Investigando comportamento semelhante à enxaqueca usando aversão à luz em camundongos

Resumo

Roedores não são capazes de relatar sintomas de enxaqueca. Aqui, descrevemos um paradigma de teste gerenciável (ensaios de campo claro/escuro e aberto) para medir a aversão à luz, um dos sintomas mais comuns e incômodos em pacientes com enxaquecas.

Resumo

A enxaqueca é uma doença neurológica complexa caracterizada por dor de cabeça e anormalidades sensoriais, como a hipersensibilidade à luz, observada como fotofobia. Embora seja impossível confirmar que um rato está tendo enxaqueca, a aversão à luz pode ser usada como substituto comportamental para o sintoma de enxaqueca da fotofobia. Para testar a aversão à luz, utilizamos o ensaio claro/escuro para medir o tempo que os ratos optam livremente por passar em um ambiente claro ou escuro. O ensaio foi refinado introduzindo duas modificações críticas: pré-exposições à câmara antes de executar o procedimento de teste e iluminação de câmara ajustável, permitindo o uso de uma gama de intensidades de luz de 55 lux a 27.000 lux. Como a escolha de passar mais tempo no escuro também é um indicativo de ansiedade, também utilizamos um teste de ansiedade independente da luz, o ensaio de campo aberto, para distinguir a ansiedade do comportamento leve e aversivo. Aqui, descrevemos um paradigma de teste modificado para os ensaios de campo claro/escuro e aberto. A aplicação desses ensaios é descrita para injeção intraperitoneal de peptídeo relacionado ao gene de calcitonina (CGRP) em duas cepas de camundongos e para estudos de estimulação cerebral optogenética.

Introdução

A enxaqueca é uma doença neurológica prevalente, afetando aproximadamente 17% dos ^americanos1 e é a segunda principal causa de incapacidade ^{globalmente 2,3}. Os pacientes experimentam dor de cabeça que dura de 4 a 72 horas acompanhadas de pelo menos um dos seguintes sintomas: náusea e/ou vômito, ou fotofobia e ^fonofobia4. Os recentes avanços no desenvolvimento de anticorpos de peptídeos relacionados com genes de calcitonina (CGRP) que agora são aprovados pela FDA iniciaram uma nova era para o tratamento da ^{enxaqueca5,6,7}. Esses anticorpos bloqueiam o CGRP ou seu receptor e previnem sintomas de enxaqueca em aproximadamente 50% dos pacientes com ^enxaqueca7. No último ano, dois antagonistas de pequenas moléculas do receptor CGRP também foram aprovados pela FDA para tratamento abortivo de enxaqueca, e mais dois estão no ^pipeline8. Apesar desse progresso terapêutico, os mecanismos pelos quais ocorrem os ataques de enxaqueca ainda permanecem evasivos. Por exemplo, os sites de ação CGRP não são conhecidos. A eficácia de anticorpos terapêuticos que não atravessam consideravelmente a barreira hematoencefálica sugere que o CGRP age em locais periféricos, como os meninges e/ou gânglios trigeminais. No entanto, não podemos descartar ações centrais em órgãos circunviculares, que não possuem uma barreira hemencefálica9. Pelo menos para fotofobia, achamos que isso é menos provável dado nossos resultados com aversão leve usando camundongos nestin/hRAMP1 transgênicos nos quais o hRAMP1 é superexpresso no tecido ^nervoso10. A compreensão dos mecanismos da fisiopatologia da enxaqueca fornecerá novos caminhos para o desenvolvimento da terapêutica da enxaqueca.

Modelos animais pré-clínicos são fundamentais para a compreensão dos mecanismos da doença e o desenvolvimento de novas drogas. No entanto, a avaliação da enxaqueca em animais é desafiadora, uma vez que os animais não podem relatar verbalmente suas sensações de dor. Dado o fato de que 80-90% dos pacientes com enxaqueca apresentam ^fotofobia11, a aversão à luz é considerada um indicador de enxaqueca em modelos animais. Isso levou à necessidade de desenvolver um ensaio para avaliar a aversão à luz em camundongos.

