Rekombinante Produktion von bifidobakteriellen Endoglykosidasen zur Freisetzung von N-Glykanen

Zusammenfassung

Bifidobakterien besitzen eine einzigartige genomische Fähigkeit zur Spaltung von N-Glykanen. Die rekombinante Herstellung dieser Enzyme wäre ein vielversprechendes neuartiges Werkzeug, um bioaktive N-Glykane aus Glykoprotein-reichen Substraten wie Kolostrum freizusetzen.

Zusammenfassung

Die Proteinglykosylierung ist eine vielfältige und häufige posttranslationale Modifikation, die mit vielen wichtigen Funktionen wie der Proteinfunktion, einschließlich Proteinfaltung, Stabilität, enzymatischem Schutz und biologischer Erkennung, in Verbindung gebracht wird. N-Glykane, die an Glykoproteine (wie Lactoferrin, Lactadherin und Immunglobuline) gebunden sind, können vom Wirt nicht verdaut werden und gelangen in den Dickdarm, wo sie von bestimmten nützlichen Mikroben verzehrt werden. Daher gelten sie als präbiotische Verbindungen der nächsten Generation, die die nützlichen Mikroorganismen des Darmmikrobioms selektiv stimulieren können. Die Isolierung dieser neuen Klassen von Präbiotika erfordert jedoch neuartige Enzyme. Hier beschreiben wir die rekombinante Produktion neuartiger Glykosidasen aus verschiedenen Bifidobakterienstämmen (isoliert aus Säuglingen, Kaninchen, Hühnern und Hummeln) für eine verbesserte N-Glykanisolierung aus Glykoproteinen. Die in dieser Studie vorgestellte Methode umfasst die folgenden Schritte: molekulare Klonierung von Bifidobakterien-Genen durch eine in vivo rekombinatorische Klonierungsstrategie, Kontrolle des Transformationserfolgs, Proteininduktion und Proteinreinigung.

Einleitung

Die Glykosylierung ist eine sehr wichtige posttranslationale Modifikation, die in Proteinen beobachtet wird. Etwa mehr als 50% der Proteine kommen in ihrer glykosylierten Form in Eukaryoten vor. Die N- und O-Glykosylierung sind die beiden Hauptarten der Glykosylierung ^1,2. O-verknüpfte Glykane (O-Glykane) werden über N-Acetylgalactosamin kovalent an Proteine an die Hydroxylgruppe eines Serin- (Ser) oder Threonin (Thr)-Aminosäurerests gebunden. N-verknüpfte Glykane (N-Glykane) sind komplexe Oligosaccharide, die kovalent an den Asparagin (Asn)-Aminosäurerest der Proteine durch N-Acetylglucosamin (GlcNAc) in einer bestimmten Aminosäuresequenz alsN-X-Ser/Thr und einer weniger häufigen, alsN-X-Cys (Cystein) gebunden sind (wobei X jede Aminosäure außer Prolin sein kann)^3,4. Der basische N-Glykankern besteht aus zwei HexNAc- und drei Mannoseresten. Eine weitere Verlängerung dieses gemeinsamen Kerns mit anderen Monosacchariden über Glykosyltransferase und Glykosidase-Enzyme bestimmt die Art der N-Glykane basierend auf dem Grad der Verzweigung und der Art der Bindung⁵. N-Glykane werden im Allgemeinen in drei Hauptklassen eingeteilt: hohe Mannose (HM), komplexer Typ (CT) und Hybrid (HY)⁶.

