JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.
Method Article
설치류는 편두통 증상을보고 할 수 없습니다. 여기에서는 편두통 환자에서 가장 흔하고 귀찮은 증상 중 하나 인 가벼운 혐오감을 측정하기위한 관리 가능한 테스트 패러다임 (빛 / 어둠 및 개방 필드 분석)을 설명합니다.
편두통은 광공포증으로 관찰되는 빛에 대한 과민증과 같은 두통과 감각 이상을 특징으로하는 복잡한 신경 장애입니다. 마우스가 편두통을 겪고 있는지 확인하는 것은 불가능하지만 가벼운 혐오감은 광공포증의 편두통 증상에 대한 행동 대리자로 사용될 수 있습니다. 가벼운 혐오감을 테스트하기 위해, 우리는 밝은 / 어두운 분석을 사용하여 마우스가 밝거나 어두운 환경에서 자유롭게 보내는 시간을 측정합니다. 이 분석은 테스트 절차를 실행하기 전에 챔버에 사전 노출되고 조정 가능한 챔버 조명의 두 가지 중요한 수정을 도입하여 개선되었으며 55lux에서 27,000lux까지의 다양한 광도를 사용할 수 있습니다. 어둠 속에서 더 많은 시간을 보내는 선택은 불안을 나타내기 때문에, 우리는 또한 불안과 가벼운 혐오스러운 행동을 구별하기 위해 빛에 독립적 인 불안 테스트 인 오픈 필드 분석을 사용합니다. 여기에서는 밝은/어둡고 개방된 필드 분석에 대한 수정된 테스트 패러다임을 설명합니다. 이들 분석의 적용은 두 개의 마우스 균주에서 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP)의 복강내 주사 및 광유전학적 뇌 자극 연구를 위해 기술된다.
편두통은 널리 퍼진 신경 질환으로 미국인의 약 17 %에 영향을 미치며1 전 세계적으로 장애의 두 번째 주요 원인입니다2,3. 환자는 메스꺼움 및 / 또는 구토, 또는 광공포증 및 음파 공포증4 중 적어도 하나의 증상과 함께 4-72 시간 지속되는 두통을 경험합니다. 현재 FDA가 승인한 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP) 항체 개발의 최근 발전은 편두통 치료의 새로운 시대를 열었습니다5,6,7. 이 항체는 CGRP 또는 그 수용체를 차단하고 편두통 환자의 약 50 %에서 편두통 증상을 예방합니다7. 지난 한 해 동안, CGRP 수용체의 두 개의 소분자 길항제는 편두통의 중단 치료를 위해 FDA 승인을 받았으며 두 개 이상의 파이프 라인에 있습니다8. 이러한 치료 진행에도 불구하고 편두통 발작이 발생하는 메커니즘은 여전히 애매합니다. 예를 들어, CGRP 동작의 사이트는 알려져 있지 않다. 혈액 뇌 장벽을 상당히 넘지 않는 치료 항체의 효능은 CGRP가 수막 및 / 또는 삼차 신경절과 같은 말초 부위에서 작용한다는 것을 암시합니다. 그러나 우리는 혈액 - 뇌 장벽이 부족한 원주 심실 기관에서의 중심 행동을 배제 할 수 없습니다9. 적어도 광공포증의 경우, 우리는 hRAMP1이 신경 조직에서 과발현되는 트랜스제닉 네스틴/hRAMP1 마우스를 사용한 가벼운 혐오감으로 인한 결과를 고려할 때 이것이 덜 가능하다고 생각합니다10. 편두통 병리 생리학의 메커니즘을 이해하는 것은 편두통 치료제의 개발에 새로운 길을 제공 할 것입니다.
전임상 동물 모델은 질병 메커니즘과 신약 개발을 이해하는 데 중요합니다. 그러나 동물의 편두통 평가는 동물이 통증에 대한 감각을 구두로보고 할 수 없기 때문에 어렵습니다. 편두통 환자의 80-90 %가 광공포증11을 나타낸다는 사실을 감안할 때, 가벼운 혐오감은 동물 모델에서 편두통의 지표로 간주됩니다. 이로 인해 마우스의 빛 혐오감을 평가하기위한 분석법을 개발해야했습니다.
