungen nicht9. Darüber hinaus konnte in einer kürzlich durchgeführten In-vivo-Studie gezeigt werden, dass 19 einzigartige N-Glykane aus Milch, Lactoferrin und Immunglobulinen selektiv das Wachstum von B. infantisstimulieren 8. Insbesondere B. infantis besitzen eine genomische Fähigkeit zur Glykanspaltung und zum Stoffwechsel. Eine aus B. infantis ATCC 15697 rekombinant hergestellte Endo-β-N-Acetylglucosaminidase (EndoBI-1), die zur Glykosylhydrolase-Familie 18 gehört, zeigte unter in vitro Bedingungen eine hohe Aktivität auf Milchglykoproteine 9,10. Dieses neuartige Glykosidhydrolase-Enzym kann die N-N'-Diacetylchitobiose-Anteile spalten, die in den N-Glykanen vorkommen10,11. Die Aktivität von EndoBI-1 wird nicht durch die Kernfukosylierung und unterschiedliche Reaktionsbedingungen wie hohe Temperatur, pH-Wert, Reaktionszeit usw. beeinflusst 3,11,12. Diese einzigartige Eigenschaft von Bifidobakterien-Glykosidhydrolasen stellt ein vielversprechendes Werkzeug für die Herstellung von N-Glykanen aus glykoproteinreichen Substraten wie Rinderkolostrumdar 13,14.
Mehrere chemisch und enzymatisch entwickelte Deglykosylierungsmethoden wurden häufig eingesetzt, um N-Glykane und O-Glykane aus Glykoproteinenzu gewinnen 2,15. Chemische Methoden zur Deglykosylierung von Glykoproteinen werden in der Glykobiologie aufgrund ihrer einfachen Anwendung, ihrer geringen Kosten und ihrer hohen Substratspezifität häufig eingesetzt16. Die gebräuchlichsten chemischen Deglykosylierungsmethoden sind die β-Eliminierung und die Hydrazination17. Unter diesen Methoden basiert die β-Elimination auf dem Prinzip der Spaltung von Glykanen von Glykoproteinen durch Exposition von Glykoproteinen unter alkalischen Bedingungen. Die freigesetzten Glykane können während des Prozesses aufgrund der β-Eliminationsreaktionen abgebaut werden, aber dieses Problem kann mit Reduktionsmitteln wie Natriumborhydrid (NaBH4)18,19,20 verhindert werden. Es gibt unterschiedliche Einschränkungen bei der β-Eliminierungsmethode. Die Reduktionsmittel wandeln Glykane in Alditole um und verhindern, dass diese ein Fluorophor oder Chromophor binden. Daher wird es schwierig, die Glykanfreisetzung zu überwachen19,20. Aufgrund des hohen Salzgehalts im Reinigungsschritt der Methode kann die Elution zu Probenverlustenführen 20. Ein weiteres Verfahren zur Freisetzung von Glykan aus Glykoproteinen ist das Hydrazin-Verfahren, das auf dem Prinzip der Hydrolysereaktion nach Zugabe von wasserfreiem Hydrazin zum Glykoprotein basiert. Da sie es ermöglicht, die Isolierung von Glykanen durch Änderung der Reaktionsbedingungen wie der Temperatur zu kontrollieren, ist die Hydrazinationsmethode in der Glykobiologie weit verbreitet21. Die chemische Deglykosylierung kann auch unter Verwendung der wasserfreien Formulierung von Fluorwasserstoff und Trifluoressigsäure zusätzlich zu anderen chemischen Deglykosylierungsverfahren durchgeführt werden 16,22,23. Die enzymatische Freisetzung von N-Glykanen aus Glykoproteinen wird üblicherweise durch Peptidyl-N-Glykosidasen (PNGasen) durchgeführt, die im Allgemeinen N-Glykane freisetzen, unabhängig von ihrer Größe und Ladung 24,25,26,27. Ähnlich wie bei den chemischen Deglykosylierungsmethoden gibt es auch bei der enzymatischen Deglykosylierung unterschiedliche Herausforderungen. PNGasen zeigen Aktivität in Gegenwart mehrerer verwendeter Detergenzien, die die Zugänglichkeit der Enzyme zu den Glykanen erhöhen. Diese harten Behandlungen könnten jedoch die nativen Glykane und die verbleibenden Polypeptidstrukturen stören28. PNGasen können die Glykane nicht spalten, wenn eine Fukose an N-Acetylglucosamin29 gebunden ist. Verschiedene Endoglykosidasen wie F1, F2 und F3 zeigen eine höhere Aktivität auf den nativen Proteinen als PNGasen. Diese Endoglykosidasen haben eine geringe Aktivität auf den Glykanen mit mehreren Antennen, während das hitzebeständige neuartige EndoBI-1 in allen Arten von N-Glykanen wirksam ist 10,11,28. Hinsichtlich der Grenzen der derzeitigen Methoden liegt es auf der Hand, dass für eine effektive Glykanfreisetzung ohne Einschränkungen noch neuartige Enzyme erforderlich sind. Zu diesem Zweck ermöglichen Bifidobakterienarten, die über eine große genomische Insel verfügen, die für verschiedene Glykosidhydrolasen-Enzyme kodiert, die Spaltung von N-Glykanen aus Glykoproteinen 30,31. In diesem Zusammenhang besteht das übergeordnete Ziel dieser Studie darin, neue Glykosidasen aus den verschiedenen Bifidobakterienarten zu entdecken. Um diese Enzyme rekombinant herzustellen, sollen verschiedene Fusionsmarkierungen ihre Produktion sowie ihre Aktivität verbessern.