N-Glykane sind für die Wirtsorganismen aufgrund des Mangels an Glykosidhydrolase-Enzymen unverdauliche Verbindungen. Diese Verbindungen gelangen in unverdauter Form in den Dünn-/Dickdarm, wo sie von Tausenden verschiedener Bakterienarten verwertet werden, und sie können als Präbiotika wirken, indem sie spezialisierte Darmmikroben fördern, insbesondere Bifidobacterium-Spezies ⁷. Jüngste Erkenntnisse zeigen, dass N-Glykane selektiv das Wachstum bestimmter Bakterienarten stimulieren ^8,9. N-Glykane, die aus Glykoproteinen von Rindermilch freigesetzt wurden, stimulierten selektiv das Wachstum von Bifidobacterium longum subspecies infantis (B. infantis), einer wichtigen Bifidobakterienart im Darm des Säuglings, aber andere Bifidobakterienarten wie Bifidobacterium animalis (B. animalis) nutzten diese Verbindungen nicht⁹. Darüber hinaus konnte in einer kürzlich durchgeführten In-vivo-Studie gezeigt werden, dass 19 einzigartige N-Glykane aus Milch, Lactoferrin und Immunglobulinen selektiv das Wachstum von B. infantis^{stimulieren 8}. Insbesondere B. infantis besitzen eine genomische Fähigkeit zur Glykanspaltung und zum Stoffwechsel. Eine aus B. infantis ATCC 15697 rekombinant hergestellte Endo-β-N-Acetylglucosaminidase (EndoBI-1), die zur Glykosylhydrolase-Familie 18 gehört, zeigte unter in vitro Bedingungen eine hohe Aktivität auf Milchglykoproteine ^9,10. Dieses neuartige Glykosidhydrolase-Enzym kann die N-N'-Diacetylchitobiose-Anteile spalten, die in den N-Glykanen vorkommen^10,11. Die Aktivität von EndoBI-1 wird nicht durch die Kernfukosylierung und unterschiedliche Reaktionsbedingungen wie hohe Temperatur, pH-Wert, Reaktionszeit usw. beeinflusst ^3,11,12. Diese einzigartige Eigenschaft von Bifidobakterien-Glykosidhydrolasen stellt ein vielversprechendes Werkzeug für die Herstellung von N-Glykanen aus glykoproteinreichen Substraten wie Rinderkolostrum^{dar 13,14}.

Mehrere chemisch und enzymatisch entwickelte Deglykosylierungsmethoden wurden häufig eingesetzt, um N-Glykane und O-Glykane aus Glykoproteinen^{zu gewinnen 2,15}. Chemische Methoden zur Deglykosylierung von Glykoproteinen werden in der Glykobiologie aufgrund ihrer einfachen Anwendung, ihrer geringen Kosten und ihrer hohen Substratspezifität häufig eingesetzt¹⁶. Die gebräuchlichsten chemischen Deglykosylierungsmethoden sind die β-Eliminierung und die Hydrazination¹⁷. Unter diesen Methoden basiert die β-Elimination auf dem Prinzip der Spaltung von Glykanen von Glykoproteinen durch Exposition von Glykoproteinen unter alkalischen Bedingungen. Die freigesetzten Glykane können während des Prozesses aufgrund der β-Eliminationsreaktionen abgebaut werden, aber dieses Problem kann mit Reduktionsmitteln wie Natriumborhydrid (NaBH₄)18,19,20 verhindert werden. Es gibt unterschiedliche Einschränkungen bei der β-Eliminierungsmethode. Die Reduktionsmittel wandeln Glykane in Alditole um und verhindern, dass diese ein Fluorophor oder Chromophor binden. Daher wird es schwierig, die Glykanfreisetzung zu überwachen^19,20. Aufgrund des hohen Salzgehalts im Reinigungsschritt der Methode kann die Elution zu Probenverlusten^{führen 20}. Ein weiteres Verfahren zur Freisetzung von Glykan aus Glykoproteinen ist das Hydrazin-Verfahren, das auf dem Prinzip der Hydrolysereaktion nach Zugabe von wasserfreiem Hydrazin zum Glykoprotein basiert. Da sie es ermöglicht, die Isolierung von Glykanen durch Änderung der Reaktionsbedingungen wie der Temperatur zu kontrollieren, ist die Hydrazinationsmethode in der Glykobiologie weit verbreitet²¹. Die chemische Deglykosylierung kann auch unter Verwendung der wasserfreien Formulierung von Fluorwasserstoff und Trifluoressigsäure zusätzlich zu anderen chemischen Deglykosylierungsverfahren durchgeführt werden 16,22,23. Die enzymatische Freisetzung von N-Glykanen aus Glykoproteinen wird üblicherweise durch Peptidyl-N-Glykosidasen (PNGasen) durchgeführt, die im Allgemeinen N-Glykane freisetzen, unabhängig von ihrer Größe und Ladung 24,25,26,27. Ähnlich wie bei den chemischen Deglykosylierungsmethoden gibt es auch bei der enzymatischen Deglykosylierung unterschiedliche Herausforderungen. PNGasen zeigen Aktivität in Gegenwart mehrerer verwendeter Detergenzien, die die Zugänglichkeit der Enzyme zu den Glykanen erhöhen. Diese harten Behandlungen könnten jedoch die nativen Glykane und die verbleibenden Polypeptidstrukturen stören²⁸. PNGasen können die Glykane nicht spalten, wenn eine Fukose an N-Acetylglucosamin²⁹ gebunden ist. Verschiedene Endoglykosidasen wie F1, F2 und F3 zeigen eine höhere Aktivität auf den nativen Proteinen als PNGasen. Diese Endoglykosidasen haben eine geringe Aktivität auf den Glykanen mit mehreren Antennen, während das hitzebeständige neuartige EndoBI-1 in allen Arten von N-Glykanen wirksam ist 10,11,28. Hinsichtlich der Grenzen der derzeitigen Methoden liegt es auf der Hand, dass für eine effektive Glykanfreisetzung ohne Einschränkungen noch neuartige Enzyme erforderlich sind. Zu diesem Zweck ermöglichen Bifidobakterienarten, die über eine große genomische Insel verfügen, die für verschiedene Glykosidhydrolasen-Enzyme kodiert, die Spaltung von N-Glykanen aus Glykoproteinen ^30,31. In diesem Zusammenhang besteht das übergeordnete Ziel dieser Studie darin, neue Glykosidasen aus den verschiedenen Bifidobakterienarten zu entdecken. Um diese Enzyme rekombinant herzustellen, sollen verschiedene Fusionsmarkierungen ihre Produktion sowie ihre Aktivität verbessern.

