التحقيق في السلوك الشبيه بالصداع النصفي باستخدام النفور من الضوء في الفئران

Mengya Wang; Bianca N. Mason; Levi P. Sowers; Adisa Kuburas; Brandon J. Rea; Andrew  F. Russo

doi:10.3791/62839

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

القوارض غير قادرة على الإبلاغ عن أعراض الصداع النصفي. هنا ، نصف نموذج اختبار يمكن التحكم فيه (فحوصات الضوء / الظلام والمجال المفتوح) لقياس النفور من الضوء ، وهو أحد أكثر الأعراض شيوعا وإزعاجا في المرضى الذين يعانون من الصداع النصفي.

Abstract

الصداع النصفي هو اضطراب عصبي معقد يتميز بالصداع والتشوهات الحسية ، مثل فرط الحساسية للضوء ، والتي لوحظت على أنها رهاب من الضوء. في حين أنه من المستحيل التأكد من أن الفأر يعاني من الصداع النصفي ، يمكن استخدام النفور من الضوء كبديل سلوكي لأعراض الصداع النصفي لرهاب الضوء. لاختبار النفور من الضوء ، نستخدم اختبار الضوء / الظلام لقياس الوقت الذي تختار الفئران إنفاقه بحرية في بيئة فاتحة أو مظلمة. تم تحسين الفحص من خلال إدخال تعديلين حاسمين: التعرض المسبق للغرفة قبل تشغيل إجراء الاختبار وإضاءة الغرفة القابلة للتعديل ، مما يسمح باستخدام مجموعة من شدة الضوء من 55 لوكس إلى 27000 لوكس. نظرا لأن اختيار قضاء المزيد من الوقت في الظلام يدل أيضا على القلق ، فإننا نستخدم أيضا اختبار القلق المستقل عن الضوء ، وهو فحص المجال المفتوح ، للتمييز بين القلق والسلوك الكاره للضوء. هنا ، نصف نموذج اختبار معدل لفحوصات المجال الفاتح / المظلم والمفتوح. يتم وصف تطبيق هذه الفحوصات للحقن داخل الصفاق للببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) في سلالتين من الفئران ولدراسات تحفيز الدماغ البصري الوراثي.

Introduction

الصداع النصفي هو مرض عصبي سائد ، يؤثر على ما يقرب من 17٪ من الأمريكيين ¹ وهو السبب الرئيسي الثاني للإعاقة على مستوى ^{العالم2,3}. يعاني المرضى من الصداع الذي يستمر من 4 إلى 72 ساعة مصحوبا بواحد على الأقل من الأعراض التالية: الغثيان و / أو القيء ، أو رهاب الضوء ورهاب الفونوفوبيا4. بدأت التطورات الحديثة في تطوير الأجسام المضادة للببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) والتي تمت الموافقة عليها الآن من إدارة الأغذية والعقاقير (FDA) حقبة جديدة لعلاج الصداع النصفي5,6,7. هذه الأجسام المضادة تمنع إما CGRP أو مستقبلاته وتمنع أعراض الصداع النصفي في حوالي 50٪ من مرضى الصداع ^{النصفي7}. خلال العام الماضي ، تمت الموافقة على اثنين من مضادات الجزيئات الصغيرة لمستقبل CGRP أيضا من إدارة الأغذية والعقاقير (FDA) للعلاج الفاشل للصداع النصفي ، وهناك اثنان آخران في طور ^{الإعداد8}. على الرغم من هذا التقدم العلاجي ، لا تزال الآليات التي تحدث بها نوبات الصداع النصفي بعيدة المنال. على سبيل المثال ، مواقع إجراء CGRP غير معروفة. تشير فعالية الأجسام المضادة العلاجية التي لا تعبر بشكل ملحوظ حاجز الدم في الدماغ إلى أن CGRP يعمل في المواقع الطرفية ، مثل السحايا و / أو العقد ثلاثية التوائم. ومع ذلك ، لا يمكننا استبعاد الإجراءات المركزية في الأعضاء التحايل ، والتي تفتقر إلى حاجز دموي في ^{الدماغ9}. على الأقل بالنسبة لرهاب الضوء، نعتقد أن هذا أقل احتمالا بالنظر إلى نتائجنا مع النفور من الضوء باستخدام الفئران المعدلة وراثيا من النستين/hRAMP1 التي يتم فيها التعبير عن hRAMP1 في الأنسجة ^{العصبية10}. سيوفر فهم آليات الفيزيولوجيا المرضية للصداع النصفي سبلا جديدة لتطوير علاجات الصداع النصفي.