O ensaio claro/escuro contém uma zona de luz e uma zona escura. É amplamente utilizado para medir a ansiedade em camundongos com base em sua exploração espontânea de novos ambientes que é combatido por sua aversão inata à ^luz12. Alguns estudos definem 1/3 da câmara como a zona escura, enquanto outros definem 1/2 da câmara como a zona escura. O primeiro ambiente é frequentemente usado para detectar ^ansiedade13. Embora inicialmente tenhamos escolhido câmaras claras/escuras de tamanho igual, não comparamos os dois tamanhos relativos. Podemos comentar que o tamanho geral de ambas as câmaras não é um fator importante, uma vez que a caixa de testes ^iniciais14 foi consideravelmente maior do que o aparelho ^{subsequente15}, mas os resultados foram essencialmente os mesmos.

Duas modificações críticas neste ensaio claro/escuro para avaliar a aversão à luz foram: a condição de teste e a intensidade da luz (Figura 1). Primeiro, os camundongos são pré-expostos à câmara clara/escura para reduzir a unidade ^{exploratória16} (Figura 1A). A necessidade e os tempos de pré-exposições dependem de cepas e modelos do rato. Os camundongos Wildtype C57BL/6J geralmente requerem duas ^{pré-exposições10}, enquanto apenas uma pré-exposição para camundongos CD1 é ^suficiente17. Desta forma, o comportamento aversivo da luz pode ser desmascarado nessas duas cepas de camundongos. Em segundo lugar, a iluminação da câmara foi adaptada para incluir uma gama ajustável de intensidades de luz de dim (55 lux) a brilhante (27.000 lux) onde 55 lux é comparável a um dia nublado escuro, e 27.000 lux é comparável a um dia ensolarado e ensolarado na ^sombra10. Descobrimos que a intensidade de luz necessária varia de acordo com a cepa e o modelo genético. Por essa razão, os indivíduos devem primeiro avaliar a intensidade mínima da luz para seu paradigma experimental.

Mesmo com essas modificações no ensaio, que podem revelar um fenótipo leve e aversivo, é necessário testar comportamentos semelhantes à ansiedade para distinguir entre a aversão à luz devido à luz apenas versus devido à ansiedade. O ensaio de campo aberto é uma forma tradicional de medir a ansiedade com base na exploração espontânea de novos ambientes. Difere do ensaio claro/escuro, pois a unidade exploratória é combatida pela aversão inata a espaços abertos desprotegidos. Tanto o centro quanto as bordas da câmara estão na luz, então o ensaio de campo aberto é um ensaio de ansiedade levemente independente. Assim, a combinação dos ensaios de campo claro/escuro e aberto nos permite distinguir entre a aversão à luz devido à prevenção da luz versus um aumento geral da ansiedade.

CGRP é um neuropeptídeo multifuncional que regula vasodilatação, nocicepção e ^{inflamação18}. É amplamente expressa nos sistemas nervosos periférico e central. Desempenha um papel importante na fisiopatologia da ^enxaqueca18. No entanto, o mecanismo subjacente à ação cgrp na enxaqueca não é claro. Utilizando os ensaios de campo claro/escuro e aberto com este paradigma de teste modificado, conseguimos identificar o comportamento aversivo em camundongos após a administração periférica ^10,16 (Figura 2) e ^{central14,15,16,19} CGRP. Além dos neuropeptídeos, a identificação de regiões cerebrais envolvidas na aversão à luz também é importante na compreensão da fisiopatologia da enxaqueca. Os núcleos talámicos posteriores são uma região cerebral integrativa para dor e processamento de ^luz19, e o tálamo é ativado durante a ^enxaqueca20. Assim, direcionamos núcleos tálammicos posteriores injetando vírus associado ao adeno (AAV) contendo canalrhodopsina-2 (ChR2) ou eYFP nesta região. Combinando essa abordagem optogenética com esses dois ensaios, demonstramos que a estimulação óptica de neurônios expressos de ChR2 nos núcleos talâmicos posteriores induziu a aversão à ^luz19 (Figura 3). Neste experimento, dado o efeito dramático sobre a aversão à luz evocada nesses ratos optogeneticamente manipulados, pré-exposições à câmara foram ignoradas.