Protokoll

1. Molekulare Klonierung von Bifidobakterien-Genen

1. PCR-Amplifikation von Zielgenen durch drei Vektor-Primer-Sets (N-His, C-His und N-His SUMO)
   1. Herstellung von 100 μM Stammprimer (Oligomeren) durch Zugabe von sterilem Wasser in den vom Unternehmen festgelegten Mengen. Bereiten Sie 10 μM neue Stämme aus diesen Stämmen vor, die für die PCR-Amplifikation der Zielgene verwendet werden sollen.
   2. Bereiten Sie die PCR-Mischung (Gesamtvolumen 50 μl) mit 25 μl Mastermix, 1 μl Forward- und Reverse-Primer mit 0,2 μM, 21 μl DNase/RNase-freiem destilliertem Wasser und 2 μL Template-DNA (Bakterienzellen) in den PCR-Röhrchen vor. Rühren Sie die Mischung vorsichtig um, indem Sie auf und ab pipettieren.
      HINWEIS: Der für die PCR verwendete Mastermix (Lucigen) enthält Taq-DNA-Polymerase mit hoher Reinheit und hoher Aktivität und kann bei höheren Temperaturen für eine zuverlässige Amplifikation von Templates bis zu 5 kb verwendet werden.
   3. Stellen Sie das PCR-Programm wie folgt ein: erster Denaturierungsschritt bei 95 °C für 5 min für die Freisetzung der genomischen DNA, dann 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 s, Glühen bei 60 °C für 30 s und Elongation bei 72 °C für 1 min und die abschließende Verlängerung bei 72 °C für 10 min.
   4. Überprüfen Sie die PCR-Produkte mit der Agarose-Gelelektrophorese-Methode mit einem Gel-Dokumentationssystem, nachdem sie 60 Minuten lang bei 100 V mit dem 1%igen Agarose-Gel betrieben wurden. Mischen Sie die PCR-Produkte und die DNA-Leiter mit dem Ladefarbstoff, indem Sie sie im Verhältnis 1:5 mischen (5 μl PCR-Produkt + 1 μl Ladefarbstoff und 5 μl 1 kb DNA-Leiter + 1 μl Ladefarbstoff), um das Gel zu laden (Abbildung 1).
   5. Messen Sie die DNA-Konzentrationen von PCR-Produkten mit einem Fluorometer vor dem molekularen Klonierungsschritt.
      HINWEIS: Die Konzentrationen von PCR-Produkten sollten in dem Bereich liegen, der für die molekulare Klonierung erforderlich ist (25-100 ng/μl).
2. Herstellung von Lysogeny Broth (LB)-Agarmedium für die molekulare Klonierung
   1. 12,5 g LB und 6 g Agarose in 500 mL dH₂O auflösen und das LB-Agarmedium autoklavieren (Sterilisation bei 121 °C für 20 min).
   2. 15 mg Kanamycin mit 1 ml dH₂O auflösen und bei -20 °C lagern.
   3. Nach dem Autoklavieren 1 ml Kanamycin in die Flasche mit den sterilen 500 ml LB-Agarmedium geben. Die Endkonzentration von Kanamycin beträgt 30 μg/ml. Gießen Sie 25 ml LB-Agar-Kanamycin-Medium in jede Platte im Laborschrank.
3. Hitzeschocktransformation von chemisch kompetenten E. coli-Zellen
   1. Geben Sie 1-3 μl (25 bis 100 ng) der PCR-Produkte für jeden Stamm in das Röhrchen, einschließlich 40 μl chemisch kompetenter E. coli-Zellen . Geben Sie dann 2 μl der Vektor-DNA in dasselbe Röhrchen. Rühren Sie vorsichtig mit der Pipettenspitze um und geben Sie die Mischungen in 15 mL Zentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt auf Eis aus. Pipettieren Sie zum Mischen nicht auf und ab, um Luftblasen und versehentliches Erwärmen der Zellen zu vermeiden.