النماذج الحيوانية قبل السريرية حاسمة لفهم آليات المرض وتطوير أدوية جديدة. ومع ذلك ، فإن تقييم الصداع النصفي في الحيوانات يمثل تحديا لأن الحيوانات لا يمكنها الإبلاغ شفهيا عن أحاسيسها بالألم. بالنظر إلى حقيقة أن 80-90٪ من مرضى الصداع النصفي يظهرون رهاب ^الضوء11 ، يعتبر النفور من الضوء مؤشرا على الصداع النصفي في النماذج الحيوانية. أدى ذلك إلى الحاجة إلى تطوير فحص لتقييم النفور من الضوء في الفئران.

يحتوي فحص الضوء / الظلام على منطقة ضوء ومنطقة مظلمة. يستخدم على نطاق واسع لقياس القلق لدى الفئران بناء على استكشافها التلقائي للبيئات الجديدة التي يتم مواجهتها من خلال نفورها الفطري من ^الضوء12. بعض الدراسات تحدد 1/3 من الغرفة كمنطقة مظلمة ، في حين أن البعض الآخر يحدد 1/2 من الغرفة كمنطقة مظلمة. غالبا ما يستخدم الإعداد السابق للكشف عن ^القلق13. على الرغم من أننا اخترنا في البداية غرف الضوء / الظلام متساوية الحجم ، إلا أننا لم نقارن بين الحجمين النسبيين. يمكننا التعليق على أن الحجم الإجمالي لكلا المجلسين ليس عاملا رئيسيا لأن مربع الاختبار الأولي14 كان أكبر بكثير من الجهاز ^{اللاحق15}، ومع ذلك كانت النتائج هي نفسها في الأساس.

كان هناك تعديلان حاسمان على هذا الفحص الضوئي / المظلم لتقييم النفور من الضوء هما: حالة الاختبار وشدة الضوء (الشكل 1). أولا، تتعرض الفئران مسبقا للحجرة الفاتحة/المظلمة لتقليل محرك الأقراص ^{الاستكشافي16} (الشكل 1A). تعتمد ضرورة وأوقات التعرض المسبق على سلالات الفئران ونماذجها. عادة ما تتطلب الفئران من النوع البري C57BL/6J تعرضين مسبقين10، في حين أن التعرض المسبق الوحيد لفئران CD1 ^يكفي17. وبهذه الطريقة ، يمكن الكشف عن السلوك المتردد للضوء في هاتين السلالتين من الماوس. ثانيا، تم تكييف إضاءة الغرفة لتشمل مجموعة قابلة للتعديل من شدة الضوء من الخافتة (55 لوكس) إلى الساطعة (27000 لوكس) حيث يمكن مقارنة 55 لوكس بيوم ملبد بالغيوم الداكن، و27000 لوكس يمكن مقارنتها بيوم مشمس مشرق في ^الظل10. لقد وجدنا أن شدة الضوء المطلوبة تختلف باختلاف السلالة والنموذج الوراثي. لهذا السبب ، يجب على الأفراد أولا تقييم الحد الأدنى من شدة الضوء لنموذجهم التجريبي.

حتى مع هذه التعديلات على الفحص ، والتي يمكن أن تكشف عن نمط ظاهري متجنب للضوء ، من الضروري اختبار السلوك الشبيه بالقلق للتمييز بين النفور من الضوء بسبب الضوء وحده مقابل القلق. فحص المجال المفتوح هو طريقة تقليدية لقياس القلق بناء على الاستكشاف التلقائي للبيئات الجديدة. وهو يختلف عن الفحص الفاتح / المظلم في أن محرك الأقراص الاستكشافي يقابله النفور الفطري من المساحات المفتوحة غير المحمية. كل من مركز وحواف الغرفة في الضوء ، وبالتالي فإن فحص المجال المفتوح هو فحص قلق مستقل عن الضوء. وبالتالي ، فإن الجمع بين مقايسات الضوء / الظلام والمجال المفتوح يمكننا من التمييز بين النفور من الضوء بسبب تجنب الضوء مقابل الزيادة الإجمالية في القلق.

