Studiare il comportamento simile all'emicrania usando l'avversione alla luce nei topi

Riepilogo

I roditori non sono in grado di segnalare sintomi di emicrania. Qui, descriviamo un paradigma di test gestibile (test luce / buio e campo aperto) per misurare l'avversione alla luce, uno dei sintomi più comuni e fastidiosi nei pazienti con emicrania.

Abstract

L'emicrania è un disturbo neurologico complesso caratterizzato da cefalea e anomalie sensoriali, come l'ipersensibilità alla luce, osservata come fotofobia. Mentre è impossibile confermare che un topo sta vivendo l'emicrania, l'avversione alla luce può essere utilizzata come surrogato comportamentale per il sintomo emicranico della fotofobia. Per testare l'avversione alla luce, utilizziamo il test luce / buio per misurare il tempo che i topi scelgono liberamente di trascorrere in un ambiente chiaro o scuro. Il test è stato perfezionato introducendo due modifiche critiche: pre-esposizioni alla camera prima dell'esecuzione della procedura di prova e illuminazione della camera regolabile, consentendo l'uso di una gamma di intensità luminose da 55 lux a 27.000 lux. Poiché la scelta di trascorrere più tempo al buio è anche indicativa di ansia, utilizziamo anche un test di ansia indipendente dalla luce, il test in campo aperto, per distinguere l'ansia dal comportamento avversivo alla luce. Qui, descriviamo un paradigma di test modificato per i saggi di luce / buio e campo aperto. L'applicazione di questi saggi è descritta per l'iniezione intraperitoneale di peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) in due ceppi di topo e per studi di stimolazione cerebrale optogenetica.

Introduzione

L'emicrania è una malattia neurologica prevalente, che colpisce circa il 17% degli ^americani1 ed è la seconda causa di disabilità a livello ^globale2,3. I pazienti manifestano cefalea che dura 4-72 ore accompagnata da almeno uno dei seguenti sintomi: nausea e/o vomito, o fotofobia e fonofobia4. I recenti progressi nello sviluppo di anticorpi peptidici correlati al gene della calcitonina (CGRP) che sono ora approvati dalla FDA hanno iniziato una nuova era per il trattamento dell'emicrania5,6,7. Questi anticorpi bloccano il CGRP o il suo recettore e prevengono i sintomi dell'emicrania in circa il 50% dei pazienti con ^emicrania7. Nell'ultimo anno, due antagonisti a piccole molecole del recettore CGRP sono stati approvati dalla FDA per il trattamento abortivo dell'emicrania e altri due sono in ^cantiere8. Nonostante questo progresso terapeutico, i meccanismi con cui si verificano gli attacchi di emicrania rimangono ancora sfuggenti. Ad esempio, i siti di azione CGRP non sono noti. L'efficacia degli anticorpi terapeutici che non attraversano sensibilmente la barriera emato-encefalica suggerisce che il CGRP agisce in siti periferici, come le meningi e/o i gangli trigemini. Tuttavia, non possiamo escludere azioni centrali contro gli organi circumventriculari, che mancano di una barriera emato-encefalica9. Almeno per la fotofobia, pensiamo che questo sia meno probabile dati i nostri risultati con l'avversione alla luce usando topi transgenici nestin/ hRAMP1 in cui hRAMP1 è sovraespresso nel tessuto ^nervoso10. Comprendere i meccanismi della fisiopatologia dell'emicrania fornirà nuove strade per lo sviluppo di terapie per l'emicrania.

I modelli animali preclinici sono fondamentali per comprendere i meccanismi della malattia e lo sviluppo di nuovi farmaci. Tuttavia, la valutazione dell'emicrania negli animali è impegnativa poiché gli animali non possono riferire verbalmente le loro sensazioni di dolore. Dato che l'80-90% dei pazienti con emicrania presenta ^fotofobia11, l'avversione alla luce è considerata un indicatore di emicrania nei modelli animali. Ciò ha portato alla necessità di sviluppare un test per valutare l'avversione alla luce nei topi.