   2. Inkubieren Sie die Röhrchen mit den zuständigen Zellen und der DNA 30 Minuten lang auf Eis. Hitzeschock auf die Mischung in einem 42 °C warmen Wasserbad für 45 s anwenden. Legen Sie diese Röhrchen sofort auf Eis und inkubieren Sie sie 2 min.
   3. Geben Sie 960 μl des Rückgewinnungsmediums, das für die schnelle Rückgewinnung von Zellen nach der molekularen Klonierung verwendet wird, zu den Zellen in den Röhrchen und inkubieren Sie die Röhrchen bei 250 U/min für 1 h bei 37 °C in einem Schüttelinkubator.
   4. Platte 100 μl transformierter Zellen auf LB-Agarplatten mit 30 μg/ml Kanamycin. Verwenden Sie nur chemisch kompetente E. coli-Zellen als Negativkontrolle.
      HINWEIS: Legen Sie die in Schritt 1.2.2 hergestellten LB-Agarplatten mit 30 μg/ml Kanamycin vor der Verwendung bei 37 °C in den Inkubator.
   5. Alle Platten werden über Nacht bei 37 °C unter Umgebungsatmosphäre inkubiert (Abbildung 2).
4. Aufbereitung des LB-Mediums für die Kolonie-PCR
   1. 7,5 g LB mit 300 mL dH₂O in einer Flasche auflösen und das LB-Medium autoklavieren (Sterilisation bei 121 °C für 20 min).
   2. 9 mg Kanamycin (30 μg/ml) mit 1 mL dH₂O auflösen und bei -20 °C erhitzen. Nach dem Autoklavieren 1 ml Kanamycin in die Flasche mit den sterilen 300 ml LB-Medium geben. Lagern Sie das flüssige Kulturmedium bis zur Verwendung bei +4 °C.
5. Screening von Transformanten mittels Kolonie-PCR
   1. Um zu bestätigen, dass alle Transformanten die rekombinanten Gene tragen, wählen Sie Kolonien nach dem Zufallsprinzip aus und amplifizieren Sie die Zielgene durch PCR mit den Sequenzierungsprimern, die mit dem Klonierungskit geliefert werden.
   2. Führen Sie alle Schritte auf Eis durch und kühlen Sie alle PCR-Röhrchen und 15-ml-Röhrchen vor der Verwendung vor.
   3. Übertragen Sie mit einer Pipettenspitze für jede Probe die Hälfte einer ausgewählten Kolonie in das PCR-Röhrchen. Entnehmen Sie eine weitere Hälfte der Kolonie mit der Pipettenspitze und geben Sie sie in das 15-ml-Röhrchen mit 5 ml LB+Kanamycin-Flüssigmedium (hergestellt in Schritt 1.4). Wirbeln Sie die 15-ml-Röhrchen vor und inkubieren Sie die Flüssigkulturen bei 250 U/min bei 37 °C über Nacht in einem Schüttelinkubator.
   4. Geben Sie 50 μl PCR-Reaktionsgemisch (25 μl Mastermix, 1 μl Forward-Primer, 1 μl Reverse-Primer, 23 μl DNase/RNase-freies destilliertes Wasser) in alle PCR-Röhrchen und dispergieren Sie die Zellen durch sanftes Auf- und Abpipettieren.
   5. Stellen Sie das PCR-Programm für 5 Minuten auf 95 °C für die Freisetzung genomischer DNA durch Lysieren von Bakterienzellen ein, insgesamt 40 Zyklen von 95 °C für 30 s für die anfängliche Denaturierung, 60 °C für 30 s für das Glühen, 72 °C für 1 min für die Elongation und 72 °C für 10 min für die abschließende Verlängerung.
   6. Überprüfen Sie die PCR-Produkte mit der Gelelektrophorese-Methode, nachdem sie 60 Minuten lang bei 100 V auf dem 1%igen Agarosegel betrieben wurden (Abbildung 3). Die Einzelheiten der DNA-Gelelektrophorese sind in Schritt 1.1.3 beschrieben.
   7. Bereiten Sie 15% Glycerin-Vorräte der erfolgreichen Transformanten vor. Geben Sie 500 μl 60%ige Glycerinbrühe in die Kryoröhrchen und fügen Sie 1.500 μl der Flüssigkultur der erfolgreichen Transformanten hinzu. Lagern Sie die vorbereiteten Vorräte bei -80 °C.