CGRP هو نيوروبتيد متعدد الوظائف ينظم توسع الأوعية ، و nociception ، والالتهابات ¹⁸. يتم التعبير عنه على نطاق واسع في الجهاز العصبي المحيطي والمركزي. يلعب دورا مهما في الفيزيولوجيا المرضية للصداع ^{النصفي18}. ومع ذلك ، فإن الآلية الكامنة وراء عمل CGRP في الصداع النصفي غير واضحة. من خلال استخدام مقايسات المجال الفاتح / المظلم والمفتوح مع نموذج الاختبار المعدل هذا ، تمكنا من تحديد السلوك المتردد للضوء في الفئران بعد إدارة CGRP الطرفية 10,16 (الشكل 2) والمركزية14,15,16,19. بالإضافة إلى الببتيدات العصبية ، فإن تحديد مناطق الدماغ المشاركة في النفور من الضوء مهم أيضا في فهم الفيزيولوجيا المرضية للصداع النصفي. نوى المهاد الخلفية هي منطقة دماغية تكاملية لمعالجة الألم ^{والضوء19}، ويتم تنشيط المهاد أثناء الصداع ^{النصفي20}. وهكذا ، استهدفنا نوى المهاد الخلفية عن طريق حقن الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) الذي يحتوي على قناة رودوبسين-2 (ChR2) أو eYFP في هذه المنطقة. من خلال الجمع بين هذا النهج البصري الوراثي مع هذين الاختبارين ، أثبتنا أن التحفيز البصري للخلايا العصبية المعبرة عن ChR2 في النوى المهادية الخلفية أدى إلى النفور من ^الضوء19 (الشكل 3). في هذه التجربة ، نظرا للتأثير الدراماتيكي على النفور من الضوء المستحضر في هذه الفئران التي تم التلاعب بها بصريا ، تم تخطي التعرض المسبق للغرفة.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات بجامعة أيوا وتم تنفيذها وفقا للمعايير التي وضعتها المعاهد الوطنية للصحة.

