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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Nagetiere sind nicht in der Lage, Migränesymptome zu melden. Hier beschreiben wir ein überschaubares Testparadigma (Hell/Dunkel- und Freifeldassays) zur Messung der Lichtaversion, eines der häufigsten und lästigsten Symptome bei Patienten mit Migräne.

Zusammenfassung

Migräne ist eine komplexe neurologische Erkrankung, die durch Kopfschmerzen und sensorische Anomalien wie Überempfindlichkeit gegen Licht gekennzeichnet ist und als Photophobie beobachtet wird. Während es unmöglich ist zu bestätigen, dass eine Maus Migräne hat, kann Lichtaversion als Verhaltensersatz für das Migränesymptom der Photophobie verwendet werden. Um die Lichtaversion zu testen, verwenden wir den Hell-Dunkel-Assay, um die Zeit zu messen, die Mäuse frei wählen, um entweder in einer hellen oder dunklen Umgebung zu verbringen. Der Assay wurde durch die Einführung von zwei kritischen Modifikationen verfeinert: Vorbelichtungen der Kammer vor dem Testverfahren und einstellbare Kammerbeleuchtung, die die Verwendung eines Bereichs von Lichtintensitäten von 55 Lux bis 27.000 Lux ermöglichen. Da die Entscheidung, mehr Zeit im Dunkeln zu verbringen, auch auf Angst hinweist, verwenden wir auch einen lichtunabhängigen Angsttest, den Open-Field-Assay, um Angst von lichtaversivem Verhalten zu unterscheiden. Hier beschreiben wir ein modifiziertes Testparadigma für die Hell/Dunkel- und Freifeldassays. Die Anwendung dieser Assays wird für die intraperitoneale Injektion von Calcitonin-Gen-verwandtem Peptid (CGRP) in zwei Mausstämmen und für optogenetische Hirnstimulationsstudien beschrieben.

Einleitung

Migräne ist eine weit verbreitete neurologische Erkrankung, von der etwa 17% der Amerikaner betroffen sind1 und weltweit die zweithäufigste Ursache für Behinderungen2,3. Bei den Patienten treten Kopfschmerzen auf, die 4-72 Stunden anhalten, begleitet von mindestens einem der folgenden Symptome: Übelkeit und / oder Erbrechen oder Photophobie und Phonophobie4. Jüngste Fortschritte bei der Entwicklung von Calcitonin-Gen-bezogenen Peptid (CGRP) -Antikörpern, die jetzt von der FDA zugelassen sind, haben eine neue Ära für die Migränebehandlung eingeleitet5,6,7. Diese Antikörper blockieren entweder CGRP oder seinen Rezeptor und verhindern Migränesymptome bei etwa 50% der Migränepatienten7. Innerhalb des vergangenen Jahres wurden auch zwei niedermolekulare Antagonisten des CGRP-Rezeptors von der FDA für die abortive Behandlung von Migräne zugelassen, und zwei weitere sind in der Pipeline8. Trotz dieses therapeutischen Fortschritts sind die Mechanismen, durch die Migräneattacken auftreten, nach wie vor schwer fassbar. Zum Beispiel sind die Seiten der CGRP-Aktion nicht bekannt. Die Wirksamkeit therapeutischer Antikörper, die die Blut-Hirn-Schranke nicht nennenswert überwinden, deutet darauf hin, dass CGRP an peripheren Stellen wie den Hirnhäuten und / oder Trigeminusganglien wirkt. Wir können jedoch zentrale Aktionen an zirkumventrikulären Organen nicht ausschließen, denen eine Blut-Hirn-Schranke fehlt9. Zumindest bei Photophobie halten wir dies angesichts unserer Ergebnisse mit Lichtaversion unter Verwendung transgener Nestin/hRAMP1-Mäuse, bei denen hRAMP1 im Nervengewebe überexprimiert wird10, für weniger wahrscheinlich10. Das Verständnis der Mechanismen der Migräne-Pathophysiologie wird neue Wege für die Entwicklung von Migräne-Therapeutika eröffnen.