2. L-Rhamnose-Induktion der Proteinexpression

1. Bereiten Sie eine Vorkultur mit 1 l LB-Flüssigmedium vor, das 30 μg/ml Kanamycin enthält.
2. Geben Sie 8 mL des LB-Mediums in 50 mL Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie eines der Röhrchen als Negativkontrolle, das nur das flüssige Medium enthält. Für 20 % L-Rhamnose als Brühe 0,5 g L-Rhamnose mit 2,5 mL dH₂O auflösen und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
3. Geben Sie 10 μl der Bakterienstämme in die Zentrifugenröhrchen mit 8 mL flüssigem Medium. Schonend vorziehen und bei 37 °C für die Übernachtung im Schüttelinkubator inkubieren.
4. 250 ml flüssiges LB-Medium werden in einen sterilisierten 2-l-Erlenmeyerkolben gegossen.
5. 2,5 ml der Flüssigkultur über Nacht werden in einen 2-l-Kolben mit LB-Flüssigmedium in einem Verhältnis von 1:100 zwischen dem Kolben und dem Medium inokuliert und 4 Stunden lang im Schüttinkubator bei 37 °C und 150 U/min inkubiert.
6. Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) für die Bakterienzellen mit einem Spektralphotometer. Wenn die Zellen die optische Dichte von 0,5-0,6 erreichen, fügen Sie 2,5 ml 20 % Rhamnose (Endkonzentration beträgt 0,2 %) zu den 250 ml LB-Kultur hinzu und inkubieren bei 37 °C über Nacht bei 250 U/min im Schüttekubator.
7. Die Flüssigkultur in die 5 x 50 mL Röhrchen umfüllen, Proben 3724 x g für 15 min bei +4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen. Lagern Sie die Pellets bei -20 °C bis zum Reinigungsschritt.
   HINWEIS: Um die Proteinexpression mit SDS-PAGE zu bewerten, entnehmen Sie 1 ml einer nicht induzierten Kultur (bei Kulturen mit einer optischen Dichte von 600 nm von 0,5-0,6 ohne L-Rhamnose) als Kontrolle und 1 ml einer induzierten Kultur (nach Inkubation über Nacht) als induzierte Probe. Mikrozentrifugieren Sie alle Proben bei 12.000 x g für 1 min und resuspendieren Sie nicht induzierte und induzierte Proben mit 50 μl bzw. 100 μl SDS-PAGE-Ladepuffer.