1. فحص الضوء / الظلام

إعداد جهاز غرفة الضوء/الظلام (انظر جدول المواد). جميع المعدات في هذا القسم متاحة تجاريا.
1. على الرف، ضع المقصورة المخففة للصوت (الداخلية: 59.7 × 38 × 35.6 سم بالعرض × الارتفاع × العمق) التي تحتوي على درج قابل للسحب لسهولة الوصول إلى الغرفة والإدراج الداكن.
2. قم بتوصيل مصدر طاقة التيار المستمر ومصدر الطاقة المنظم بواسطة التيار المستمر بالحجرة المخففة للصوت.
3. ضع حجرة الحقل المفتوح الشفافة غير الملحومة (27.31 × 27.31 × 20.32 سم بالطول × العرض × الارتفاع) على درج الحجرة القابل للسحب.
4. ضع الحشوة البلاستيكية الداكنة السوداء الشفافة بالأشعة تحت الحمراء (28.7 × 15 × 20.6 سم في الطول × العرض × الارتفاع) في غرفة الحقل المفتوحة. تأكد من تقسيم الغرفة إلى منطقتين متساويتين في الحجم: منطقة مظلمة ومنطقة ضوء.
5. قم بتوصيل ثلاث مجموعات من صفائف الأشعة تحت الحمراء ذات 16 شعاعا على محاور X وY وZ في غرفة المجال المفتوح بوحدة تحكم IR USB عبر الكابلات.
6. قم بتوصيل وحدة تحكم IR USB بجهاز كمبيوتر.
7. قم بتثبيت برنامج التتبع على الكمبيوتر الذي يمكنه تسجيل وجمع موقع الماوس ونشاطه.
8. لإعداد لوحة الضوء، قم أولا بإزالة لوحة ضوء الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) (27.70 × 27.70 سم بالطول × العرض؛ 360 مصباح LED، لون متوازن في ضوء النهار، 5600K، انتشار شعاع الفيضان 60 درجة) من هيكلها الأصلي.
9. قم بتجميع لوحة الإضاءة باستخدام برنامج تشغيل LED والمشتت الحراري ومصدر الطاقة. يمكن توصيل لوحات إضاءة LED متعددة بمصدر طاقة واحد ومشتت حراري وسائق LED لتحقيق تحكم موحد في لوحة الضوء.
10. قم ببناء منصة أكريليك مخصصة (29.77 × 27.70 × 8.10 سم في الطول × العرض × الارتفاع) تتكون من 7 أرفف متطابقة على فترات 0.53 سم (الشكل 1B). قم بتثبيت رف الأكريليك المخصص بشكل دائم على السقف داخل المقصورة فوق الغرفة.
11. أدخل لوحة إضاءة LED في الفتحة الواقعة بين الرفوفين السفليين. اضبط لوحة الضوء على ارتفاعات مختلفة (الشكل 1B ، C) ، إذا لزم الأمر (على سبيل المثال ، إذا كنت تستخدم الفئران البصرية الوراثية. وتناقش التفاصيل في القسم 3).
12. قم بتشغيل المشتت الحراري وبرنامج تشغيل LED ومصدر الطاقة. تأكد من أن سائق LED يمكنه إملاء شدة ضوء LED عن طريق قياس شدة الضوء على أرضية الغرفة وتأكد من أن الأرضية مضاءة بالتساوي.
إجراء الاختبار السلوكي
ملاحظة: يتم وضع الفئران في دورة ضوئية مدتها 12 ساعة. يتم إجراء جميع التجارب السلوكية خلال دورة الضوء. يتم استخدام الفئران ، بما في ذلك كل من الذكور والإناث ، الذين تتراوح أعمارهم بين 10-20 أسبوعا. في هذا البروتوكول ، تواجه الفئران الساذجة من النوع البري CD1 و C57BL / 6J تعرضين مسبقين للغرفة الفاتحة / المظلمة يليهما التعرض مع العلاج والتعرض بعد العلاج. هناك فاصل زمني مدته ثلاثة أيام بين كل تعرض للسماح للفئران بالتعافي (اليوم 1 و 4 و 7 و 10 كما هو موضح أدناه والشكل 1 أ). ومع ذلك ، لا تتطلب الفئران CD1 التعرض المسبق ^الثاني ويمكن اختبارها في الضوء الخافت.
1. في اليوم الأول (المعالجة المسبقة 1)، قم بتشغيل جهاز فحص الضوء/الظلام واضبط شدة الضوء على 27000 لوكس.
2. افتح برنامج التتبع وقم بإعداد بروتوكول جديد. في إعداد البروتوكول الجديد ، اضبط المدة على 30 دقيقة. في إعداد تحليل جديد ، قم بتعيين حزم البيانات حسب المدة إلى 300 ثانية.
3. في إعداد منطقة جديدة ، اختر مناطق محددة مسبقا. اختر 2 ثم أفقي. تحقق مما إذا كانت الغرفة مقسمة إلى منطقتين متساويتين في الحجم أفقيا للتسجيل.
4. اعتاد الفئران على غرفة الاختبار لمدة 1 ساعة قبل الاختبار. أثناء التعود ، حافظ على إضاءة الغرفة حتى لا تعطل إيقاع الساعة البيولوجية للماوس. تأكد من تشغيل جميع المعدات الخاصة بفحص الضوء / الظلام ، مما يسمح للفئران بالتأقلم الكامل مع بيئة غرفة الاختبار.
5. حدد الحصول على البيانات. أدخل معرفات الماوس. بدء تشغيل البروتوكول.
6. اسحب الدرج خارج الحجرة المخففة للصوت للوصول إلى الغرفة الفاتحة/المظلمة والإدراج الداكن. التقط الماوس برفق من قاعدة الذيل ، وضعه في المنطقة الخفيفة من الغرفة ، وادفع الدرج داخل الحجرة. تأكد من أن البرنامج يكتشف الماوس على الفور ويبدأ في تسجيل النشاط.
7. انتظر حتى يتوقف التسجيل تلقائيا بعد 30 دقيقة. أعد الماوس إلى قفصه المنزلي.
8. قم بتنظيف الغرفة والإدراج الداكن باستخدام مناديل مبيدة للجراثيم ذات رائحة الكحول تحتوي على 55.0٪ كحول الأيزوبروبيل ، و 0.25٪ ألكيل C12-18 ثنائي ميثيل إيثيل بنزيل الأمونيوم ، و 0.25٪ ألكيل C12-18 ثنائي ميثيل بنزيل كلوريد الأمونيوم كمكونات نشطة مضادة للميكروبات للقضاء على أي إشارات شمية تركها الفأر السابق.
9. في اليوم 4 (المعالجة المسبقة 2)، كرر الخطوات من 1.2.1 إلى 1.2.8.
10. في اليوم 7 (يوم العلاج)، كرر الخطوتين 1.2.1 و1.2.4. بعد التعود ، قم بإدارة CGRP (0.1 مجم / كجم ، 10 ميكرولتر / جم بناء على وزن جسم الفأر ، الحقن داخل الصفاق (i.p)) ، إمالة رأس الماوس إلى الأمام والحقن في الربع الأيمن السفلي. أعد الماوس إلى القفص المنزلي.
11. بعد 30 دقيقة، ابدأ تشغيل البروتوكول وقم بتشغيل الماوس في الغرفة الفاتحة/المظلمة كما هو مذكور في الخطوات من 1.2.5 إلى 1.2.7. يمكن تقصير وقت الشفاء في الأقفاص المنزلية بعد الحقن أو تطويله اعتمادا على ^{العلاج21}.
12. قم بتنظيف الغرفة والإدراج الداكن كما هو موضح في الخطوة 1.2.8.
13. في اليوم 10 (يوم ما بعد العلاج)، كرر الخطوات من 1.2.1 إلى 1.2.8. يمكن إيقاف التجربة مؤقتا عند الخطوة 1.2.13 قبل بدء فحص الحقل المفتوح.