밝은/어두운 분석에는 밝은 영역과 어두운 영역이 포함되어 있습니다. 그것은 빛에 대한 타고난 혐오감에 의해 상쇄되는 새로운 환경에 대한 자발적인 탐구를 기반으로 생쥐의 불안을 측정하는 데 널리 사용됩니다12. 일부 연구는 챔버의 1/3을 어두운 영역으로 설정하고 다른 연구는 챔버의 1/2을 어두운 영역으로 설정합니다. 이전 설정은 종종 불안을 감지하는 데 사용됩니다13. 처음에는 동일한 크기의 밝은 / 어두운 챔버를 선택했지만 두 개의 상대 크기를 비교하지는 않았습니다. 우리는 초기 테스트 박스(14 )가 후속 장치15보다 상당히 컸기 때문에 두 챔버의 전체 크기가 주요 요인이 아니라는 것을 언급할 수 있지만, 결과는 본질적으로 동일하였다.
빛 혐오감을 평가하기 위한 이 밝은/어두운 분석의 두 가지 중요한 수정은 테스트 조건과 광도였습니다(그림 1). 첫째, 마우스는 탐사 구동을 줄이기 위해 밝은/어두운 챔버에 사전 노출된다(그림 1A). 사전 노출의 필요성과 시간은 마우스 균주 및 모델에 따라 다릅니다. 야생형 C57BL/6J 마우스는 보통 두 번의 사전 노출이 필요하지만10, CD1 마우스에 대한 사전 노출은 단 한 개만 있으면 충분합니다17. 이러한 방식으로, 광-혐오스러운 거동은 이들 두 마우스 균주에서 마스킹되지 않을 수 있다. 둘째, 챔버 조명은 어두운 흐린 날과 비교할 수있는 희미한 (55 럭스)에서 밝은 (27,000 럭스)까지 조정 가능한 범위의 광도를 포함하도록 조정되었으며, 27,000 럭스는 그늘에서 밝고 화창한 날과 비슷합니다10. 우리는 필요한 빛의 강도가 균주와 유전 모델에 따라 다르다는 것을 발견했습니다. 이러한 이유로 개인은 먼저 실험 패러다임에 대한 최소 광도를 평가해야합니다.
가벼운 혐오스러운 표현형을 나타낼 수있는 분석법에 대한 이러한 수정에도 불구하고, 빛만으로 인한 빛 혐오감과 불안으로 인한 빛의 혐오감을 구별하기 위해 불안과 같은 행동을 테스트 할 필요가 있습니다. 개방형 필드 분석은 새로운 환경의 자발적인 탐구를 기반으로 불안을 측정하는 전통적인 방법입니다. 그것은 탐험 드라이브가 보호되지 않은 열린 공간에 대한 타고난 혐오감에 의해 반대된다는 점에서 빛 / 어둠 분석과 다릅니다. 챔버의 중심과 가장자리는 모두 빛에 있으므로 개방 필드 분석은 빛에 독립적 인 불안 분석입니다. 따라서, 빛/어둠 및 개방장 분석의 조합은 우리가 빛의 회피로 인한 빛의 혐오감과 불안의 전반적인 증가로 인한 빛의 혐오감을 구별할 수 있게 해준다.