3. Zelllyse von chemisch kompetenten E. coli-Zellen , die His-markierte Enzyme enthalten

1. Bereiten Sie den Lysepuffer pH 8,0 (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM Imidazol, 1 % SDS), den Äquilibrierungspuffer pH 7,4 (20 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol), den Waschpuffer pH 7,4 (20 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 25 mM Imidazol) und den Elutionspuffer pH 7,4 (20 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol).
2. Stellen Sie die 50-ml-Röhrchen mit den Zellpellets 15 Minuten lang bei -80 °C zum Einfrieren. Anschließend die Pellets bei -80 °C herausnehmen und bei Raumtemperatur auftauen.
3. Geben Sie 5 mL dH₂O zu den Pellets und lösen Sie sie durch Auf- und Abpipettieren auf. Bei 3724 x g für 15 min bei +4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
4. Für 50-ml-Kulturpellets werden 6.300 μl Lysepuffer und 63 μl EDTA-freier Stopp-Protease-Inhibitor-Cocktail (Verhältnis 1:100) in die Pellets gegeben und durch Auf- und Abpipettieren aufgelöst. 30 min auf Eis inkubieren, alle 10 min vortexen.
5. Stellen Sie den Impulsmodus des Ultraschallgeräts auf 10 s EIN und 59 s AUS und die Amplitude auf 37 % ein. Legen Sie das Röhrchen in ein Becherglas mit Eis und tauchen Sie die Sonde des Ultraschallgeräts in das Röhrchen.
   HINWEIS: Die Sonde sollte vollständig eingetaucht werden, ohne eine Seite des Rohrs zu berühren.
6. Nach dem Beschallungsprozess (6 Pulse für 10 s mit 1 min Abkühlung) zentrifugieren Sie die Proben bei 3.724 x g für 45 min bei +4 °C. Anschließend werden alle überstehenden Teile in einem Röhrchen gesammelt und bei 3.724 x g für 5 min bei +4 °C zentrifugiert.
7. Der Überstand wird in ein Röhrchen gegeben und 100 μl der Probe für die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) in Schritt 4.7 entnommen. Messen Sie die Proteinkonzentrationen der Proben mit einem Fluorometer.

4. Aufreinigung von His-markierten Enzymen nach der Batch-Methode

1. Geben Sie 1 ml Ni-NTA-Harz in ein Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei 700 x g. Entfernen Sie vorsichtig das Röhrchen und entsorgen Sie den gebildeten Überstand.
2. Geben Sie 2 mL (das doppelte Harzvolumen) des Äquilibrierungspuffers in das Röhrchen und mischen Sie gut, bis das Harz vollständig suspendiert ist. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 2 Minuten lang bei 700 x g und entfernen Sie den Puffer vorsichtig und entsorgen Sie ihn.
3. Mischen Sie den Proteinextrakt und den Äquilibrierungspuffer im Verhältnis 1:1 in einem Zentrifugenröhrchen. Geben Sie die Mischung in die Tube mit dem Harz und geben Sie sie 30 Minuten lang bei 150 U/min auf einen Shaker. Das Röhrchen wird 2 min lang bei 700 x g zentrifugiert und der Überstand wird verworfen.
4. Waschen Sie das Harz mit 5 mL Waschpuffer und zentrifugieren Sie das Röhrchen für 2 min bei 700 x g. Wiederholen Sie den Waschschritt, bis die Konzentration des Überstands auf den Ausgangswert abnimmt.
5. Geben Sie 1 ml Elutionspuffer in das Röhrchen, um gebundene His-markierte Proteine zu eluieren. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 2 min lang bei 700 x g. Speichern Sie den Überstand und entnehmen Sie 100 μL für die SDS-PAGE-Analyse in Schritt 4.7. Wiederholen Sie den Elutionsschritt dreimal. Messen Sie die Konzentrationen jedes Überstands mit einem Fluorometer.
6. Sammeln Sie alle Überstände in dem 10 kDa Dichtrohr und zentrifugieren Sie es 2 min lang bei 700 x g. Wiederholen Sie die Zentrifugation, bis das Volumen des Überstands auf 200 μl abnimmt, indem Sie gelegentlich auf und ab pipettieren. Lagern Sie die gereinigten Proteine bei -20 °C und entnehmen Sie 100 μl für die SDS-PAGE-Analyse in Schritt 4.7.
   HINWEIS: Die Proteinkonzentration sollte gemessen und, wenn die Konzentration niedrig ist, zentrifugiert werden, bis sie ansteigt.
7. SDS-PAGE-Analyse der gereinigten Proteine
   1. Bereiten Sie ein 4%iges Stapelgel (40 % Acrylamid/Bisacrylamid, 1 M Tris pH 6,8, 10 % SDS, 10 % Ammoniumpersulfat, TEMED, dH₂O) und ein 12 % auflösendes Gel (40 % Acrylamid/Bisacrylamid, 1 M Tris pH 8,8, 10 % SDS, 10 % Ammoniumpersulfat, TEMED,_{dH 2}O) vor.
   2. Mischen Sie die Probe mit 2x Laemmli Probenpuffer im Verhältnis 1:1 und inkubieren Sie bei 95 °C für 5 min, um die Proteine zu denaturieren.
      HINWEIS: Die Proteinkonzentration der Proben sollte vor dem Laden gemessen werden, und das beladene Volumen basiert auf ihrer Konzentration für eine gleichmäßige Beladung.
   3. Geben Sie 1x Laufpuffer in den Tank und laden Sie die Proben und die Proteinleiter in die Wells. Lassen Sie die Proteine zunächst mit 80 V laufen und erhöhen Sie den Strom auf 120 V, wenn die Proteine vom Stapelgel zum auflösenden Gel wechseln.
   4. Geben Sie das Gel in coomassie blue färbefarbe und geben Sie es für 30 Minuten in einen Shaker. Waschen Sie das Gel mit einer Entfärbungslösung (250 mL dH₂O + 50 mL Essigsäure (HOAc) + 200 mL Methanol) und nehmen Sie das Bild auf (Abbildung 4).

Ergebnisse

In dieser Studie wurden Glycosylhydrolase-Mitgliedsenzyme unterschiedlicher Herkunft ins Visier genommen. Es wurde angenommen, dass die gleichzeitige Anwendung verschiedener Enzyme mit unterschiedlichen Strukturen zu einer besseren Glykanfreisetzung führen könnte, da sie so entwickelt wurden, dass sie in verschiedenen Glykoproteinen aktiv sind. Die Liste der Zielgene und deren Herkunft ist in Tabelle 1 aufgeführt. Die Bakterienstämme wurden aus den belgischen koordin...

Diskussion

Die in vivo rekombinatorische Klonierungsstrategie, die für die molekulare Klonierung der Zielgene verwendet wird, liefert im Vergleich zu anderen traditionellen Klonierungsprotokollen schnelle und zuverlässige Ergebnisse. Auch wenn es viele bequeme Methoden zum molekularen Klonen gibt, hat die in diesem Artikel beschriebene Methode noch mehr Vorteile. Das In-vivo-Klonierungssystem benötigt im Gegensatz zu anderen Klonierungssystemen keine enzymatische Behandlung ode...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
EconoTaq PLUS 2X Master Mix	Lucigen	30035-1	Amplification of target genes (PCR)
DNase/RNase-free distilled water	Invitrogen	10977035	Amplification of target genes (PCR)
Safe-Red Loading Dye	abm	G108-R	DNA gel electrophoresis
1 kb Plus DNA Ladder	GoldBio	D011-500	DNA gel electrophoresis
Qubit protein assay kit	Invitrogen	Q33211	Measurement of DNA concentration
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	amresco	J106-2KG	Bacterial culture media
Agarose	Invitrogen	16500-500	Bacterial culture mediaet al.
Kanamycin Monosulfate	GoldBio	K-120-5	Antibiotic in bacterial culture media
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, N-His	Lucigen	49011-1	Cloning Kit
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, SUMO	Lucigen	49013-1	Cloning Kit
Expresso Rhamnose Cloning and Expression System Kit, C-His	Lucigen	49012-1	Cloning Kit
Glycerol Solution	Sigma-Aldrich	15524-1L-R	Preparation of glycerol stock
L-Rhamnose monohydrate	Sigma-Aldrich	83650	Induction of protein expression
2X Laemmli Sample Buffer	ClearBand	TGS10	SDS-Page analysis
SureCast 40% (w/v) Acrylamide	Invitrogen	HC2040	SDS-Page analysis
SureCast APS	Invitrogen	HC2005	SDS-Page analysis
SureCast TEMED	Invitrogen	HC2006	SDS-Page analysis
10X Running Buffer	ClearBand	TGS10	SDS-Page analysis
Triset al.	BioShop	TRS001.1	SDS-Page analysis and cell lysis
10% SDS	ClearBand	S100	SDS-Page analysis
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder	ThermoFisher	26619	SDS-Page analysis
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750	Cell lysis
NaCl	Sigma-Aldrich	31434-5Kg-R	Cell lysis
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous	amresco	0571-1Kg	Sodium phosphate buffer for cell lysis
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrateet al.	Sigma-Aldrich	04272-1Kg	Sodium phosphate buffer for cell lysis
10-kDa-cut-off centrifugal filter	Amicon®- MERCK	UFC9010	Purification of enzymes