2. فحص الحقل المفتوح

إعداد الجهاز
1. إعداد غرفة المجال المفتوح: استخدم نفس الحجرة المخففة للصوت وحجرة المجال المفتوحة المستخدمة في فحص الضوء / الظلام ، دون استخدام الإدراج الداكن.
2. إعداد لوحة الضوء: استخدم نفس الإعداد المستخدم في فحص الضوء/الظلام. تأكد من أن شدة الضوء هي نفسها المستخدمة في فحص الضوء / الظلام.
إجراء الاختبار السلوكي
1. قم بتشغيل الجهاز. اضبط شدة الضوء على 27,000 لوكس.
2. افتح برنامج التتبع.
3. قم بإعداد بروتوكول جديد، وهو نفس البروتوكول المستخدم في فحص الضوء/الظلام باستثناء إعدادات المنطقة الجديدة . اختر 1 متبوعا بالمركز في إعدادات المنطقة الجديدة . اضبط المحيط على بعد 3.97 سم من المحيط والمركز على 19.05 × 19.05 سم.
4. اعتاد الفئران على الدخول إلى غرفة الاختبار كما هو موضح في الخطوة 1.2.4.
5. إدارة CGRP (0.1 ملغم / كغم ، 10 ميكرولتر / غرام بناء على وزن جسم الفأر ، i.p.) ، إمالة رأس الماوس إلى الأمام والحقن في الربع الأيمن السفلي. أعد الماوس إلى القفص المنزلي.
6. بعد 30 دقيقة، ابدأ تشغيل البروتوكول. اسحب الدرج القابل للسحب للخارج خارج الحجرة المخففة للصوت وضع الماوس برفق في منتصف حجرة الحقل المفتوحة. ادفع الدرج داخل الحجرة.
7. تتبع السلوك لمدة 30 دقيقة. ثم إعادة الفئران إلى أقفاصها المنزلية.
8. قم بتنظيف الجهاز كما هو موضح في الخطوة 1.2.8.

3. فحص الضوء / الظلام المعدل للفئران البصرية الجينية

إعداد الجهاز
1. قم بإجراء تعديلين على الإدراج الداكن.
  1. عدل فتحة الإدراج الداكن إلى 5.08 × 5.08 سم (العرض × الارتفاع) باستخدام شق صغير 0.95 × 10.16 سم (عرض × ارتفاع) بين الجزء العلوي وفتحة الإدراج الداكن (الشكل 1D أعلى اليسار).
    ملاحظة: يسمح هذا التعديل للماوس بالانتقال إلى المنطقة المظلمة دون صعوبة عندما يتم توصيل قنية الألياف البصرية الموجودة على رأس الماوس بسلك التصحيح.
  2. قم بتمديد الجزء العلوي من الإدراج الداكن فوق منطقة الضوء كشرفة مثلثة الشكل (H = 6.5 سم) (الشكل 1D أعلى اليمين وأسفل اليسار). قم بقص ثقب دائري (D = 1.7 سم) من الشرفة وأدخل حاملا في الفتحة لوضع وتثبيت المفصل الدوار ، الذي يربط بين الليزر وأسلاك تصحيح الألياف البصرية (الشكل 1D أعلى اليسار وأسفل اليسار).
    ملاحظة: تؤدي التعديلات إلى تغيير طفيف في شدة الضوء التي تصل إلى أرضية المنطقة المظلمة (17 لوكس مع تعديلات مقابل 14 لوكس بدون تعديلات، تقاس في الزاوية الخلفية اليمنى من المنطقة المظلمة تحت 27000 لوكس).
2. أدخل المفصل الدوار في الحامل الموجود على الإدراج الداكن.
3. قم بتوصيل سلك تصحيح الألياف البصرية مقاس 30.5 سم بالمفصل الدوار. تأكد من أن المفصل الدوار يمكن أن يدور بسلاسة بحيث يمكن أن يدور سلك التصحيح دون صعوبة أثناء عبور الماوس للغرفة.
4. بالنسبة لبقية الإعداد، استخدم نفس إعداد الجهاز كما هو مستخدم في القسم 1 (الفحص الفاتح/الداكن).
إجراء الاختبار السلوكي
ملاحظة: على عكس الفئران من النوع البري، لا تتلقى الفئران البصرية الجينية التعرض المسبق (المعالجة المسبقة 1 و 2).
1. في يوم الاختبار، أدخل لوحة إضاءة LED في ثاني أدنى فتحة (28.23 سم من أرضية الحدبة) لإتاحة مساحة لتوصيل سلك التصحيح. قم بتشغيل جهاز فحص الضوء / الظلام واضبط شدة الضوء على 55 لوكس.
2. استخدم نفس إعداد البروتوكول كما هو الحال في 1.2.2 و 1.2.3 باستثناء أنه تم تعيين حزم البيانات حسب المدة إلى 60 ثانية في إعداد التحليل الجديد لتكون متوافقة مع بروتوكول تحفيز الليزر في الخطوة 3.2.3.
3. قم بتشغيل زر طاقة الليزر. اضبط وحدة التحكم في نبض الليزر للتحفيز لمدة 1 دقيقة تليها 1 دقيقة دون تحفيز أكثر من 30 دقيقة.
4. اعتاد الفئران على الدخول إلى غرفة الاختبار مع إضاءة الضوء لمدة 1 ساعة قبل الاختبار.
5. بدء تشغيل البروتوكول. اسحب الدرج القابل للسحب للخارج خارج الحجرة المخففة للصوت للوصول إلى الغرفة الفاتحة/المظلمة والإدراج الداكن.
6. قم بتقييد الماوس بلطف وقم بإقران قنية الألياف البصرية على رأس الماوس بسلك تصحيح الألياف البصرية عبر غلاف التزاوج (الشكل 1D أسفل اليمين). ضع الماوس برفق في منطقة الإضاءة وادفع الدرج داخل الحجرة. تأكد من أن البروتوكول سيبدأ في تسجيل سلوك الماوس تلقائيا.
7. في 1 دقيقة، قم بتشغيل وحدة التحكم في النبض ثم قم بتشغيل المفتاح الآمن من الفشل إلى ON. تأكد من أن التحفيز بالليزر لمنطقة الدماغ المستهدفة يحدث كل دقيقة.
8. بعد 30 دقيقة عندما يتوقف البروتوكول تلقائيا، قم بتشغيل المفتاح الآمن من الفشل إلى إيقاف التشغيل. ثم قم بإيقاف تشغيل وحدة التحكم في النبض.
9. افصل الماوس وسلك تصحيح الألياف البصرية. أعد الماوس إلى القفص المنزلي.
10. قم بتنظيف الغرفة والإدراج الداكن كما هو موضح في الخطوة 1.2.8.