Präklinische Tiermodelle sind entscheidend für das Verständnis von Krankheitsmechanismen und die Entwicklung neuer Medikamente. Die Beurteilung der Migräne bei Tieren ist jedoch eine Herausforderung, da Tiere ihre Schmerzempfindungen nicht verbal melden können. Angesichts der Tatsache, dass 80-90% der Migränepatienten Photophobie11 aufweisen, gilt Lichtaversion als Indikator für Migräne in Tiermodellen. Dies führte dazu, dass ein Assay entwickelt werden musste, um die Lichtaversion bei Mäusen zu beurteilen.

Der Hell/Dunkel-Assay enthält eine helle Zone und eine dunkle Zone. Es wird häufig zur Messung von Angstzuständen bei Mäusen verwendet, basierend auf ihrer spontanen Erforschung neuartiger Umgebungen, die durch ihre angeborene Abneigung gegen Licht konterkariert wird12. Einige Studien legen 1/3 der Kammer als dunkle Zone fest, während andere 1/2 der Kammer als dunkle Zone festlegen. Die frühere Einstellung wird häufig verwendet, um Angstzustände zu erkennen13. Während wir uns zunächst für gleich große Hell-Dunkel-Kammern entschieden haben, haben wir die beiden relativen Größen nicht verglichen. Wir können anmerken, dass die Gesamtgröße beider Kammern kein wichtiger Faktor ist, da die anfängliche Testbox14 erheblich größer war als die nachfolgende Apparatur15, aber die Ergebnisse waren im Wesentlichen die gleichen.

Zwei kritische Modifikationen an diesem Hell-Dunkel-Assay zur Beurteilung der Lichtaversion waren: die Testbedingung und die Lichtintensität (Abbildung 1). Erstens werden Mäuse vorab in der Hell-Dunkel-Kammer exponiert, um den explorativen Antrieb zu reduzieren16 (Abbildung 1A). Die Notwendigkeit und die Zeiten von Vorbelichtungen hängen von Mausstämmen und Modellen ab. Wildtyp C57BL/6J-Mäuse benötigen in der Regel zwei Vorbelichtungen10, während nur eine Vorbelichtung für CD1-Mäuse ausreicht17. Auf diese Weise kann in diesen beiden Mausstämmen lichtaversives Verhalten entlarvt werden. Zweitens wurde die Kammerbeleuchtung angepasst, um einen einstellbaren Bereich von Lichtintensitäten von schwach (55 Lux) bis hell (27.000 Lux) zu umfassen, wobei 55 Lux mit einem dunklen, bewölkten Tag und 27.000 Lux mit einem hellen sonnigen Tag im Schatten vergleichbar sind10. Wir haben festgestellt, dass die erforderliche Lichtintensität mit der Belastung und dem genetischen Modell variiert. Aus diesem Grund sollten Individuen zunächst die minimale Lichtintensität für ihr experimentelles Paradigma bewerten.

Selbst bei diesen Modifikationen des Assays, die einen lichtaversiven Phänotyp aufdecken können, ist es notwendig, angstähnliches Verhalten zu testen, um zwischen Lichtaversion allein und Angst zu unterscheiden. Der Open-Field-Assay ist eine traditionelle Methode zur Messung von Angstzuständen, die auf der spontanen Erforschung neuartiger Umgebungen basiert. Es unterscheidet sich vom Hell-Dunkel-Assay dadurch, dass dem explorativen Antrieb die angeborene Abneigung gegen ungeschützte Freiräume entgegengesetzt wird. Sowohl die Mitte als auch die Ränder der Kammer befinden sich im Licht, so dass der Freifeldassay ein lichtunabhängiger Angstassay ist. So ermöglicht uns die Kombination der Hell/Dunkel- und Freifeld-Assays, zwischen Lichtaversion aufgrund einer Lichtvermeidung und einer allgemeinen Zunahme der Angst zu unterscheiden.

CGRP ist ein multifunktionales Neuropeptid, das Vasodilatation, Nozizeption und Entzündung reguliert18. Es wird häufig im peripheren und zentralen Nervensystem exprimiert. Es spielt eine wichtige Rolle in der Migräne-Pathophysiologie18. Der Mechanismus, der der CGRP-Wirkung bei Migräne zugrunde liegt, ist jedoch unklar. Durch die Verwendung der Hell/Dunkel- und Freifeld-Assays mit diesem modifizierten Testparadigma konnten wir das lichtaversive Verhalten von Mäusen nach peripherer10,16 (Abbildung 2) und zentraler14,15,16,19 CGRP-Verabreichung identifizieren. Neben Neuropeptiden ist auch die Identifizierung von Hirnregionen, die an der Lichtaversion beteiligt sind, wichtig für das Verständnis der Migräne-Pathophysiologie. Die hinteren Thalamuskerne sind eine integrative Hirnregion für die Schmerz- und Lichtverarbeitung19, und der Thalamus wird während der Migräne aktiviert20. Daher zielten wir auf posteriore thalamische Kerne ab, indem wir Adeno-assoziiertes Virus (AAV), das Kanalrhodopsin-2 (ChR2) oder eYFP enthielt, in diese Region injizierten. Durch die Kombination dieses optogenetischen Ansatzes mit diesen beiden Assays konnten wir zeigen, dass die optische Stimulation von ChR2-exprimierenden Neuronen in den hinteren thalamischen Kernen Lichtaversion induzierte19 (Abbildung 3). In diesem Experiment wurden angesichts der dramatischen Wirkung auf die evozierte Lichtaversion bei diesen optogenetisch manipulierten Mäusen die Vorexpositionen in der Kammer übersprungen.

Protokoll

Tierverfahren wurden vom Animal Care and Use Committee der University of Iowa genehmigt und in Übereinstimmung mit den von den National Institutes of Health festgelegten Standards durchgeführt.

1. Hell/Dunkel-Assay

  1. Aufstellung der Hell-/Dunkelkammer-Apparatur (siehe Materialtabelle). Alle Geräte in diesem Abschnitt sind im Handel erhältlich.
    1. Stellen Sie auf einem Regal die schalldämpfende Kabine (Innenausstattung: 59,7 x 38 x 35,6 cm in B x H x T) mit einer ausziehbaren Schublade für einen einfachen Zugang zur Kammer und einem dunklen Einsatz.
    2. Schließen Sie das DC-Netzteil und ein DC-geregeltes Netzteil an die schalldämpfende Kabine an.
    3. Stellen Sie die transparente, nahtlose Freifeldkammer (27,31 x 27,31 x 20,32 cm in L x B x H) auf die ausziehbare Schublade der Kabine.
    4. Legen Sie den schwarzen, infrarot (IR)-transparenten dunklen Kunststoffeinsatz (28,7 x 15 x 20,6 cm in L x B x H) in die Freifeldkammer. Stellen Sie sicher, dass die Kammer in zwei gleich große Zonen unterteilt ist: eine dunkle Zone und eine helle Zone.
    5. Verbinden Sie drei Sätze von 16-Strahl-IR-Arrays auf der X-, Y- und Z-Achse der Freifeldkammer über Kabel mit dem IR-USB-Controller.
    6. Schließen Sie den IR-USB-Controller an einen Computer an.
    7. Installieren Sie die Tracking-Software auf dem Computer, die den Standort und die Aktivität der Maus aufzeichnen und erfassen kann.
    8. Entfernen Sie für das Beleuchtungspanel-Setup zuerst die Leuchtdioden-Leuchtplatte (LED) (27,70 x 27,70 cm in L x B; 360 LEDs, tageslichtausgeglichene Farbe, 5600K, 60 ° Flutstrahlausbreitung) aus ihrem ursprünglichen Gehäuse.
    9. Montieren Sie die Leuchtplatte mit dem LED-Treiber, dem Kühlkörper und dem Netzteil. Mehrere LED-Lichtpaneele können an ein Netzteil, einen Kühlkörper und einen LED-Treiber angeschlossen werden, um eine gleichmäßige Steuerung der Lichtpaneele zu erreichen.
    10. Konstruieren Sie eine maßgeschneiderte Acrylplattform (29,77 x 27,70 x 8,10 cm in L x B x H), die aus 7 identischen Regalen in Abständen von 0,53 cm besteht (Abbildung 1B). Befestigen Sie das maßgeschneiderte Acrylregal dauerhaft an der Decke in der Kabine über der Kammer.
    11. Stecken Sie die LED-Leuchtplatte in den Schlitz zwischen den unteren beiden Regalen. Stellen Sie die Leuchtplatte bei Bedarf auf unterschiedliche Höhen ein (Abbildung 1B,C) (z. B. bei Verwendung optogenetischer Mäuse). Einzelheiten werden in Abschnitt 3 erläutert).
    12. Schalten Sie den Kühler, den LED-Treiber und das Netzteil ein. Bestätigen Sie, dass der LED-Treiber die LED-Lichtintensität bestimmen kann, indem Sie die Lichtintensität auf dem Kammerboden messen und bestätigen, dass der Boden gleichmäßig beleuchtet ist.
  2. Verhaltenstestverfahren
    HINWEIS: Mäuse werden in einem 12-stündigen Lichtzyklus untergebracht. Alle Verhaltensexperimente werden während des Lichtzyklus durchgeführt. Mäuse, einschließlich Männchen und Weibchen, im Alter von 10-20 Wochen alt, werden verwendet. In diesem Protokoll erleben naive Wildtyp-CD1- und C57BL/6J-Mäuse zwei Vorexpositionen in der Hell-Dunkel-Kammer, gefolgt von einer Exposition mit Behandlung und einer Post-Behandlungs-Exposition. Zwischen jeder Exposition liegt ein dreitägiges Intervall, damit sich die Mäuse erholen können (Tag 1, 4, 7 und 10, wie unten beschrieben und Abbildung 1A). CD1-Mäuse benötigen jedoch nicht die 2. Vorbelichtung und können bei schwachem Licht getestet werden.
    1. Schalten Sie am Tag 1 (Vorbehandlung 1) das Hell/Dunkel-Assay-Gerät ein und stellen Sie die Lichtintensität auf 27.000 Lux ein.
    2. Öffnen Sie die Tracking-Software und richten Sie ein neues Protokoll ein. Legen Sie in der Einstellung Neues Protokoll die Dauer auf 30 Minuten fest. Legen Sie in der Einstellung Neue Analyse Datenbins nach Dauer auf 300 s fest.
    3. Wählen Sie in der Einstellung Neue Zone die Option Vordefinierte Zonen aus. Wählen Sie 2 und dann Horizontal aus. Überprüfen Sie, ob die Kammer für die Aufnahme horizontal in zwei gleich große Zonen unterteilt ist.
    4. Gewöhnen Sie die Mäuse vor dem Test 1 Stunde lang an den Testraum. Halten Sie während der Gewöhnung das Raumlicht eingeschaltet, um den zirkadianen Rhythmus der Maus nicht zu stören. Stellen Sie sicher, dass alle Geräte für den Hell/Dunkel-Test eingeschaltet sind, damit sich die Mäuse vollständig an die Testraumumgebung gewöhnen können.
    5. Wählen Sie Daten erfassen aus. Geben Sie die Maus-IDs ein. Starten Sie das Protokoll.
    6. Ziehen Sie die Schublade außerhalb der schalldämpfenden Kabine, um Zugang zur Hell/Dunkel-Kammer und zum dunklen Einsatz zu erhalten. Nehmen Sie die Maus vorsichtig an der Basis des Schwanzes auf, legen Sie sie in die Lichtzone der Kammer und drücken Sie die Schublade in die Kabine. Stellen Sie sicher, dass die Software die Maus sofort erkennt und mit der Aufzeichnung der Aktivität beginnt.
    7. Warten Sie, bis die Aufnahme nach 30 Minuten automatisch gestoppt wird. Bringen Sie die Maus in ihren Heimatkäfig zurück.
    8. Reinigen Sie die Kammer und den dunklen Einsatz mit keimtötenden Einwegtüchern mit Alkoholgeruch, die 55,0% Isopropylalkohol, 0,25% Alkyl-C12-18-Dimethylethylbenzylammonium und 0,25% Alkyl-C12-18-Dimethylbenzylammoniumchlorid als antimikrobielle Wirkstoffe enthalten, um alle olfaktorischen Hinweise zu beseitigen, die von der vorherigen Maus hinterlassen wurden.
    9. Wiederholen Sie an Tag 4 (Vorbehandlung 2) die Schritte 1.2.1 bis 1.2.8.
    10. Wiederholen Sie am Tag 7 (dem Behandlungstag) die Schritte 1.2.1 und 1.2.4. Nach der Gewöhnung CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g basierend auf dem Körpergewicht der Maus, intraperitoneale Injektion (i.p.) verabreichen, den Kopf der Maus nach vorne neigen und in den unteren rechten Quadranten injizieren. Bringen Sie die Maus in den Heimkäfig zurück.
    11. Starten Sie nach 30 Minuten das Protokoll und führen Sie die Maus in der Hell/Dunkel-Kammer aus, wie in den Schritten 1.2.5 bis 1.2.7 erwähnt. Die Erholungszeit in Heimkäfigen nach Injektionen kann je nach Behandlung verkürzt oder verlängert werden21.
    12. Reinigen Sie die Kammer und den dunklen Einsatz wie in Schritt 1.2.8 beschrieben.
    13. Wiederholen Sie am Tag 10 (Tag nach der Behandlung) die Schritte 1.2.1 bis 1.2.8. Das Experiment kann in Schritt 1.2.13 pausiert werden, bevor der Freifeldassay gestartet wird.

2. Freiland-Assay

  1. Das Geräte-Setup
    1. Einrichtung der Freifeldkammer: Verwenden Sie die gleiche schalldämpfende Kabine und die gleiche Freifeldkammer, die im Hell/Dunkel-Assay verwendet wird, ohne den dunklen Einsatz zu verwenden.
    2. Einrichtung des Lichtpanels: Verwenden Sie das gleiche Setup, das auch für den Hell/Dunkel-Assay verwendet wurde. Stellen Sie sicher, dass die Lichtintensität die gleiche ist wie beim Hell/Dunkel-Assay.
  2. Verhaltenstestverfahren
    1. Schalten Sie das Gerät ein. Stellen Sie die Lichtintensität auf 27.000 Lux ein.
    2. Öffnen Sie die Tracking-Software.
    3. Richten Sie ein neues Protokoll ein, das mit Ausnahme der Einstellungen für die neue Zone im Hell/Dunkel-Assay verwendet wird. Wählen Sie 1 gefolgt von der Mitte in den Einstellungen für neue Zone . Stellen Sie die Peripherie als 3,97 cm vom Umfang und die Mitte als 19,05 × 19,05 cm ein.
    4. Gewöhnen Sie die Mäuse wie in Schritt 1.2.4 beschrieben in den Testraum.
    5. Verabreichen Sie CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g basierend auf dem Körpergewicht der Maus, i.p.), neigen Sie den Kopf der Maus nach vorne und injizieren Sie in den unteren rechten Quadranten. Bringen Sie die Maus in den Heimkäfig zurück.
    6. Starten Sie nach 30 Minuten das Protokoll. Ziehen Sie die ausziehbare Schublade außerhalb der schalldämpfenden Kabine und legen Sie die Maus vorsichtig in die Mitte der offenen Feldkammer. Schieben Sie die Schublade in die Kabine.
    7. Verfolgen Sie das Verhalten für 30 min. Dann bringen Sie die Mäuse in ihre Heimkäfige zurück.
    8. Reinigen Sie das Gerät wie in Schritt 1.2.8 beschrieben.

3. Modifizierter Hell-Dunkel-Test für optogenetische Mäuse

  1. Das Geräte-Setup
    1. Nehmen Sie zwei Änderungen am dunklen Einsatz vor.
      1. Ändern Sie die Öffnung des dunklen Einsatzes auf 5,08 x 5,08 cm (B x H) mit einem kleinen Schlitz von 0,95 x 10,16 cm (B x H) zwischen der Oberseite und der Öffnung des dunklen Einsatzes (Abbildung 1D oben links).
        HINWEIS: Diese Modifikation ermöglicht es einer Maus, problemlos in die dunkle Zone zu gelangen, wenn die faseroptische Kanüle am Mauskopf am Patchkabel befestigt ist.
      2. Verlängern Sie die Oberseite des dunklen Einsatzes über den hellen Bereich als dreieckige Veranda (H = 6,5 cm) (Abbildung 1D oben rechts und unten links). Schneiden Sie ein kreisförmiges Loch (D = 1,7 cm) aus der Veranda und führen Sie eine Halterung in das Loch ein, um die Drehverbindung zu platzieren und zu stabilisieren, die den Laser und die faseroptischen Patchkabel verbindet (Abbildung 1D oben links und unten links).
        HINWEIS: Die Modifikationen führen zu einer kleinen Änderung der Lichtintensität, die den Boden der dunklen Zone erreicht (17 Lux mit Modifikationen gegenüber 14 Lux ohne Modifikationen, gemessen in der hinteren rechten Ecke der dunklen Zone unter 27.000 Lux).
    2. Setzen Sie die Drehdurchführung in die Halterung am dunklen Einsatz ein.
    3. Schließen Sie das 30,5 cm große LWL-Patchkabel an die Drehdurchführung an. Vergewissern Sie sich, dass sich die Drehverbindung sanft drehen kann, so dass sich das Patchkabel problemlos drehen kann, wenn die Maus die Kammer durchquert.
    4. Für den Rest des Aufbaus ist derselbe Geräteaufbau wie in Abschnitt 1 (Hell/Dunkel-Assay) zu verwenden.
  2. Verhaltenstestverfahren
    HINWEIS: Im Gegensatz zu den Wildtyp-Mäusen erhalten die optogenetischen Mäuse keine Vorexpositionen (Vorbehandlung 1 und 2).
    1. Setzen Sie am Testtag die LED-Leuchtplatte in den zweitniedrigsten Schlitz (28,23 cm vom Boden des Sturzes entfernt) ein, um Platz für das Anschließen des Patchkabels zu schaffen. Schalten Sie das Hell/Dunkel-Assay-Gerät ein und stellen Sie die Lichtintensität auf 55 Lux ein.
    2. Verwenden Sie das gleiche Protokoll-Setup wie in 1.2.2 und 1.2.3, mit der Ausnahme, dass Data Bins By Duration in der Einstellung Neue Analyse auf 60 s festgelegt ist, um mit dem Laserstimulationsprotokoll in Schritt 3.2.3 kongruent zu sein.
    3. Schalten Sie den Laser-Power-Button ein. Stellen Sie den Laserpulsregler so ein, dass er für 1 Minute stimuliert, gefolgt von 1 Minute ohne Stimulation über 30 Minuten.
    4. Gewöhnen Sie die Mäuse vor dem Test 1 Stunde lang mit eingeschaltetem Licht in den Testraum.
    5. Starten Sie das Protokoll. Ziehen Sie die ausziehbare Schublade außerhalb der schalldämpfenden Kabine, um Zugang zur Hell/Dunkel-Kammer und zum dunklen Einsatz zu erhalten.
    6. Halten Sie die Maus vorsichtig fest und koppeln Sie die Glasfaserkanüle am Mauskopf über eine Gegenhülse mit dem Glasfaser-Patchkabel (Abbildung 1D unten rechts). Legen Sie die Maus vorsichtig in die Lichtzone und drücken Sie die Schublade in die Kabine. Stellen Sie sicher, dass das Protokoll beginnt, das Mausverhalten automatisch aufzuzeichnen.
    7. Schalten Sie nach 1 min den Impulsregler ein und schalten Sie dann die Failsafe-Taste auf ON. Stellen Sie sicher, dass die Laserstimulation der Zielhirnregion alle zwei Minuten stattfindet.
    8. Wenn das Protokoll nach 30 Minuten automatisch beendet wird, schalten Sie die Failsafe-Taste auf OFF. Schalten Sie dann den Impulsregler aus.
    9. Entkoppeln Sie die Maus und das Glasfaser-Patchkabel. Bringen Sie die Maus in den Heimkäfig zurück.
    10. Reinigen Sie die Kammer und den dunklen Einsatz wie in Schritt 1.2.8 beschrieben.

4. Modifizierter Freilandassay für optogenetische Mäuse

  1. Das Geräte-Setup
    1. Stabilisieren Sie das Drehgelenk über der Kammer mit einem Ständer und einer Klemme (Abbildung 1E).
    2. Verbinden Sie das LWL-Patchkabel mit einer Länge von 50 cm mit der Drehverbindung. Prüfen Sie, ob sich die Drehdurchführung sanft drehen lässt.
    3. Stellen Sie die Drehverbindung auf die entsprechende Höhe auf dem Ständer ein: Stellen Sie sicher, dass das LWL-Patchkabel nur knapp jede Ecke der Kammer erreichen kann, wodurch Interferenzen mit der Mausbewegung vermieden werden.
    4. Für den Rest des Aufbaus ist derselbe Geräteaufbau wie in Abschnitt 1 (Hell/Dunkel-Assay) zu verwenden, jedoch ohne den dunklen Einsatz.
  2. Verhaltenstestverfahren
    1. Schalten Sie das Hell/Dunkel-Assay-Gerät ein und stellen Sie die Lichtintensität auf 55 Lux ein.
    2. Verwenden Sie das gleiche Protokoll-Setup wie im modifizierten Hell/Dunkel-Assay (Abschnitt 3), mit Ausnahme der Einstellungen für die neue Zone. Wählen Sie in den Einstellungen für neue Zone 1 nach Mitte aus. Stellen Sie die Peripherie als 3,97 cm vom Umfang und die Mitte als 19,05 × 19,05 cm ein.
    3. Schalten Sie den Laser-Power-Button ein. Stellen Sie den Laserpulsregler so ein, dass er für 1 Minute stimuliert, gefolgt von 1 Minute ohne Stimulation über 30 Minuten.
    4. Führen Sie die Gewöhnung und den Rest des Tests wie in den Schritten 3.2.4 bis 3.2.10 beschrieben durch, mit Ausnahme von zwei Änderungen an Schritt 3.2.6: Platzieren Sie die Maus vorsichtig in der Mitte der Kammer anstelle der Lichtzone. Bewahren Sie die ausziehbare Schublade außerhalb der Kabine auf, da das Patchkabel mit dem Kopf der Maus verbunden ist.

Ergebnisse

Dieses Verhaltenstestparadigma wurde entwickelt, um lichtaversives Verhalten zu testen. Es kann sowohl mit naiven Wildtypmäusen als auch mit optogenetischen Mäusen durchgeführt werden, um die Lichtaversion in Echtzeit während der Stimulation einer gezielten neuronalen Population zu untersuchen.

Dieses Verfahren wurde verwendet, um die Wirkung der peripheren CGRP-Behandlung bei CD1- und C57BL/6J-Mäusen10,16 und der optischen Stimulation von Neuronen in den hinteren thalamischen Kernen bei ...

Diskussion

Der Hell-Dunkel-Assay wird häufig verwendet, um angstähnliches Verhalten zu beurteilen12. Der Assay beruht auf der angeborenen Abneigung von Mäusen gegen Licht und ihrem Drang zu erforschen, wenn sie in einer neuartigen Umgebung (Lichtzone) platziert werden. Wie wir hier berichten, kann dieser Assay jedoch auch zur Beurteilung des lichtaversiven Verhaltens verwendet werden.

Es ist wichtig, die Anzahl und Notwendigkeit der Vorexpositionen vor dem Test zu berücksichti...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu melden.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des NIH NS R01 NS075599 und RF1 NS113839 unterstützt. Die Inhalte stellen nicht die Ansichten von VA oder der Regierung der Vereinigten Staaten dar.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Activity monitorMed Assoc. IncSoftware tracking mouse behavior
Customized acrylic shelfFor adjusting the height of the LED panel
Dark box insertMed Assoc. IncENV-511
DC power supplyMed Assoc. IncSG-500T
DC regulated power supplyMed Assoc. IncSG-506
Fiber-optic cannulaDoricMFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT
Germicidal disposable wipesSani-ClothSKU # Q55172
Heat SinkWakefield490-6KConnecting to LED panel
IR controller power cableMed Assoc. IncSG-520USB-1
IR USB controllerMed Assoc. IncENV-520USB
Mating sleeveDoricSLEEVE_ZR_1.25
Modified LED light panelGenaray SpectroSP-E-360DDaylight-balanced color (5600K)
Power supplyMEAN WELL USASP-320-12Connecting to LED panel
Seamless open field chamberMed Assoc. IncENV-510S
Sound-attenuating cubicleMed Assoc. IncENV-022MD-027
Stand and clamp
Three 16-beam IR arraysMed Assoc. IncENV-256

Referenzen

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