Il saggio chiaro/scuro contiene una zona chiara e una zona scura. È ampiamente usato per misurare l'ansia nei topi in base alla loro esplorazione spontanea di nuovi ambienti che è contrastata dalla loro innata avversione alla ^luce12. Alcuni studi impostano 1/3 della camera come zona scura, mentre altri impostano 1/2 della camera come zona scura. La prima impostazione viene spesso utilizzata per rilevare ^l'ansia13. Mentre inizialmente abbiamo scelto camere chiare / scure di dimensioni uguali, non abbiamo confrontato le due dimensioni relative. Possiamo commentare che la dimensione complessiva di entrambe le camere non è un fattore importante poiché la scatola di prova ^iniziale14 era considerevolmente più grande dell'apparato ^successivo15, ma i risultati erano essenzialmente gli stessi.

Due modifiche critiche a questo test luce/buio per valutare l'avversione alla luce sono state: la condizione di test e l'intensità della luce (Figura 1). In primo luogo, i topi sono pre-esposti alla camera chiaro/scura per ridurre l'unità ^{esplorativa16} (Figura 1A). La necessità e i tempi delle pre-esposizioni dipendono dai ceppi e dai modelli murini. I topi wildtype C57BL/6J di solito richiedono due ^{pre-esposizioni10}, mentre è sufficiente una sola pre-esposizione per i topi ^CD117. In questo modo, il comportamento avversivo alla luce può essere smascherato in questi due ceppi di topo. In secondo luogo, l'illuminazione della camera è stata adattata per includere una gamma regolabile di intensità luminose da fioca (55 lux) a luminosa (27.000 lux) dove 55 lux è paragonabile a una giornata nuvolosa e 27.000 lux è paragonabile a una luminosa giornata di sole ^all'ombra10. Abbiamo scoperto che l'intensità luminosa richiesta varia con il ceppo e il modello genetico. Per questo motivo, gli individui dovrebbero prima valutare l'intensità minima della luce per il loro paradigma sperimentale.

Anche con queste modifiche al test, che possono rivelare un fenotipo avversivo alla luce, è necessario testare il comportamento ansioso per distinguere tra avversione alla luce dovuta alla sola luce rispetto all'ansia. Il test in campo aperto è un modo tradizionale per misurare l'ansia basato sull'esplorazione spontanea di nuovi ambienti. Si differenzia dal saggio luce/buio in quanto l'unità esplorativa è contrastata dall'innata avversione verso gli spazi aperti non protetti. Sia il centro che i bordi della camera sono nella luce, quindi il test in campo aperto è un test di ansia indipendente dalla luce. Pertanto, la combinazione dei saggi luce/buio e campo aperto ci consente di distinguere tra l'avversione alla luce dovuta all'evitamento della luce rispetto a un aumento complessivo dell'ansia.

CGRP è un neuropeptide multifunzionale che regola la vasodilatazione, la nocicezione e ^{l'infiammazione18}. È ampiamente espresso nel sistema nervoso periferico e centrale. Svolge un ruolo importante nella fisiopatologia ^{dell'emicrania18}. Tuttavia, il meccanismo alla base dell'azione CGRP nell'emicrania non è chiaro. Utilizzando i saggi di luce/buio e campo aperto con questo paradigma di test modificato, siamo stati in grado di identificare il comportamento avversivo alla luce nei topi dopo somministrazione ^{periferica10,16} (Figura 2) e ^{centrale14,15,16,19} CGRP. Oltre ai neuropeptidi, anche l'identificazione delle regioni cerebrali coinvolte nell'avversione alla luce è importante per comprendere la fisiopatologia dell'emicrania. I nuclei talamici posteriori sono una regione cerebrale integrativa per il dolore e l'elaborazione della ^luce19 e il talamo viene attivato durante l'emicrania20. Pertanto, abbiamo preso di mira i nuclei talamici posteriori iniettando virus adeno-associato (AAV) contenente channelrhodopsin-2 (ChR2) o eYFP in questa regione. Combinando questo approccio optogenetico con questi due saggi, abbiamo dimostrato che la stimolazione ottica dei neuroni che esprimono ChR2 nei nuclei talamici posteriori ha indotto l'avversione alla ^luce19 (Figura 3). In questo esperimento, dato l'effetto drammatico sull'avversione alla luce evocata in questi topi manipolati optogeneticamente, le pre-esposizioni alla camera sono state saltate.

Protocollo

Le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università dell'Iowa ed eseguite in conformità con gli standard stabiliti dal National Institutes of Health.

1. Saggio chiaro/scuro

1. Configurazione dell'apparato a camera chiara/scura (vedi Tabella dei materiali). Tutte le attrezzature in questa sezione sono disponibili in commercio.
   1. Su uno scaffale, posizionare la cabina fonoassorbente (interno: 59,7 x 38 x 35,6 cm in L x A x P) contenente un cassetto estraibile per un facile accesso alla camera e all'inserto scuro.
   2. Collegare l'alimentatore CC e un alimentatore regolato CC al cubicolo di attenuazione del suono.
   3. Posizionare la camera trasparente a campo aperto senza cuciture (27,31 x 27,31 x 20,32 cm in L x P x A) sul cassetto estraibile del cubicolo.
   4. Posizionare l'inserto in plastica scura nera trasparente a infrarossi (IR) (28,7 X 15 X 20,6 cm in L x P x A) nella camera a campo aperto. Assicurarsi che la camera sia divisa in due zone di uguali dimensioni: una zona scura e una zona chiara.
   5. Collegare tre serie di array IR a 16 fasci sugli assi X, Y e Z della camera a campo aperto al controller USB IR tramite cavi.
   6. Collegare il controller USB IR a un computer.
   7. Installare il software di tracciamento sul computer che può registrare e raccogliere la posizione e l'attività del mouse.
   8. Per la configurazione del pannello luminoso, rimuovere innanzitutto il pannello luminoso a diodi emettitori di luce (LED) (27,70 x 27,70 cm in L x L; 360 LED, colore bilanciato alla luce diurna, 5600K, diffusione del fascio di inondazione a 60 °) dal suo alloggiamento originale.
   9. Assemblare il pannello luminoso con il driver LED, il dissipatore di calore e l'alimentatore. Più pannelli luminosi a LED possono essere collegati a un alimentatore, un dissipatore di calore e un driver LED per ottenere un controllo uniforme del pannello luminoso.
   10. Costruisci una piattaforma acrilica personalizzata (29,77 x 27,70 x 8,10 cm in L x P x A) composta da 7 ripiani identici a intervalli di 0,53 cm (Figura 1B). Applicare in modo permanente il ripiano acrilico personalizzato al soffitto all'interno del cubicolo sopra la camera.
   11. Inserire il pannello luminoso a LED nella fessura tra i due ripiani inferiori. Regolare il pannello luminoso a diverse altezze (Figura 1B, C), se necessario (ad esempio, se si utilizzano topi optogenetici. I dettagli sono discussi nella Sezione 3).
   12. Accendere il dissipatore di calore, il driver LED e l'alimentatore. Verificare che il driver LED sia in grado di dettare l'intensità della luce LED misurando l'intensità luminosa sul pavimento della camera e verificare che il pavimento sia illuminato in modo uniforme.
2. Procedura di test comportamentale
   NOTA: i mouse sono alloggiati su un ciclo di luce di 12 ore. Tutti gli esperimenti comportamentali vengono eseguiti durante il ciclo di luce. Vengono utilizzati topi, inclusi maschi e femmine, di età compresa tra 10 e 20 settimane. In questo protocollo, i topi naïve wildtype CD1 e C57BL/6J sperimentano due pre-esposizioni alla camera chiara/scura seguite dall'esposizione con trattamento e da un'esposizione post-trattamento. C'è un intervallo di tre giorni tra ogni esposizione per consentire ai topi di recuperare (Giorno 1, 4, 7 e 10 come descritto di seguito e Figura 1A). Tuttavia, i topi CD1 non richiedono la ^2a pre-esposizione e possono essere testati in penombra.
   1. Il giorno 1 (pretrattamento 1), accendere l'apparecchiatura di analisi luce/buio e impostare l'intensità della luce a 27.000 lux.
   2. Aprire il software di tracciamento e impostare un nuovo protocollo. Nell'impostazione Nuovo protocollo , impostare Durata su 30 min. Nell'impostazione Nuova analisi , impostare Raccoglitori dati per durata su 300 s.
   3. Nell'impostazione Nuova zona , scegliere Zone predefinite. Scegliere 2 e quindi Orizzontale. Controllare se la camera è divisa in due zone di uguali dimensioni orizzontalmente per la registrazione.
   4. Abituare i topi alla sala di prova per 1 ora prima del test. Durante l'assuefazione, tenere accesa la luce della stanza per non interrompere il ritmo circadiano del mouse. Assicurarsi che tutte le apparecchiature per il test chiaro/scuro siano accese, consentendo ai mouse di acclimatarsi completamente all'ambiente della sala prove.
   5. Seleziona Acquisisci dati. Immettere gli ID del mouse. Avviare il protocollo.
   6. Tirare il cassetto all'esterno della cabina fonoassorbente per accedere alla camera chiara/scura e all'inserto scuro. Sollevare delicatamente il mouse dalla base della coda, posizionarlo nella zona luminosa della camera e spingere il cassetto all'interno del cubicolo. Assicurarsi che il software rilevi immediatamente il mouse e inizi a registrare l'attività.
   7. Attendi che la registrazione si interrompa automaticamente dopo 30 minuti. Riporta il mouse nella sua gabbia di casa.
   8. Pulire la camera e l'inserto scuro utilizzando salviette monouso germicide di odore di alcol contenenti il 55,0% di alcol isopropilico, lo 0,25% di alchil C12-18 dimetil etilbenzilo ammonio e lo 0,25% di alchil C12-18 dimetil benzil ammonio cloruro come principi attivi antimicrobici per sradicare eventuali segnali olfattivi lasciati dal topo precedente.
   9. Il giorno 4 (pretrattamento 2), ripetere i passaggi da 1.2.1 a 1.2.8.
   10. Il giorno 7 (il giorno del trattamento), ripetere i passaggi 1.2.1 e 1.2.4. Dopo l'assuefazione, somministrare CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g in base al peso corporeo del topo, iniezione intraperitoneale (i.p.)), inclinando la testa del mouse in avanti e iniettando nel quadrante inferiore destro. Riportare il mouse nella gabbia di casa.
   11. Dopo 30 minuti, avviare il protocollo ed eseguire il mouse nella camera chiara/scura come indicato nei passaggi da 1.2.5 a 1.2.7. Il tempo di recupero nelle gabbie domestiche dopo le iniezioni può essere ridotto o allungato a seconda del ^{trattamento21}.
   12. Pulire la camera e l'inserto scuro come descritto al punto 1.2.8.
   13. Il giorno 10 (giorno post-trattamento), ripetere i passaggi da 1.2.1 a 1.2.8. L'esperimento può essere sospeso al passaggio 1.2.13 prima di iniziare il test in campo aperto.

2. Test a campo aperto

1. La configurazione dell'apparato
   1. Configurazione della camera a campo aperto: utilizzare la stessa cabina di attenuazione del suono e la stessa camera a campo aperto utilizzate nel test luce/buio, senza utilizzare l'inserto scuro.
   2. Configurazione del pannello luminoso: utilizzare la stessa configurazione utilizzata nel test chiaro/scuro. Assicurarsi che l'intensità della luce sia la stessa utilizzata nel test luce/buio.
2. Procedura di test comportamentale
   1. Accendere l'apparecchio. Impostare l'intensità della luce su 27.000 lux.
   2. Apri il software di tracciamento.
   3. Impostare un nuovo protocollo, lo stesso utilizzato nel test chiaro/scuro, ad eccezione delle impostazioni Nuova zona . Scegliere 1 seguito dal Centro nelle impostazioni Nuova zona . Impostare la periferia a 3,97 cm dal perimetro e il centro a 19,05 × 19,05 cm.
   4. Abituare i topi alla sala prove come descritto al punto 1.2.4.
   5. Somministrare CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g in base al peso corporeo del topo, cioè), inclinando la testa del mouse in avanti e iniettando nel quadrante inferiore destro. Riportare il mouse nella gabbia di casa.
   6. Dopo 30 minuti, avviare il protocollo. Estrarre il cassetto estraibile all'esterno della cabina di attenuazione del suono e posizionare delicatamente il mouse al centro della camera a campo aperto. Spingere il cassetto all'interno del cubicolo.
   7. Tieni traccia del comportamento per 30 minuti. Quindi riporta i topi nelle loro gabbie di casa.
   8. Pulire l'apparecchio come descritto al punto 1.2.8.

3. Test chiaro/scuro modificato per topi optogenetici

1. La configurazione dell'apparato
   1. Apportate due modifiche all'inserto scuro.
      1. Modificare l'apertura dell'inserto scuro a 5,08 x 5,08 cm (L x A) con una piccola fessura 0,95 x 10,16 cm (L X A) tra la parte superiore e l'apertura dell'inserto scuro (Figura 1D in alto a sinistra).
         NOTA: questa modifica consente a un mouse di accedere alla zona buia senza difficoltà quando la cannula in fibra ottica sulla testa del mouse è collegata al cavo patch.
      2. Estendere la parte superiore dell'inserto scuro sopra l'area chiara come un portico triangolare (H = 6,5 cm) (Figura 1D in alto a destra e in basso a sinistra). Tagliare un foro circolare (D = 1,7 cm) dal portico e inserire un supporto nel foro per posizionare e stabilizzare il giunto rotante, che collega il laser e i cavi patch in fibra ottica (Figura 1D in alto a sinistra e in basso a sinistra).
         NOTA: Le modifiche comportano un piccolo cambiamento nell'intensità della luce che raggiunge il pavimento della zona scura (17 lux con modifiche contro 14 lux senza modifiche, misurato nell'angolo posteriore destro della zona scura sotto i 27.000 lux).
   2. Inserire il giunto rotante nel supporto sull'inserto scuro.
   3. Collegare il cavo patch in fibra ottica da 30,5 cm al giunto rotante. Verificare che il giunto rotante possa ruotare senza intoppi in modo che il cavo patch possa ruotare senza difficoltà mentre il mouse attraversa la camera.
   4. Per il resto della configurazione, utilizzare la stessa configurazione dell'apparecchio utilizzata nella sezione 1 (saggio chiaro/scuro).
2. Procedura di test comportamentale
   NOTA: A differenza dei topi wildtype, i topi optogenetici non ricevono pre-esposizioni (pretrattamento 1 e 2).
   1. Il giorno del test, inserire il pannello luminoso a LED nel secondo slot più basso (28,23 cm dal pavimento del camber) per consentire lo spazio per il collegamento del cavo patch. Accendere l'apparecchiatura di analisi luce/buio e impostare l'intensità della luce su 55 lux.
   2. Utilizzare la stessa configurazione del protocollo di cui alle versioni 1.2.2 e 1.2.3, ad eccezione del fatto che i raccoglitori di dati per durata sono impostati su 60 s nell'impostazione Nuova analisi in modo che sia congruente con il protocollo di stimolazione laser nel passaggio 3.2.3.
   3. Accendere il pulsante di accensione laser. Impostare il controller dell'impulso laser per stimolare per 1 minuto seguito da 1 minuto senza stimolazione oltre 30 minuti.
   4. Abituare i topi alla sala prove con la luce accesa per 1 ora prima del test.
   5. Avviare il protocollo. Estrarre il cassetto estraibile all'esterno del cubicolo fonoassorbente per accedere alla camera chiara/scura e all'inserto scuro.
   6. Trattenere delicatamente il mouse e accoppiare la cannula in fibra ottica sulla testa del mouse al cavo patch in fibra ottica tramite un manicotto di accoppiamento (Figura 1D in basso a destra). Posizionare delicatamente il mouse nella zona luminosa e spingere il cassetto all'interno del cubicolo. Assicurarsi che il protocollo inizi a registrare automaticamente il comportamento del mouse.
   7. A 1 minuto, accendere il controller di impulsi e quindi accendere il tasto failsafe su ON. Assicurati che la stimolazione laser della regione del cervello mirata si verifichi ogni due minuti.
   8. Dopo 30 minuti, quando il protocollo si arresta automaticamente, ruotare la chiave failsafe su OFF. Quindi spegnere il controller degli impulsi.
   9. Disaccoppia il mouse e il cavo patch in fibra ottica. Riportare il mouse nella gabbia di casa.
   10. Pulire la camera e l'inserto scuro come descritto al punto 1.2.8.