4. فحص المجال المفتوح المعدل للفئران البصرية الجينية

إعداد الجهاز
1. قم بتثبيت المفصل الدوار فوق الغرفة باستخدام حامل ومشبك (الشكل 1E).
2. قم بتوصيل سلك تصحيح الألياف البصرية بطول 50 سم بالمفصل الدوار. تحقق مما إذا كان المفصل الدوار يمكن أن يدور بسلاسة.
3. اضبط المفصل الدوار على الارتفاع المناسب على الحامل: تأكد من أن سلك تصحيح الألياف البصرية لا يمكنه الوصول إلا إلى كل ركن من أركان الغرفة ، مما سيساعد على تجنب أي تداخل مع حركة الماوس.
4. بالنسبة لبقية الإعداد، استخدم نفس إعداد الجهاز المستخدم في القسم 1 (الفحص الفاتح/الداكن)، ولكن بدون الإدراج الداكن.
إجراء الاختبار السلوكي
1. قم بتشغيل جهاز فحص الضوء / الظلام واضبط شدة الضوء على 55 لوكس.
2. استخدم نفس إعداد البروتوكول كما هو الحال في فحص الضوء/الظلام المعدل (القسم 3) باستثناء إعدادات المنطقة الجديدة . اختر 1 التالية حسب المركز في إعدادات المنطقة الجديدة . اضبط المحيط على بعد 3.97 سم من المحيط والمركز على 19.05 × 19.05 سم.
3. قم بتشغيل زر طاقة الليزر. اضبط وحدة التحكم في نبض الليزر للتحفيز لمدة 1 دقيقة تليها 1 دقيقة دون تحفيز أكثر من 30 دقيقة.
4. إجراء التعود وبقية الاختبار كما هو موضح في الخطوات من 3-2-4 إلى 3-2-10 باستثناء تغييرين على الخطوة 3-2-6: ضع الماوس برفق في منتصف الحجرة بدلا من منطقة الضوء؛ احتفظ بالدرج القابل للسحب خارج الحجرة بسبب توصيل سلك التصحيح برأس الماوس.

النتائج

تم تصميم نموذج الاختبار السلوكي هذا لاختبار السلوك المتردد للضوء. يمكن إجراؤه باستخدام كل من الفئران البرية الساذجة والفئران البصرية الجينية للتحقيق في النفور من الضوء في الوقت الفعلي أثناء تحفيز مجموعة الخلايا العصبية المستهدفة.