Protocolo

Os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Iowa e realizados em conformidade com as normas estabelecidas pelos Institutos Nacionais de Saúde.

1. Ensaio claro/escuro

1. Aparato de câmara clara/escura (ver Tabela de Materiais) configuração. Todos os equipamentos desta seção estão disponíveis comercialmente.
   1. Em uma prateleira, coloque o cubículo atenuante de som (interior: 59,7 x 38 x 35,6 cm em W x H x D) contendo uma gaveta de retirada para fácil acesso à câmara e inserção escura.
   2. Conecte a fonte de alimentação DC e uma fonte de alimentação regulamentada por DC ao cubículo atenuante de som.
   3. Coloque a câmara de campo aberto transparente (27,31 x 27,31 x 20,32 cm em L x W x H) na gaveta de retirada do cubículo.
   4. Coloque a pastilha escura de plástico transparente (28,7 X 15 X 20,6 cm em L x W x H) na câmara de campo aberto. Certifique-se de que a câmara está dividida em duas zonas de tamanho igual: uma zona escura e uma zona de luz.
   5. Conecte três conjuntos de matrizes ir de 16 feixes nos eixos X, Y e Z da câmara de campo aberto ao controlador USB IR através de cabos.
   6. Conecte o controlador USB IR a um computador.
   7. Instale o software de rastreamento no computador que pode gravar e coletar a localização e a atividade do mouse.
   8. Para a configuração do painel de luz, remova primeiro o painel de luz emissor de luz (LED) (27,70 x 27,70 cm em L x W; 360 LEDs, cor balanceada à luz, 5600K, 60° spread de feixe de inundação) de sua carcaça original.
   9. Monte o painel de luz com o driver LED, o dissipador de calor e a fonte de alimentação. Vários painéis de luz LED podem ser conectados a uma fonte de alimentação, dissipador de calor e driver LED para obter um controle uniforme do painel de luz.
   10. Construa uma plataforma de acrílico personalizada (29,77 x 27,70 x 8,10 cm em L x W x H) composta por 7 prateleiras idênticas a intervalos de 0,53 cm (Figura 1B). Fixar permanentemente a prateleira de acrílico personalizada ao teto dentro do cubículo acima da câmara.
   11. Insira o painel de luz LED no slot entre as duas prateleiras inferiores. Ajuste o painel de luz para diferentes alturas (Figura 1B,C), se necessário (por exemplo, se usar camundongos optogenéticos. Os detalhes são discutidos na Seção 3).
   12. Ligue o dissipador de calor, o driver led e a fonte de alimentação. Confirme que o driver led pode ditar a intensidade da luz LED medindo a intensidade da luz no chão da câmara e confirmar que o piso está iluminado uniformemente.
2. Procedimento de teste comportamental
   NOTA: Os ratos estão alojados em um ciclo de luz de 12 h. Todos os experimentos comportamentais são realizados durante o ciclo de luz. São utilizados camundongos, incluindo machos e fêmeas, com idade entre 10 e 20 semanas de idade. Neste protocolo, os camundongos ingênuos do tipo selvagem CD1 e C57BL/6J experimentam duas pré-exposições à câmara clara/escura seguidas de exposição com tratamento e exposição pós-tratamento. Há um intervalo de três dias entre cada exposição para permitir que os camundongos se recuperem (Dia 1, 4, 7 e 10, conforme descrito abaixo e Figura 1A). No entanto, os camundongos CD1 não requerem a ^2ª pré-exposição e podem ser testados em luz fraca.
   1. No primeiro dia (pré-tratamento 1), ligue o aparelho de ensaio claro/escuro e afina a intensidade da luz para 27.000 lux.
   2. Abra o software de rastreamento e configure um novo protocolo. Na configuração Novo Protocolo , defina a Duração para 30 min. Na configuração Nova análise , defina Caixas de Dados por Duração até 300 s.
   3. Na configuração Nova zona , escolha Zonas Pré-Definidas. Escolha 2 e depois Horizontal. Verifique se a câmara está dividida em duas zonas de tamanho igual para gravação.
   4. Habituar ratos à sala de testes por 1h antes do teste. Durante a habituação, mantenha a luz do quarto acesa para não interromper o ritmo circadiano do rato. Certifique-se de que todos os equipamentos para o ensaio claro/escuro estão ligados, permitindo que os ratos se aclimatem totalmente ao ambiente da sala de testes.
   5. Selecione Adquirir dados. Digite as IDs do mouse. Inicie o protocolo.
   6. Puxe a gaveta para fora do cubículo atenuante de som para acessar a câmara clara/escura e a pastilha escura. Pegue suavemente o mouse pela base da cauda, coloque-o na zona de luz da câmara e empurre a gaveta para dentro do cubículo. Certifique-se de que o software detecta o mouse imediatamente e comece a registrar a atividade.
   7. Aguarde que a gravação pare automaticamente depois de 30 minutos. Devolva o rato para sua gaiola.
   8. Limpe a câmara e a inserção escura usando lenços descartáveis germicidal de álcool-odor contendo 55,0% de álcool isopropílico, 0,25% alquil C12-18 dimethyl ethyl etilbenzyl amônio, e 0,25% alquil C12-18 cloreto de amônio dimetil benzil como ingredientes ativos antimicrobinais para erradicar quaisquer pistas olfativas deixadas pelo camundongo anterior.
   9. No dia 4 (pré-tratamento 2), repetimos as etapas 1.2.1 a 1.2.8.
   10. No dia 7 (dia do tratamento), repita a etapa 1.2.1 e 1.2.4. Após a habituação, administre CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g com base no peso do corpo do rato, injeção intraperitoneal (i.p.)), inclinando a cabeça do mouse para frente e injetando no quadrante inferior direito. Devolva o rato para a jaula.
   11. Após 30 min, inicie o protocolo e execute o mouse na câmara clara/escura, conforme mencionado nas etapas 1.2.5 a 1.2.7. O tempo de recuperação em gaiolas domésticas após as injeções pode ser encurtado ou alongado dependendo do ^tratamento21.
   12. Limpe a câmara e a pastilha escura conforme descrito na etapa 1.2.8.
   13. No dia 10 (dia pós-tratamento), repetimos as etapas 1.2.1 a 1.2.8. O experimento pode ser pausado na etapa 1.2.13 antes de iniciar o ensaio de campo aberto.

2. Ensaio de campo aberto

1. A configuração do aparelho
   1. Configuração da câmara de campo aberto: Use o mesmo cubículo atenuante de som e câmara de campo aberto usado no ensaio claro/escuro, sem usar a pastilha escura.
   2. Configuração do painel de luz: Use a mesma configuração usada no ensaio claro/escuro. Certifique-se de que a intensidade da luz é a mesma usada no ensaio claro/escuro.
2. Procedimento de teste comportamental
   1. Ligue o aparelho. Coloque a intensidade da luz para 27.000 lux.
   2. Abra o software de rastreamento.
   3. Configure um novo protocolo, o mesmo que é usado no ensaio claro/escuro, exceto para as configurações da Nova Zona . Escolha 1 seguido pelo Centro nas configurações Da Nova Zona . Coloque a periferia a 3,97 cm do perímetro e o centro como 19,05 × 19,05 cm.
   4. Habituar ratos à sala de testes conforme descrito na etapa 1.2.4.
   5. Administrar CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g com base no peso do corpo do rato, i.p.), inclinando a cabeça do mouse para a frente e injetando no quadrante inferior direito. Devolva o rato para a jaula.
   6. Depois de 30 min, inicie o protocolo. Puxe a gaveta de puxar para fora do cubículo atenuante de som e coloque suavemente o mouse no meio da câmara de campo aberto. Empurre a gaveta para dentro do cubículo.
   7. Comportamento de pista por 30 minutos. Então devolva ratos para suas gaiolas.
   8. Limpe o aparelho conforme descrito na etapa 1.2.8.

3. Ensaio claro/escuro modificado para camundongos optogenéticos

1. A configuração do aparelho
   1. Faça duas modificações na pastilha escura.
      1. Modifique a abertura da pastilha escura para 5,08 x 5,08 cm (W x H) com uma pequena fenda 0,95 x 10,16 cm (W X H) entre a parte superior e a abertura da inserção escura (Figura 1D superior esquerda).
         NOTA: Esta modificação permite que um mouse vá para a zona escura sem dificuldade quando a cânula de fibra óptica na cabeça do mouse é anexada ao cabo de remendo.
      2. Estenda a parte superior da inserção escura sobre a área de luz como varanda triangular (H=6,5 cm) (Figura 1D superior direito e inferior esquerdo). Corte um orifício circular (D=1,7 cm) da varanda e insira um suporte no orifício para colocar e estabilize a articulação rotativa, que conecta o laser e os cabos de remendo de fibra óptica (Figura 1D superior esquerdo e inferior esquerdo).
         NOTA: As modificações resultam em pequena mudança na intensidade da luz atingindo o piso da zona escura (17 lux com modificações vs 14 lux sem modificações, medida no canto direito traseiro da zona escura abaixo de 27.000 lux).
   2. Insira a junta rotativa no suporte na pastilha escura.
   3. Conecte o cabo de remendo de fibra óptica de 30,5 cm à junta rotativa. Confirme se a junta rotativa pode girar suavemente para que o cabo de remendo possa girar sem dificuldade à medida que o mouse atravessa a câmara.
   4. Para o resto da configuração, use a mesma configuração do aparelho usada na seção 1 (ensaio claro/escuro).
2. Procedimento de teste comportamental
   NOTA: Ao contrário dos camundongos do tipo selvagem, os camundongos optogenéticos não recebem pré-exposições (pré-tratamento 1 e 2).
   1. No dia do teste, insira o painel de luz LED no segundo slot mais baixo (28,23 cm do assoalho do camber) para permitir espaço para conectar o cabo de remendo. Ligue o aparelho de ensaio claro/escuro e coloque a intensidade da luz em 55 lux.
   2. Use a mesma configuração de protocolo que em 1.2.2 e 1.2.3 exceto que as caixas de dados por duração são definidas como 60 s na configuração Nova Análise para ser congruente com o protocolo de estimulação a laser na Etapa 3.2.3.
   3. Ligue o botão laser. Defina o controlador de pulso laser para estimular por 1 min seguido de 1 min sem estimulação acima de 30 minutos.
   4. Habituar ratos à sala de testes com a luz acesa por 1h antes do teste.
   5. Inicie o protocolo. Puxe a gaveta de puxar para fora do cubículo atenuante de som para acessar a câmara clara/escura e a pastilha escura.
   6. Contenha suavemente o mouse e junte a cânula de fibra óptica na cabeça do mouse ao cabo de remendo de fibra óptica através de uma manga de acasalamento (Figura 1D inferior direito). Coloque o mouse suavemente na zona de luz e empurre a gaveta para dentro do cubículo. Certifique-se de que o protocolo começará a registrar o comportamento do mouse automaticamente.
   7. Em 1 min, ligue o controlador de pulso e, em seguida, gire a tecla failsafe para ON. Certifique-se de que a estimulação a laser da região cerebral alvo esteja ocorrendo a cada dois minutos.
   8. Depois de 30 min quando o protocolo parar automaticamente, gire a tecla failsafe para OFF. Em seguida, desligue o controlador de pulso.
   9. Desacoplar o mouse e o cabo de remendo de fibra óptica. Devolva o rato para a jaula.
   10. Limpe a câmara e a pastilha escura conforme descrito na etapa 1.2.8.

4. Ensaio de campo aberto modificado para camundongos optogenéticos

1. A configuração do aparelho
   1. Estabilize a junta rotativa acima da câmara usando um suporte e um grampo (Figura 1E).
   2. Conecte o cabo de remendo de fibra óptica com um comprimento de 50 cm à junta rotativa. Verifique se a junta rotativa pode girar suavemente.
   3. Coloque a junta rotativa na altura apropriada no suporte: certifique-se de que o cabo de remendo de fibra óptica só pode atingir todos os cantos da câmara, o que ajudará a evitar qualquer interferência com o movimento do mouse.
   4. Para o resto da configuração, use a mesma configuração do aparelho usada na seção 1 (ensaio claro/escuro), mas sem a inserção escura.
2. Procedimento de teste comportamental
   1. Ligue o aparelho de ensaio claro/escuro e coloque a intensidade da luz em 55 lux.
   2. Use a mesma configuração de protocolo que na análise de luz/escuridão modificada (seção 3) exceto nas configurações da Nova Zona . Escolha 1 seguindo por Central nas configurações da Nova Zona . Coloque a periferia a 3,97 cm do perímetro e o centro como 19,05 × 19,05 cm.
   3. Ligue o botão laser. Defina o controlador de pulso laser para estimular por 1 min seguido de 1 min sem estimulação acima de 30 min.
   4. Realize a habituação e o resto do teste conforme descrito nas etapas 3.2.4 a 3.2.10, exceto por duas alterações na etapa 3.2.6: coloque o mouse suavemente no meio da câmara em vez da zona de luz; mantenha a gaveta de puxar fora do cubículo devido ao cabo de remendo que se conecta à cabeça do mouse.

Resultados

Este paradigma de teste comportamental foi projetado para testar o comportamento aversivo da luz. Pode ser realizado usando camundongos selvagens ingênuos e camundongos optogenéticos para investigar a aversão à luz em tempo real durante a estimulação de uma população neuronal direcionada.

Este procedimento tem sido utilizado para estudar o efeito do tratamento periférico de CGRP em camundongos CD1 e C57BL/^6J10,16 e estimulaç?...

Discussão

O ensaio claro/escuro é amplamente utilizado para avaliar comportamentos semelhantes à ^ansiedade12. O ensaio conta com a aversão inata dos ratos à luz e sua vontade de explorar quando colocados em um novo ambiente (zona de luz). No entanto, como relatamos aqui, este ensaio também pode ser usado para avaliar o comportamento aversivo da luz também.

É fundamental considerar o número e a necessidade de pré-exposições antes dos testes. Isso depende da tensão do m...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Activity monitor	Med Assoc. Inc		Software tracking mouse behavior
Customized acrylic shelf			For adjusting the height of the LED panel
Dark box insert	Med Assoc. Inc	ENV-511
DC power supply	Med Assoc. Inc	SG-500T
DC regulated power supply	Med Assoc. Inc	SG-506
Fiber-optic cannula	Doric	MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT
Germicidal disposable wipes	Sani-Cloth	SKU # Q55172
Heat Sink	Wakefield	490-6K	Connecting to LED panel
IR controller power cable	Med Assoc. Inc	SG-520USB-1
IR USB controller	Med Assoc. Inc	ENV-520USB
Mating sleeve	Doric	SLEEVE_ZR_1.25
Modified LED light panel	Genaray Spectro	SP-E-360D	Daylight-balanced color (5600K)
Power supply	MEAN WELL USA	SP-320-12	Connecting to LED panel
Seamless open field chamber	Med Assoc. Inc	ENV-510S
Sound-attenuating cubicle	Med Assoc. Inc	ENV-022MD-027
Stand and clamp
Three 16-beam IR arrays	Med Assoc. Inc	ENV-256