CGRP는 혈관 확장, nociception 및 염증을 조절하는 다기능 신경 펩티드입니다18. 그것은 말초 및 중추 신경계에서 널리 발현됩니다. 편두통 병태생리학18에서 중요한 역할을 한다. 그러나 편두통에서 CGRP 작용의 기초가되는 메커니즘은 명확하지 않습니다. 이 변형된 테스트 패러다임과 함께 밝은/어둡고 개방된 필드 분석을 활용함으로써, 우리는 peripheral10,16(그림 2) 및 central14,15,16,19 CGRP 투여 후 마우스에서 광혐오적 거동을 확인할 수 있었습니다. 신경 펩티드 이외에, 가벼운 혐오감에 관여하는 뇌 영역의 확인은 편두통 병리 생리학을 이해하는 데에도 중요합니다. 후부 시상 핵은 통증과 가벼운 처리를위한 통합 뇌 영역이며19, 시상은 편두통 동안 활성화됩니다20. 따라서, 우리는 채널로돕신-2 (ChR2) 또는 eYFP를 함유하는 아데노 관련 바이러스 (AAV)를 이 영역에 주입함으로써 후부 시상 핵을 표적으로 삼았다. 이 광유전학적 접근법을 이들 두 분석법과 결합함으로써, 우리는 후부 시상 핵에서 ChR2 발현 뉴런의 광학 자극이 광 혐오감을 유도한다는 것을 입증하였다19 (도 3). 이 실험에서, 이들 광유전학적으로 조작된 마우스에서 유발된 광 혐오감에 대한 극적인 효과를 감안할 때, 챔버에 대한 사전 노출은 생략되었다.
동물 절차는 아이오와 대학 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며 국립 보건원 (National Institutes of Health)이 정한 표준을 준수하여 수행되었습니다.
1. 빛/어두운 분석
2. 개방 필드 분석
3. 광유전학 마우스에 대한 변형된 광/어두운 분석
4. 광유전학 마우스에 대한 변형된 개방장 분석
이 행동 테스트 패러다임은 가벼운 혐오스러운 행동을 테스트하도록 설계되었습니다. 순진한 야생형 마우스와 광유전학 마우스 모두를 사용하여 표적 뉴런 집단의 자극 동안 실시간으로 빛 혐오감을 조사할 수 있다.
이 절차는 CD1 및 C57BL/6J 마우스10,16에서 말초 CGRP 치료의 효과와 C57BL/6J 마우스19의 후부 시상 핵에...
빛/어둠 분석은 불안과 같은 행동을 평가하기 위해 널리 사용됩니다12. 이 분석은 빛에 대한 생쥐의 타고난 혐오감과 새로운 환경 (조명 영역)에 배치 될 때 탐구하려는 욕구에 의존합니다. 그러나 여기에서보고 한 바와 같이이 분석은 가벼운 혐오스러운 행동을 평가하는 데에도 사용할 수 있습니다.
테스트 전에 사전 노출의 수와 필요성을 고려하는 것이 중?...
저자는보고 할 이해 상충이 없습니다.
이 작업은 NIH NS R01 NS075599 및 RF1 NS113839의 보조금으로 지원되었습니다. 내용은 VA 또는 미국 정부의 견해를 대표하지 않습니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Activity monitor | Med Assoc. Inc | Software tracking mouse behavior | |
Customized acrylic shelf | For adjusting the height of the LED panel | ||
Dark box insert | Med Assoc. Inc | ENV-511 | |
DC power supply | Med Assoc. Inc | SG-500T | |
DC regulated power supply | Med Assoc. Inc | SG-506 | |
Fiber-optic cannula | Doric | MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT | |
Germicidal disposable wipes | Sani-Cloth | SKU # Q55172 | |
Heat Sink | Wakefield | 490-6K | Connecting to LED panel |
IR controller power cable | Med Assoc. Inc | SG-520USB-1 | |
IR USB controller | Med Assoc. Inc | ENV-520USB | |
Mating sleeve | Doric | SLEEVE_ZR_1.25 | |
Modified LED light panel | Genaray Spectro | SP-E-360D | Daylight-balanced color (5600K) |
Power supply | MEAN WELL USA | SP-320-12 | Connecting to LED panel |
Seamless open field chamber | Med Assoc. Inc | ENV-510S | |
Sound-attenuating cubicle | Med Assoc. Inc | ENV-022MD-027 | |
Stand and clamp | |||
Three 16-beam IR arrays | Med Assoc. Inc | ENV-256 |
JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기
허가 살펴보기This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유