تم استخدام هذا الإجراء لدراسة تأثير علاج ...

Discussion

يستخدم فحص الضوء / الظلام على نطاق واسع لتقييم السلوك الشبيه بالقلق ¹². يعتمد الفحص على النفور الفطري للفئران من الضوء ودافعها للاستكشاف عند وضعها في بيئة جديدة (منطقة الضوء). ومع ذلك ، كما نذكر هنا ، يمكن أيضا استخدام هذا الفحص لتقييم السلوك المتردد للضوء أيضا.

و?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإبلاغ عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منح من NIH NS R01 NS075599 و RF1 NS113839. لا تمثل المحتويات وجهات نظر VA أو حكومة الولايات المتحدة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Activity monitor	Med Assoc. Inc		Software tracking mouse behavior
Customized acrylic shelf			For adjusting the height of the LED panel
Dark box insert	Med Assoc. Inc	ENV-511
DC power supply	Med Assoc. Inc	SG-500T
DC regulated power supply	Med Assoc. Inc	SG-506
Fiber-optic cannula	Doric	MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT
Germicidal disposable wipes	Sani-Cloth	SKU # Q55172
Heat Sink	Wakefield	490-6K	Connecting to LED panel
IR controller power cable	Med Assoc. Inc	SG-520USB-1
IR USB controller	Med Assoc. Inc	ENV-520USB
Mating sleeve	Doric	SLEEVE_ZR_1.25
Modified LED light panel	Genaray Spectro	SP-E-360D	Daylight-balanced color (5600K)
Power supply	MEAN WELL USA	SP-320-12	Connecting to LED panel
Seamless open field chamber	Med Assoc. Inc	ENV-510S
Sound-attenuating cubicle	Med Assoc. Inc	ENV-022MD-027
Stand and clamp
Three 16-beam IR arrays	Med Assoc. Inc	ENV-256