1. Molekulare Klonierung von Bifidobakterien-Genen
2. L-Rhamnose-Induktion der Proteinexpression
3. Zelllyse von chemisch kompetenten E. coli-Zellen , die His-markierte Enzyme enthalten
4. Aufreinigung von His-markierten Enzymen nach der Batch-Methode
In dieser Studie wurden Glycosylhydrolase-Mitgliedsenzyme unterschiedlicher Herkunft ins Visier genommen. Es wurde angenommen, dass die gleichzeitige Anwendung verschiedener Enzyme mit unterschiedlichen Strukturen zu einer besseren Glykanfreisetzung führen könnte, da sie so entwickelt wurden, dass sie in verschiedenen Glykoproteinen aktiv sind. Die Liste der Zielgene und deren Herkunft ist in Tabelle 1 aufgeführt. Die Bakterienstämme wurden aus den belgischen koordin...
Die in vivo rekombinatorische Klonierungsstrategie, die für die molekulare Klonierung der Zielgene verwendet wird, liefert im Vergleich zu anderen traditionellen Klonierungsprotokollen schnelle und zuverlässige Ergebnisse. Auch wenn es viele bequeme Methoden zum molekularen Klonen gibt, hat die in diesem Artikel beschriebene Methode noch mehr Vorteile. Das In-vivo-Klonierungssystem benötigt im Gegensatz zu anderen Klonierungssystemen keine enzymatische Behandlung ode...
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Diese Studie wird von TUBITAK #118z146 und Uluova Süt Ticaret A.Ş (Uluova Milk Trading Co.) unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EconoTaq PLUS 2X Master Mix | Lucigen | 30035-1 | Amplification of target genes (PCR) |
DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977035 | Amplification of target genes (PCR) |
Safe-Red Loading Dye | abm | G108-R | DNA gel electrophoresis |
1 kb Plus DNA Ladder | GoldBio | D011-500 | DNA gel electrophoresis |
Qubit protein assay kit | Invitrogen | Q33211 | Measurement of DNA concentration |
LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | amresco | J106-2KG | Bacterial culture media |
Agarose | Invitrogen | 16500-500 | Bacterial culture mediaet al. |
Kanamycin Monosulfate | GoldBio | K-120-5 | Antibiotic in bacterial culture media |
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, N-His | Lucigen | 49011-1 | Cloning Kit |
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, SUMO | Lucigen | 49013-1 | Cloning Kit |
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, C-His | Lucigen | 49012-1 | Cloning Kit |
Glycerol Solution | Sigma-Aldrich | 15524-1L-R | Preparation of glycerol stock |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma-Aldrich | 83650 | Induction of protein expression |
2X Laemmli Sample Buffer | ClearBand | TGS10 | SDS-Page analysis |
SureCast 40% (w/v) Acrylamide | Invitrogen | HC2040 | SDS-Page analysis |
SureCast APS | Invitrogen | HC2005 | SDS-Page analysis |
SureCast TEMED | Invitrogen | HC2006 | SDS-Page analysis |
10X Running Buffer | ClearBand | TGS10 | SDS-Page analysis |
Triset al. | BioShop | TRS001.1 | SDS-Page analysis and cell lysis |
10% SDS | ClearBand | S100 | SDS-Page analysis |
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder | ThermoFisher | 26619 | SDS-Page analysis |
Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | Cell lysis |
NaCl | Sigma-Aldrich | 31434-5Kg-R | Cell lysis |
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous | amresco | 0571-1Kg | Sodium phosphate buffer for cell lysis |
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrateet al. | Sigma-Aldrich | 04272-1Kg | Sodium phosphate buffer for cell lysis |
10-kDa-cut-off centrifugal filter | Amicon®- MERCK | UFC9010 | Purification of enzymes |
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