4. Test in campo aperto modificato per topi optogenetici

1. La configurazione dell'apparato
   1. Stabilizzare il giunto rotante sopra la camera utilizzando un supporto e un morsetto (Figura 1E).
   2. Collegare il cavo patch in fibra ottica con una lunghezza di 50 cm al giunto rotante. Controllare se il giunto rotante può ruotare senza intoppi.
   3. Impostare il giunto rotante all'altezza appropriata sul supporto: assicurarsi che il cavo patch in fibra ottica possa raggiungere solo ogni angolo della camera, il che contribuirà a evitare qualsiasi interferenza con il movimento del mouse.
   4. Per il resto della configurazione, utilizzare la stessa configurazione dell'apparecchio utilizzata nella sezione 1 (saggio chiaro/scuro), ma senza l'inserto scuro.
2. Procedura di test comportamentale
   1. Accendere l'apparecchiatura di analisi luce/buio e impostare l'intensità della luce su 55 lux.
   2. Utilizzare la stessa configurazione del protocollo utilizzata nel test luce/buio modificato (sezione 3), ad eccezione delle impostazioni Nuova zona . Scegliere 1 in base al centro nelle impostazioni Nuova zona . Impostare la periferia a 3,97 cm dal perimetro e il centro a 19,05 × 19,05 cm.
   3. Accendere il pulsante di accensione laser. Impostare il controller dell'impulso laser per stimolare per 1 minuto seguito da 1 minuto senza stimolazione oltre 30 minuti.
   4. Eseguire l'assuefazione e il resto della prova come descritto nei passaggi da 3.2.4 a 3.2.10 ad eccezione di due modifiche al punto 3.2.6: posizionare delicatamente il mouse al centro della camera anziché nella zona di luce; tenere il cassetto estraibile all'esterno del cubicolo a causa del cavo patch che si collega alla testa del mouse.

Risultati

Questo paradigma di test comportamentale è progettato per testare il comportamento avversivo alla luce. Può essere eseguito utilizzando sia topi wildtype naïve che topi optogenetici per studiare l'avversione alla luce in tempo reale durante la stimolazione di una popolazione neuronale mirata.

Questa procedura è stata utilizzata per studiare l'effetto del trattamento periferico con CGRP nei topi CD1 e C57BL/^6J10,16 e la stimolazione ottica dei neuroni nei nuclei tala...

Discussione

Il test luce/buio è ampiamente utilizzato per valutare il comportamento ansiolitico12. Il test si basa sull'innata avversione dei topi alla luce e sulla loro spinta ad esplorare quando collocati in un nuovo ambiente (zona di luce). Tuttavia, come riportiamo qui, questo test può anche essere utilizzato per valutare il comportamento avversivo alla luce.

È fondamentale considerare il numero e la necessità di pre-esposizioni prima del test. Questo dipende dal ceppo o da...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Activity monitor	Med Assoc. Inc		Software tracking mouse behavior
Customized acrylic shelf			For adjusting the height of the LED panel
Dark box insert	Med Assoc. Inc	ENV-511
DC power supply	Med Assoc. Inc	SG-500T
DC regulated power supply	Med Assoc. Inc	SG-506
Fiber-optic cannula	Doric	MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT
Germicidal disposable wipes	Sani-Cloth	SKU # Q55172
Heat Sink	Wakefield	490-6K	Connecting to LED panel
IR controller power cable	Med Assoc. Inc	SG-520USB-1
IR USB controller	Med Assoc. Inc	ENV-520USB
Mating sleeve	Doric	SLEEVE_ZR_1.25
Modified LED light panel	Genaray Spectro	SP-E-360D	Daylight-balanced color (5600K)
Power supply	MEAN WELL USA	SP-320-12	Connecting to LED panel
Seamless open field chamber	Med Assoc. Inc	ENV-510S
Sound-attenuating cubicle	Med Assoc. Inc	ENV-022MD-027
Stand and clamp
Three 16-beam IR arrays	Med Assoc. Inc	ENV-256