References

Loder, S., Sheikh, H. U., Loder, E. The prevalence, burden, and treatment of severe, frequent, and migraine headaches in US minority populations: statistics from National Survey studies. Headache. 55 (2), 214-228 (2015).
Collaborators, G. B. D. H. Global, regional, and national burden of migraine and tension-type headache, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 954-976 (2018).
GBD 2017 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
international headache society. Headache classification committee of the international headache society (IHS). The international classification of headache disorders, 3rd edition. Cephalalgia. 38 (1), 1 (2018).
Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K., Krause, D. N. CGRP as the target of new migraine therapies - successful translation from bench to clinic. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 338-350 (2018).
Rapoport, A. M., McAllister, P. The headache pipeline: Excitement and uncertainty. Headache. 60 (1), 190-199 (2020).
Maasumi, K., Michael, R. L., Rapoport, A. M. CGRP and Migraine: The role of blocking calcitonin gene-related peptide ligand and receptor in the management of Migraine. Drugs. 78 (9), 913-928 (2018).
Caronna, E., Starling, A. J. Update on calcitonin gene-related peptide antagonism in the treatment of migraine. Neurologic Clinics. 39 (1), 1-19 (2021).
Eftekhari, S., Edvinsson, L. Possible sites of action of the new calcitonin gene-related peptide receptor antagonists. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 3 (6), 369-378 (2010).
Mason, B. N., et al. Induction of migraine-like photophobic behavior in mice by both peripheral and central cgrp mechanisms. Journal of Neuroscience. 37 (1), 204-216 (2017).
Russell, M. B., Rasmussen, B. K., Fenger, K., Olesen, J. Migraine without aura and migraine with aura are distinct clinical entities: A study of four hundred and eighty-four male and female migraineurs from the general population. Cephalalgia. 16 (4), 239-245 (1996).
Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 9 (1), 37-44 (1985).
Crawley, J., Goodwin, F. K. Preliminary report of a simple animal behavior model for the anxiolytic effects of benzodiazepines. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 13 (2), 167-170 (1980).
Recober, A., et al. Role of calcitonin gene-related peptide in light-aversive behavior: implications for migraine. Journal of Neuroscience. 29 (27), 8798-8804 (2009).
Recober, A., Kaiser, E. A., Kuburas, A., Russo, A. F. Induction of multiple photophobic behaviors in a transgenic mouse sensitized to CGRP. Neuropharmacology. 58 (1), 156-165 (2010).
Kaiser, E. A., Kuburas, A., Recober, A., Russo, A. F. Modulation of CGRP-induced light aversion in wild-type mice by a 5-HT(1B/D) agonist. Journal of Neuroscience. 32 (44), 15439-15449 (2012).
Kuburas, A., et al. PACAP induces light aversion in mice by an inheritable mechanism independent of CGRP. Journal of Neuroscience. , (2021).
Russo, A. F. Calcitonin gene-related peptide (CGRP): a new target for migraine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 533-552 (2015).
Sowers, L. P., et al. Stimulation of Posterior Thalamic Nuclei Induces Photophobic Behavior in Mice. Headache. 60 (9), 1961-1981 (2020).
Afridi, S. K., et al. A positron emission tomographic study in spontaneous migraine. Archives of Neurology. 62 (8), 1270-1275 (2005).
Mason, B. N., et al. Vascular actions of peripheral CGRP in migraine-like photophobia in mice. Cephalalgia. 40 (14), 1585-1604 (2020).
Guo, S., Vollesen, A. L. H., Olesen, J., Ashina, M. Premonitory and nonheadache symptoms induced by CGRP and PACAP38 in patients with migraine. Pain. 157 (12), 2773-2781 (2016).
Christensen, C. E., et al. Migraine induction with calcitonin gene-related peptide in patients from erenumab trials. Journal of Headache and Pain. 19 (1), 105 (2018).
Younis, S., et al. Investigation of distinct molecular pathways in migraine induction using calcitonin gene-related peptide and sildenafil. Cephalalgia. 39 (14), 1776-1788 (2019).
Asghar, M. S., et al. Evidence for a vascular factor in migraine. Annals of Neurology. 69 (4), 635-645 (2011).
Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Scientific Reports. 10 (1), 3509 (2020).
Campos, A. C., Fogaca, M. V., Aguiar, D. C., Guimaraes, F. S. Animal models of anxiety disorders and stress. Revista Brasileira De Psiquiatria. 35, 101-111 (2013).
Kuburas, A., Thompson, S., Artemyev, N. O., Kardon, R. H., Russo, A. F. Photophobia and abnormally sustained pupil responses in a mouse model of bradyopsia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (10), 6878-6885 (2014).
Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
Cernuda-Morollon, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
Chanda, M. L., et al. Behavioral evidence for photophobia and stress-related ipsilateral head pain in transgenic Cacna1a mutant mice. Pain. 154 (8), 1254-1262 (2013).
Mahmoudi, J., et al. Cerebrolysin attenuates hyperalgesia, photophobia, and neuroinflammation in a nitroglycerin-induced migraine model in rats. Brain Research Bulletin. 140, 197-204 (2018).
Farajdokht, F., Babri, S., Karimi, P., Mohaddes, G. Ghrelin attenuates hyperalgesia and light aversion-induced by nitroglycerin in male rats. Neuroscience Letters. 630, 30-37 (2016).
Jacob, W., et al. Endocannabinoids render exploratory behaviour largely independent of the test aversiveness: Role of glutamatergic transmission. Genes, Brain, and Behavior. 8 (7), 685-698 (2009).
Thiels, E., Hoffman, E. K., Gorin, M. B. A reliable behavioral assay for the assessment of sustained photophobia in mice. Current Eye Research. 33 (5), 483-491 (2008).
Ramachandran, R., et al. Role of Toll-like receptor 4 signaling in mast cell-mediated migraine pain pathway. Molecular Pain. 15, 1744806919867842 (2019).
Marek, V., et al. Implication of Melanopsin and Trigeminal Neural Pathways in Blue Light Photosensitivity in vivo. Frontiers in Neuroscience. 13, 497 (2019).
Christensen, S. L. T., Petersen, S., Sorensen, D. B., Olesena, J., Jansen-Olesen, I. Infusion of low dose glyceryl trinitrate has no consistent effect on burrowing behavior, running wheel activity and light sensitivity in female rats. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 80, 43-50 (2016).
De Vera Mudry, M. C., Kronenberg, S., Komatsu, S., Aguirre, G. D. Blinded by the light: retinal phototoxicity in the context of safety studies. Toxicologic Pathology. 41 (6), 813-825 (2013).
White, D. A., Fritz, J. J., Hauswirth, W. W., Kaushal, S., Lewin, A. S. Increased sensitivity to light-induced damage in a mouse model of autosomal dominant retinal disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (5), 1942-1951 (2007).
Song, D., et al. Retinal pre-conditioning by CD59a knockout protects against light-induced photoreceptor degeneration. PloS One. 11 (11), 0166348 (2016).
Matynia, A., et al. Light aversion and corneal mechanical sensitivity are altered by intrinscally photosensitive retinal ganglion cells in a mouse model of corneal surface damage. Experimental Eye Research. 137, 57-62 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: