Investigando el comportamiento similar a la migraña utilizando la aversión a la luz en ratones

Resumen

Los roedores no pueden reportar síntomas de migraña. Aquí, describimos un paradigma de prueba manejable (ensayos de luz / oscuridad y campo abierto) para medir la aversión a la luz, uno de los síntomas más comunes y molestos en pacientes con migrañas.

Resumen

La migraña es un trastorno neurológico complejo caracterizado por dolor de cabeza y anomalías sensoriales, como la hipersensibilidad a la luz, observada como fotofobia. Si bien es imposible confirmar que un ratón está experimentando migraña, la aversión a la luz se puede utilizar como un sustituto conductual para el síntoma de migraña de la fotofobia. Para probar la aversión a la luz, utilizamos el ensayo de luz / oscuridad para medir el tiempo que los ratones eligen pasar libremente en un entorno claro u oscuro. El ensayo se ha perfeccionado mediante la introducción de dos modificaciones críticas: preexposiciones a la cámara antes de ejecutar el procedimiento de prueba y la iluminación ajustable de la cámara, lo que permite el uso de un rango de intensidades de luz de 55 lux a 27.000 lux. Debido a que la elección de pasar más tiempo en la oscuridad también es indicativa de ansiedad, también utilizamos una prueba de ansiedad independiente de la luz, el ensayo de campo abierto, para distinguir la ansiedad del comportamiento aversivo a la luz. Aquí, describimos un paradigma de prueba modificado para los ensayos de campo abierto y claro/oscuro. La aplicación de estos ensayos se describe para la inyección intraperitoneal de péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) en dos cepas de ratón y para estudios de estimulación cerebral optogenética.

Introducción

La migraña es una enfermedad neurológica prevalente, que afecta aproximadamente al 17% de los ^{estadounidenses1} y es la segunda causa de discapacidad a nivel ^mundial2,3. Los pacientes experimentan cefalea que dura de 4 a 72 horas acompañada de al menos uno de los siguientes síntomas: náuseas y/o vómitos, o fotofobia y ^fonofobia4. Los recientes avances en el desarrollo de anticuerpos péptidos relacionados con el gen de la calcitonina (CGRP) que ahora están aprobados por la FDA han comenzado una nueva era para el tratamiento de la ^{migraña5,6,7}. Estos anticuerpos bloquean la CGRP o su receptor y previenen los síntomas de migraña en aproximadamente el 50% de los pacientes con ^migraña7. En el último año, dos antagonistas de moléculas pequeñas del receptor CGRP también han sido aprobados por la FDA para el tratamiento abortivo de la migraña, y dos más están en ^proceso8. A pesar de este progreso terapéutico, los mecanismos por los cuales ocurren los ataques de migraña siguen siendo esquivos. Por ejemplo, no se conocen los sitios de acción de CGRP. La eficacia de los anticuerpos terapéuticos que no cruzan apreciablemente la barrera hematoencefálica sugiere que el CGRP actúa en sitios periféricos, como las meninges y/o los ganglios del trigémino. Sin embargo, no podemos descartar acciones centrales en los órganos circunventriculares, que carecen de barrera hematoencefálica9. Al menos para la fotofobia, creemos que esto es menos probable dados nuestros resultados con aversión a la luz utilizando ratones transgénicos nestin/hRAMP1 en los que hRAMP1 está sobreexpresado en el tejido ^nervioso10. La comprensión de los mecanismos de la fisiopatología de la migraña proporcionará nuevas vías para el desarrollo de la terapéutica de la migraña.

Los modelos animales preclínicos son fundamentales para comprender los mecanismos de la enfermedad y el desarrollo de nuevos fármacos. Sin embargo, la evaluación de la migraña en animales es un desafío ya que los animales no pueden informar verbalmente sus sensaciones de dolor. Dado que el 80-90% de los pacientes con migraña exhiben ^fotofobia11, la aversión a la luz se considera un indicador de migraña en modelos animales. Esto llevó a la necesidad de desarrollar un ensayo para evaluar la aversión a la luz en ratones.

El ensayo de luz/oscuridad contiene una zona clara y una zona oscura. Es ampliamente utilizado para medir la ansiedad en ratones en base a su exploración espontánea de entornos novedosos que se contrarresta con su aversión innata a la ^luz12. Algunos estudios establecen 1/3 de la cámara como la zona oscura, mientras que otros establecen 1/2 de la cámara como la zona oscura. El primer ajuste se utiliza a menudo para detectar la ^ansiedad13. Si bien inicialmente elegimos cámaras claras / oscuras de igual tamaño, no hemos comparado los dos tamaños relativos. Podemos comentar que el tamaño total de ambas cámaras no es un factor importante, ya que la caja de prueba ^inicial14 era considerablemente más grande que el aparato ^posterior15, sin embargo, los resultados fueron esencialmente los mismos.

Dos modificaciones críticas a este ensayo de luz/oscuridad para evaluar la aversión a la luz fueron: la condición de prueba y la intensidad de la luz (Figura 1). En primer lugar, los ratones están preexpuestos a la cámara de luz/oscuridad para reducir el impulso ^{exploratorio16} (Figura 1A). La necesidad y los tiempos de preexposición dependen de las cepas y modelos de ratón. Los ratones Wildtype C57BL/6J suelen requerir dos ^{preexposiciones10}, mientras que solo una preexposición para ratones CD1 es ^suficiente17. De esta manera, el comportamiento aversivo de la luz se puede desenmascarar en estas dos cepas de ratón. En segundo lugar, la iluminación de la cámara se ha adaptado para incluir un rango ajustable de intensidades de luz desde tenue (55 lux) hasta brillante (27,000 lux) donde 55 lux es comparable a un día nublado oscuro, y 27,000 lux es comparable a un día soleado brillante a la ^sombra10. Hemos encontrado que la intensidad de luz requerida varía con la cepa y el modelo genético. Por esta razón, los individuos primero deben evaluar la intensidad mínima de luz para su paradigma experimental.

Incluso con estas modificaciones en el ensayo, que pueden revelar un fenotipo aversivo a la luz, es necesario probar el comportamiento similar a la ansiedad para distinguir entre la aversión a la luz debido a la luz sola y debido a la ansiedad. El ensayo de campo abierto es una forma tradicional de medir la ansiedad basada en la exploración espontánea de entornos novedosos. Se diferencia del ensayo de luz / oscuridad en que el impulso exploratorio es contrarrestado por la aversión innata a los espacios abiertos desprotegidos. Tanto el centro como los bordes de la cámara están en la luz, por lo que el ensayo de campo abierto es un ensayo de ansiedad independiente de la luz. Por lo tanto, la combinación de los ensayos de luz / oscuridad y campo abierto nos permite distinguir entre la aversión a la luz debido a una evitación de la luz frente a un aumento general de la ansiedad.

La CGRP es un neuropéptido multifuncional que regula la vasodilatación, la nocicepción y la ^{inflamación18}. Se expresa ampliamente en los sistemas nerviosos periférico y central. Juega un papel importante en la fisiopatología de la ^migraña18. Sin embargo, el mecanismo subyacente a la acción de CGRP en la migraña no está claro. Al utilizar los ensayos de campo abierto y claro/oscuro con este paradigma de prueba modificado, pudimos identificar el comportamiento aversivo a la luz en ratones después de la administración de CGRP ^{periférica10,16} (Figura 2) y central14,15,16,19. Además de los neuropéptidos, la identificación de las regiones cerebrales involucradas en la aversión a la luz también es importante para comprender la fisiopatología de la migraña. Los núcleos talámicos posteriores son una región cerebral integradora para el dolor y el procesamiento de la ^luz19, y el tálamo se activa durante la ^migraña20. Por lo tanto, nos dirigimos a los núcleos talámicos posteriores inyectando virus adenoasociados (AAV) que contienen canalrodopsina-2 (ChR2) o eYFP en esta región. Al combinar este enfoque optogenético con estos dos ensayos, demostramos que la estimulación óptica de las neuronas que expresan ChR2 en los núcleos talámicos posteriores indujo aversión a la ^luz19 (Figura 3). En este experimento, dado el efecto dramático en la aversión a la luz evocada en estos ratones manipulados optogenéticamente, se omitieron las preexposiciones a la cámara.

Protocolo

Los procedimientos de animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Iowa y se realizaron de conformidad con los estándares establecidos por los Institutos Nacionales de Salud.

1. Ensayo de luz/oscuridad

1. Configuración del aparato de cámara clara/oscura (ver Tabla de Materiales). Todo el equipo de esta sección está disponible comercialmente.
   1. En un estante, coloque el cubículo atenuante de sonido (interior: 59,7 x 38 x 35,6 cm en W x H x D) que contiene un cajón extraíble para facilitar el acceso a la cámara y el inserto oscuro.
   2. Conecte la fuente de alimentación de CC y una fuente de alimentación regulada por CC al cubículo atenuante de sonido.
   3. Coloque la cámara transparente de campo abierto sin costuras (27,31 x 27,31 x 20,32 cm en L x W x H) en el cajón extraíble del cubículo.
   4. Coloque el inserto oscuro de plástico negro e infrarrojo (IR) transparente (28,7 X 15 X 20,6 cm en L x W x H) en la cámara de campo abierto. Asegúrese de que la cámara esté dividida en dos zonas de igual tamaño: una zona oscura y una zona clara.
   5. Conecte tres conjuntos de matrices IR de 16 haces en los ejes X, Y y Z de la cámara de campo abierto al controlador USB IR a través de cables.
   6. Conecte el controlador IR USB a una computadora.
   7. Instale el software de seguimiento en la computadora que puede registrar y recopilar la ubicación y la actividad del mouse.
   8. Para la configuración del panel de luz, primero retire el panel de luz de diodo emisor de luz (LED) (27,70 x 27,70 cm en L x W; 360 LED, color equilibrado a la luz del día, 5600K, 60 ° de propagación del haz de inundación) de su carcasa original.
   9. Ensamble el panel de luz con el controlador LED, el disipador de calor y la fuente de alimentación. Se pueden conectar múltiples paneles de luz LED a una fuente de alimentación, disipador de calor y controlador LED para lograr un control uniforme del panel de luz.
   10. Construya una plataforma acrílica personalizada (29.77 x 27.70 x 8.10 cm en L x W x H) que comprende 7 estantes idénticos a intervalos de 0.53 cm (Figura 1B). Coloque permanentemente el estante de acrílico personalizado en el techo dentro del cubículo sobre la cámara.
   11. Inserte el panel de luz LED en la ranura entre los dos estantes inferiores. Ajuste el panel de luz a diferentes alturas (Figura 1B, C), si es necesario (por ejemplo, si usa ratones optogenéticos. Los detalles se discuten en la Sección 3).
   12. Encienda el disipador de calor, el controlador LED y la fuente de alimentación. Confirme que el controlador LED puede dictar la intensidad de la luz LED midiendo la intensidad de la luz en el piso de la cámara y confirme que el piso está iluminado de manera uniforme.
2. Procedimiento de prueba de comportamiento
   NOTA: Los ratones están alojados en un ciclo de luz de 12 h. Todos los experimentos de comportamiento se realizan durante el ciclo de luz. Se utilizan ratones, incluidos machos y hembras, de 10 a 20 semanas de edad. En este protocolo, los ratones cd1 y C57BL/6J de tipo salvaje ingenuo experimentan dos pre-exposiciones a la cámara de luz/oscuridad seguidas de exposición con tratamiento y una exposición post-tratamiento. Hay un intervalo de tres días entre cada exposición para permitir que los ratones se recuperen (Día 1, 4, 7 y 10 como se describe a continuación y figura 1A). Sin embargo, los ratones CD1 no requieren la ^2ª preexposición y se pueden probar con poca luz.
   1. El día 1 (pretratamiento 1), encienda el aparato de ensayo de luz/oscuridad y ajuste la intensidad de la luz a 27.000 lux.
   2. Abra el software de seguimiento y configure un nuevo protocolo. En la configuración Nuevo protocolo , establezca la duración en 30 min. En la configuración Nuevo análisis , establezca Bandejas de datos por Duración en 300 s.
   3. En la configuración Nueva zona , elija Zonas predefinidas. Elija 2 y luego Horizontal. Compruebe si la cámara está dividida en dos zonas de igual tamaño horizontalmente para la grabación.
   4. Habitúe a los ratones a la sala de pruebas durante 1 h antes de la prueba. Durante la habituación, mantenga la luz de la habitación encendida para no interrumpir el ritmo circadiano del ratón. Asegúrese de que todo el equipo para el ensayo de luz / oscuridad esté encendido, lo que permite que los ratones se aclimaten completamente al entorno de la sala de pruebas.
   5. Seleccione Adquirir datos. Introduzca los ID de ratón. Inicie el protocolo.
   6. Tire del cajón fuera del cubículo atenuante del sonido para acceder a la cámara de luz/oscuridad y al inserto oscuro. Levante suavemente el mouse por la base de la cola, colóquelo en la zona de luz de la cámara y empuje el cajón dentro del cubículo. Asegúrese de que el software detecte el mouse inmediatamente y comience a registrar la actividad.
   7. Espere a que la grabación se detenga automáticamente después de 30 minutos. Devuelva el ratón a su jaula de origen.
   8. Limpie la cámara y el inserto oscuro con toallitas desechables germicidas con olor a alcohol que contengan alcohol isopropílico al 55.0%, cloruro de amonio de dimetil bencil C12-18 alquilo C12-18 dimetilbencilmonio y cloruro de amonio de dimetil bencil al 0.25% de alquilo C12-18 como ingredientes activos antimicrobianos para erradicar cualquier señal olfativa dejada por el ratón anterior.
   9. El día 4 (pretratamiento 2), repita los pasos 1.2.1 a 1.2.8.
   10. El día 7 (el día del tratamiento), repita los pasos 1.2.1 y 1.2.4. Después de la habituación, administrar CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g en función del peso corporal del ratón, inyección intraperitoneal (i.p.)), inclinando la cabeza del ratón hacia adelante e inyectando en el cuadrante inferior derecho. Devuelva el ratón a la jaula de casa.
   11. Después de 30 minutos, inicie el protocolo y ejecute el mouse en la cámara clara / oscura como se menciona en los pasos 1.2.5 a 1.2.7. El tiempo de recuperación en jaulas domiciliarias después de las inyecciones puede acortarse o alargarse dependiendo del ^{tratamiento21}.
   12. Limpie la cámara y el inserto oscuro como se describe en el paso 1.2.8.
   13. El día 10 (día posterior al tratamiento), repita los pasos 1.2.1 a 1.2.8. El experimento se puede pausar en el paso 1.2.13 antes de comenzar el ensayo de campo abierto.

2. Ensayo de campo abierto

1. La configuración del aparato
   1. Configuración de la cámara de campo abierto: Use el mismo cubículo atenuante de sonido y la misma cámara de campo abierto utilizados en el ensayo de luz / oscuridad, sin usar el inserto oscuro.
   2. Configuración del panel de luz: Utilice la misma configuración utilizada en el ensayo de luz/oscuridad. Asegúrese de que la intensidad de la luz sea la misma que la utilizada en el ensayo de luz/oscuridad.
2. Procedimiento de prueba de comportamiento
   1. Encienda el aparato. Ajuste la intensidad de la luz a 27.000 lux.
   2. Abra el software de seguimiento.
   3. Configure un nuevo protocolo, el mismo que se usa en el ensayo de luz/oscuridad, excepto para la configuración de Nueva zona . Elija 1 seguido del Centro en la configuración de Nueva zona . Establezca la periferia a 3,97 cm del perímetro y el centro como 19,05 × 19,05 cm.
   4. Habitúe a los ratones a la sala de pruebas como se describe en el paso 1.2.4.
   5. Administrar CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g en función del peso corporal del ratón, i.p.), inclinando la cabeza del ratón hacia adelante e inyectando en el cuadrante inferior derecho. Devuelva el ratón a la jaula de casa.
   6. Después de 30 minutos, inicie el protocolo. Tire del cajón extraíble fuera del cubículo atenuante del sonido y coloque suavemente el ratón en el centro de la cámara de campo abierto. Empuje el cajón dentro del cubículo.
   7. Seguimiento del comportamiento durante 30 min. Luego devuelva a los ratones a sus jaulas domésticas.
   8. Limpie el aparato como se describe en el paso 1.2.8.

3. Ensayo de luz/oscuridad modificado para ratones optogenéticos

1. La configuración del aparato
   1. Realice dos modificaciones en el inserto oscuro.
      1. Modifique la abertura del inserto oscuro a 5,08 x 5,08 cm (ancho x alto) con una pequeña hendidura de 0,95 x 10,16 cm (ancho x alto) entre la parte superior y la abertura del inserto oscuro (Figura 1D superior izquierda).
         NOTA: Esta modificación permite que un ratón vaya a la zona oscura sin dificultad cuando la cánula de fibra óptica en la cabeza del ratón está unida al cable de conexión.
      2. Extienda la parte superior del inserto oscuro sobre el área de luz como un porche triangular (H = 6,5 cm) (Figura 1D arriba a la derecha e abajo a la izquierda). Corte un orificio circular (D = 1,7 cm) fuera del porche e inserte un soporte en el orificio para colocar y estabilizar la junta rotativa, que conecta el láser y los cables de conexión de fibra óptica (Figura 1D arriba a la izquierda e abajo a la izquierda).
         NOTA: Las modificaciones resultan en un pequeño cambio en la intensidad de la luz que llega al piso de la zona oscura (17 lux con modificaciones vs 14 lux sin modificaciones, medidos en la esquina posterior derecha de la zona oscura por debajo de 27,000 lux).
   2. Inserte la junta giratoria en el soporte del inserto oscuro.
   3. Conecte el cable de conexión de fibra óptica de 30,5 cm a la articulación rotativa. Confirme que la articulación giratoria puede girar suavemente para que el cable de conexión pueda girar sin dificultad a medida que el ratón atraviesa la cámara.
   4. Para el resto de la configuración, utilice la misma configuración del aparato que se utiliza en la sección 1 (ensayo de luz/oscuridad).
2. Procedimiento de prueba de comportamiento
   NOTA: A diferencia de los ratones de tipo salvaje, los ratones optogenéticos no reciben preexposiciones (pretratamiento 1 y 2).
   1. El día de la prueba, inserte el panel de luz LED en la segunda ranura más baja (a 28,23 cm del piso de la cámara) para dejar espacio para conectar el cable de conexión. Encienda el aparato de ensayo de luz/oscuridad y ajuste la intensidad de la luz a 55 lux.
   2. Utilice la misma configuración de protocolo que la de 1.2.2 y 1.2.3, excepto que las bandejas de datos por duración se establecen en 60 s en la configuración Nuevo análisis para que sean congruentes con el protocolo de estimulación láser del paso 3.2.3.
   3. Encienda el botón de encendido del láser. Ajuste el controlador de pulso láser para estimular durante 1 minuto seguido de 1 minuto sin estimulación durante 30 minutos.
   4. Habitúe a los ratones a la sala de pruebas con la luz encendida durante 1 h antes de la prueba.
   5. Inicie el protocolo. Tire del cajón extraíble fuera del cubículo atenuante del sonido para acceder a la cámara de luz/oscuridad y al inserto oscuro.
   6. Sujete suavemente el ratón y acople la cánula de fibra óptica de la cabeza del ratón al cable de conexión de fibra óptica a través de una funda de acoplamiento (Figura 1D abajo a la derecha). Coloque el ratón suavemente en la zona de luz y empuje el cajón dentro del cubículo. Asegúrese de que el protocolo comenzará a registrar el comportamiento del mouse automáticamente.
   7. A 1 minuto, encienda el controlador de pulso y luego gire la tecla a prueba de fallos a ON. Asegúrese de que la estimulación con láser de la región cerebral objetivo se produzca cada dos minutos.
   8. Después de 30 minutos, cuando el protocolo se detiene automáticamente, gire la tecla a prueba de fallos a OFF. A continuación, apague el controlador de pulsos.
   9. Desacople el ratón y el cable de conexión de fibra óptica. Devuelva el ratón a la jaula de casa.
   10. Limpie la cámara y el inserto oscuro como se describe en el paso 1.2.8.

4. Ensayo de campo abierto modificado para ratones optogenéticos

1. La configuración del aparato
   1. Estabilice la junta giratoria por encima de la cámara utilizando un soporte y una abrazadera (Figura 1E).
   2. Conecte el cable de conexión de fibra óptica con una longitud de 50 cm a la articulación rotativa. Compruebe si la articulación giratoria puede girar suavemente.
   3. Ajuste la junta giratoria a la altura adecuada en el soporte: asegúrese de que el cable de conexión de fibra óptica solo pueda llegar a todos los rincones de la cámara, lo que ayudará a evitar cualquier interferencia con el movimiento del mouse.
   4. Para el resto de la configuración, utilice la misma configuración del aparato que se utiliza en la sección 1 (ensayo de luz/oscuridad), pero sin el inserto oscuro.
2. Procedimiento de prueba de comportamiento
   1. Encienda el aparato de ensayo de luz/oscuridad y ajuste la intensidad de la luz a 55 lux.
   2. Utilice la misma configuración de protocolo que la del ensayo de luz/oscuridad modificado (sección 3), excepto para la configuración de Nueva zona . Elija 1 siguiendo por Centro en la configuración de Nueva zona . Establezca la periferia a 3,97 cm del perímetro y el centro como 19,05 × 19,05 cm.
   3. Encienda el botón de encendido del láser. Ajuste el controlador de pulso láser para estimular durante 1 minuto seguido de 1 minuto sin estimulación durante 30 minutos.
   4. Realizar la habituación y el resto de la prueba como se describe en los pasos 3.2.4 a 3.2.10 excepto por dos cambios en el paso 3.2.6: coloque el ratón suavemente en el centro de la cámara en lugar de la zona de luz; Mantenga el cajón extraíble fuera del cubículo debido a que el cable de conexión se conecta a la cabeza del mouse.

Resultados

Este paradigma de prueba de comportamiento está diseñado para probar el comportamiento aversivo de la luz. Se puede realizar utilizando ratones de tipo salvaje ingenuos y ratones optogenéticos para investigar la aversión a la luz en tiempo real durante la estimulación de una población neuronal objetivo.

Este procedimiento se ha utilizado para estudiar el efecto del tratamiento periférico con CGRP en ratones CD1 y C57BL/^6J10,16 y...

Discusión

El ensayo de luz/oscuridad es ampliamente utilizado para evaluar el comportamiento similar a la ^ansiedad12. El ensayo se basa en la aversión innata de los ratones a la luz y su impulso para explorar cuando se colocan en un entorno novedoso (zona de luz). Sin embargo, como informamos aquí, este ensayo también se puede utilizar para evaluar el comportamiento aversivo de la luz.

Es fundamental considerar el número y la necesidad de preexposiciones antes de las pruebas....

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Activity monitor	Med Assoc. Inc		Software tracking mouse behavior
Customized acrylic shelf			For adjusting the height of the LED panel
Dark box insert	Med Assoc. Inc	ENV-511
DC power supply	Med Assoc. Inc	SG-500T
DC regulated power supply	Med Assoc. Inc	SG-506
Fiber-optic cannula	Doric	MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT
Germicidal disposable wipes	Sani-Cloth	SKU # Q55172
Heat Sink	Wakefield	490-6K	Connecting to LED panel
IR controller power cable	Med Assoc. Inc	SG-520USB-1
IR USB controller	Med Assoc. Inc	ENV-520USB
Mating sleeve	Doric	SLEEVE_ZR_1.25
Modified LED light panel	Genaray Spectro	SP-E-360D	Daylight-balanced color (5600K)
Power supply	MEAN WELL USA	SP-320-12	Connecting to LED panel
Seamless open field chamber	Med Assoc. Inc	ENV-510S
Sound-attenuating cubicle	Med Assoc. Inc	ENV-022MD-027
Stand and clamp
Three 16-beam IR arrays	Med Assoc. Inc	ENV-256