使用轻度厌恶研究小鼠偏头痛样行为

摘要

啮齿动物无法报告偏头痛症状。在这里，我们描述了一种可管理的测试范例（光/暗和开放场测定）来测量光厌恶，这是偏头痛患者最常见和最麻烦的症状之一。

摘要

偏头痛是一种复杂的神经系统疾病，其特征是头痛和感觉异常，例如对光过敏，被观察到为畏光。虽然不可能确认小鼠正在经历偏头痛，但光厌恶可以用作畏光偏头痛症状的行为替代品。为了测试光厌恶，我们利用光/暗测定来测量小鼠自由选择在光明或黑暗环境中度过的时间。通过引入两个关键的修改来完善该测定:在运行测试程序之前预先暴露到腔室和可调节的腔室照明，允许使用从55勒克斯到27，000勒克斯的光强度范围。因为选择在黑暗中花更多时间也表明焦虑，所以我们也利用一种与光无关的焦虑测试，即开放场测定，来区分焦虑和光厌恶行为。在这里，我们描述了用于明场/暗场和开放场测定的改进测试范例。描述了这些测定在两种小鼠品系中腹腔内注射降钙素基因相关肽（CGRP）和光遗传学脑刺激研究的应用。

引言

偏头痛是一种普遍存在的神经系统疾病，影响约 17% 的美国人¹ ，是全球第二大残疾原因^2，3。患者会出现持续 4-72 小时的头痛，并伴有以下至少一种症状:恶心和/或呕吐，或畏光和恐音⁴。目前FDA批准的降钙素基因相关肽（CGRP）抗体的开发进展已经开始了偏头痛治疗的新时代^5，6，7。这些抗体可阻断 CGRP 或其受体，并预防约 50% 偏头痛患者的偏头痛症状⁷。在过去的一年中，CGRP受体的两种小分子拮抗剂也被FDA批准用于远头痛的流产治疗，还有两种正在筹备中⁸。尽管取得了这种治疗进展，但偏头痛发作发生的机制仍然难以捉摸。例如，CGRP 操作的站点是未知的。不能明显穿过血脑屏障的治疗性抗体的功效表明CGRP作用于外周部位，例如脑膜和/或三叉神经节。然而，我们不能排除脑室外器官的中枢作用，这些器官缺乏血脑屏障⁹。至少对于畏光症，我们认为这不太可能，因为我们的结果是使用转基因巢蛋白/ hRAMP1小鼠的光厌恶，其中hRAMP1在神经组织中过度表达¹⁰。了解偏头痛病理生理学的机制将为偏头痛治疗药物的发展提供新的途径。

临床前动物模型对于了解疾病机制和新药开发至关重要。然而，动物的偏头痛评估具有挑战性，因为动物不能口头报告它们的疼痛感。鉴于 80-90% 的偏头痛患者表现出畏光¹¹，在动物模型中，光厌恶被认为是偏头痛的指标。这导致需要开发一种测定方法来评估小鼠的光厌恶。

浅色/暗度测定包含一个亮区和一个暗区。它被广泛用于测量小鼠的焦虑，基于它们对新环境的自发探索，而它们对光的天生厌恶¹²。一些研究将房间的1/3设置为暗区，而另一些研究则将室的1/2设置为暗区。前一种设置通常用于检测焦虑¹³。虽然我们最初选择了大小相等的明暗室，但我们没有比较两种相对大小。我们可以评论说，两个腔室的整体尺寸并不是一个主要因素，因为最初的测试盒¹⁴ 比随后的设备¹⁵大得多，但结果基本上是相同的。

对这种光/暗测定法的两个关键修改是评估光厌恶:测试条件和光强度（图1）。首先，将小鼠预先暴露于明/暗室以减少探索性驱动¹⁶ （图1A）。预暴露的必要性和时间取决于小鼠品系和模型。野生型C57BL / 6J小鼠通常需要两次预暴露¹⁰，而CD1小鼠只需一次预暴露就足够了¹⁷。通过这种方式，可以在这两种小鼠品系中揭开光厌恶行为的掩盖。其次，腔室照明已经过调整，包括从昏暗（55勒克斯）到明亮（27，000勒克斯）的可调节光强度范围，其中55勒克斯相当于黑暗的阴天，27，000勒克斯相当于阴凉处的晴天¹⁰。我们发现所需的光强度随菌株和遗传模型而变化。因此，个人应首先评估其实验范式的最小光强度。

即使对测定进行这些修改，可以揭示光厌恶表型，也有必要测试焦虑样行为，以区分仅由于光和由于焦虑引起的光厌恶。露天田间测定是基于对新环境的自发探索来测量焦虑的传统方法。它与光/暗测定的不同之处在于，探索性驱动力被对未受保护的开放空间的天生厌恶所抵消。腔室的中心和边缘都在光中，因此开放场测定是一种与光无关的焦虑测定。因此，光/暗和开放场测定的结合使我们能够区分由于避免光而引起的光厌恶与焦虑的整体增加。

CGRP 是一种多功能神经肽，可调节血管舒张、伤害感受和炎症¹⁸。它在周围和中枢神经系统中广泛表达。它在偏头痛病理生理学中起重要作用¹⁸。然而，偏头痛中CGRP作用的机制尚不清楚。通过利用这种改进的测试范式的亮/暗和开放场测定，我们能够在外周10^，16（图2）和^central14，^15，16，19 CGRP给药后鉴定小鼠的光厌恶行为。除神经肽外，识别与光厌恶有关的大脑区域对于理解偏头痛病理生理学也很重要。丘脑后核是用于疼痛和光处理的脑部综合区域¹⁹，丘脑在偏头痛期间被激活²⁰。因此，我们通过将含有通道视紫红质-2（ChR2）或eYFP的腺相关病毒（AAV）注射到该区域来靶向丘脑后核。通过将这种光遗传学方法与这两种测定相结合，我们证明了对丘脑后核中表达ChR2的神经元的光学刺激诱导了光厌恶¹⁹（图3）。在这个实验中，考虑到这些光遗传学操纵的小鼠对诱发的光厌恶的显着影响，跳过了对腔室的预暴露。

研究方案

动物程序由爱荷华大学动物护理和使用委员会批准，并按照美国国立卫生研究院制定的标准进行。

1. 光/暗分析

1. 亮/暗室装置（见 材料表）设置。本节中的所有设备均为市售设备。
   1. 在搁板上，放置声音衰减隔间（内部:59.7 x 38 x 35.6 厘米，宽 x 高 x 深），其中包含一个拉出式抽屉，便于进入腔室和深色插件。
   2. 将直流电源和直流稳压电源连接到声音衰减隔间。
   3. 将透明的无缝开放式场地腔室（长 x 宽 x 高 27.31 x 20.32 厘米）放在隔间的拉出式抽屉上。
   4. 将黑色红外 （IR） 透明塑料深色嵌件（长 x 宽 x 高 28.7 X 15 X 20.6 厘米）放入开放式现场腔室中。确保将腔室分为两个大小相等的区域:暗区和亮区。
   5. 通过电缆将开放式现场腔室 X、Y 和 Z 轴上的三组 16 波束红外阵列连接到红外 USB 控制器。
   6. 将红外 USB 控制器连接到计算机。
   7. 在计算机上安装跟踪软件，该软件可以记录和收集鼠标的位置和活动。
   8. 对于照明面板设置，首先从其原始外壳中取出发光二极管（LED）灯面板（长27.70 x 27.70厘米;360个LED，日光平衡颜色，5600K，60°泛光光束扩散）。
   9. 将灯面板与 LED 驱动器、散热器和电源组装在一起。多个LED灯面板可以连接到一个电源，散热器和LED驱动器，以实现均匀的光面板控制。
   10. 构建一个定制的亚克力平台（长x宽x高29.77 x 27.70 x 8.10厘米），由7个相同的搁板组成，间隔为0.53厘米（图1B）。将定制的亚克力搁板永久固定在房间上方隔间内的天花板上。
   11. 将 LED 指示灯面板插入底部两个托架之间的插槽中。如有必要，将灯板调整到不同的高度（图1B，C），例如，如果使用光遗传学小鼠。细节在第 3 节中讨论）。
   12. 打开散热器、LED 驱动器和电源。确认 LED 驱动器可以通过测量房间地板上的光强度来指示 LED 灯强度，并确认地板是否均匀点亮。
2. 行为测试程序
   注意:将小鼠置于12小时的光周期中。所有行为实验都是在光周期期间进行的。使用小鼠，包括10-20周龄的雄性和雌性。在该协议中，幼稚的野生型CD1和C57BL / 6J小鼠经历两次预暴露于明/暗室，然后进行治疗和治疗后暴露。每次暴露之间有三天的间隔，以使小鼠恢复（第1天，第4天，第7天和第10天，如下所述， 图1A）。然而，CD1小鼠不需要^第二次 预暴露，可以在昏暗的光线下进行测试。
   1. 在第1天（预处理1），打开明暗检测设备并将光强度设置为27，000勒克斯。
   2. 打开跟踪软件并设置新协议。在 "新建协议" 设置中，将 "持续时间" 设置为 30 分钟。在 "新建分析 "设置中，将 "按持续时间划分的数据箱 "设置为 300 秒。
   3. 在 "新建区域"设置中 ，选择 "预定义区域"。选择 2 ，然后选择 水平。检查腔室是否水平分为两个大小相等的区域以进行记录。
   4. 在测试前将小鼠习惯到测试室1小时。在习惯期间，保持房间灯亮着，以免扰乱小鼠的昼夜节律。确保用于光/暗分析的所有设备都已打开，使小鼠完全适应测试室环境。
   5. 选择" 获取数据"。输入鼠标 ID。启动协议。
   6. 将抽屉拉出声音衰减隔间外，以进入亮/暗室和深色插件。轻轻地拿起尾巴底部的鼠标，将其放在腔室的光照区域，然后将抽屉推入隔间内。确保软件立即检测到鼠标并开始记录活动。
   7. 等待录制在30分钟后自动停止。将鼠标放回其家庭笼子。
   8. 使用含有55.0%异丙醇，0.25%烷基C12-18二甲基乙基苄基铵和0.25%烷基C12-18二甲基苄基氯化铵的醇味杀菌一次性湿巾清洁腔室和深色插入物作为抗菌活性成分，以消除先前小鼠留下的任何嗅觉线索。
   9. 在第4天（预处理2），重复步骤1.2.1至1.2.8。
   10. 在第7天（治疗日），重复步骤1.2.1和1.2.4。习惯化后，施用CGRP（0.1mg / kg，基于小鼠体重的10μl/ g，腹膜内注射（ip）），将小鼠的头部向前倾斜并在右下象限注射。将鼠标放回家庭笼子。
   11. 30分钟后，启动实验方案，并按照步骤1.2.5至1.2.7所述在明暗室中运行鼠标。注射后家用笼子的恢复时间可以缩短或延长，具体取决于治疗^方案21。
   12. 按照步骤1.2.8中所述清洁腔室和深色插入物。
   13. 在第10天（治疗后一天），重复步骤1.2.1至1.2.8。在开始露天测定之前，实验可以在步骤1.2.13处暂停。

2. 露天检测

1. 设备设置
   1. 开放式现场腔室设置:使用与亮/暗分析中使用的相同声衰减隔间和开放式现场腔室，而无需使用深色插入物。
   2. 浅色面板设置:使用与亮/暗分析中使用的相同设置。确保光强度与光/暗分析中使用的光强度相同。
2. 行为测试程序
   1. 打开设备。将光强度设置为 27，000 勒克斯。
   2. 打开跟踪软件。
   3. 设置新方案，与亮/暗分析中使用的方案相同，但新区域设置除外。选择 1，然后选择"新建区域"设置中的"中心"。将外围设置为距周长 3.97 厘米，中心设置为距周边 19.05 × 19.05 厘米。
   4. 按照步骤1.2.4中所述将小鼠习惯到测试室。
   5. 给予CGRP（0.1mg / kg，10μl / g，基于小鼠体重，ip），将小鼠头部向前倾斜并在右下象限注射。将鼠标放回家庭笼子。
   6. 30分钟后，启动实验方案。将拉出式抽屉拉出到声音衰减隔间外，轻轻地将鼠标放在打开的场室中间。将抽屉推入隔间内。
   7. 跟踪行为 30 分钟。然后将老鼠放回家笼。
   8. 按照步骤1.2.8中所述清洁设备。

3. 光遗传学小鼠的改良光/暗检测

1. 设备设置
   1. 对深色插入件进行两次修改。
      1. 将深色刀片的开口修改为 5.08 x 5.08 cm（宽 x 高），顶部和深色刀片开口之间有一个 0.95 x 10.16 cm （W X H） 的小狭缝（图 1D 左上角）。
         注意:此修改允许鼠标在将鼠标头上的光纤套管连接到跳线时毫无困难地进入暗区。
      2. 将深色嵌件的顶部延伸到浅色区域，作为三角形门廊（H = 6.5厘米）（图1D 右上角和左下角）。从门廊上切出一个圆形孔（D = 1.7厘米），并将支架插入孔中以放置和稳定旋转接头，该接头连接激光器和光纤跳线（图1D 左上角和左下角）。
         注意:修改后到达暗区底部的光强度变化很小（修改后为17勒克斯，而未经修改的光强度为14勒克斯，在27，000勒克斯下在暗区的右后角测量）。
   2. 将旋转接头插入深色插件上的支架。
   3. 将 30.5 cm 光纤跳线连接到旋转接头。确认旋转接头可以平稳旋转，以便当鼠标穿过腔室时，跳线可以毫无困难地旋转。
   4. 对于设置的其余部分，请使用与第1部分（亮/暗测定）中使用的相同装置。
2. 行为测试程序
   注意:与野生型小鼠不同，光遗传学小鼠不接受预暴露（预处理1和2）。
   1. 在测试当天，将LED灯面板插入第二低的插槽（距离外倾角地板28.23厘米），以留出连接跳线的空间。打开亮/暗检测设备，将光强度设置为55勒克斯。
   2. 使用与 1.2.2 和 1.2.3 中相同的协议设置，只是在"新建分析"设置中将"数据箱按持续时间"设置为 60 秒，以便与步骤 3.2.3 中的激光刺激协议一致。
   3. 打开激光电源按钮。将激光脉冲控制器设置为刺激1分钟，然后在30分钟内刺激1分钟。
   4. 在测试之前，将小鼠习惯在开灯的情况下将小鼠带到测试室1小时。
   5. 启动协议。将拉出式抽屉拉出到声音衰减隔间外，以进入亮/暗室和深色插件。
   6. 轻轻地约束鼠标，并通过配接套将鼠标头上的光纤插管耦合到光纤跳线（图1D 右下角）。将鼠标轻轻放在光照区，然后将抽屉推入隔间内。确保协议将开始自动记录鼠标行为。
   7. 1 分钟后，打开脉冲控制器，然后将故障安全键转为 ON。确保每隔一分钟对目标大脑区域进行激光刺激。
   8. 30 分钟后，当协议自动停止时，将故障安全键设置为 OFF。然后关闭脉冲控制器。
   9. 断开鼠标和光纤跳线的耦合。将鼠标放回家庭笼子。
   10. 按照步骤1.2.8中所述清洁腔室和深色插入物。

4. 光遗传学小鼠的改良开放场测定

1. 设备设置
   1. 使用支架和夹具将旋转接头稳定在腔室上方（图1E）。
   2. 将长度为 50 cm 的光纤跳线连接到旋转接头。检查旋转接头是否可以平稳旋转。
   3. 将旋转接头设置到支架上适当的高度:确保光纤跳线只能刚好到达腔室的每个角落，这将有助于避免对鼠标移动的任何干扰。
   4. 对于设置的其余部分，使用与第1部分（浅/暗测定）相同的设备设置，但没有深色插入物。
2. 行为测试程序
   1. 打开亮/暗检测设备，将光强度设置为55勒克斯。
   2. 使用与修改后的明暗检测（第3节）相同的实验方案设置，但"新区域"设置除外。在新区域设置中选择 1 个"由中心跟随"。将外围设置为距周长 3.97 厘米，中心设置为距周边 19.05 × 19.05 厘米。
   3. 打开激光电源按钮。设置激光脉冲控制器刺激1分钟，然后在30分钟内刺激1分钟。
   4. 按照步骤3.2.4至3.2.10中所述执行习惯化和其余测试，除了对步骤3.2.6的两次更改:将鼠标轻轻地放在腔室的中间而不是光区;将拉出式抽屉保持在隔间外，因为跳线连接到鼠标头。

结果

此行为测试范例旨在测试光厌恶行为。它可以使用幼稚的野生型小鼠和光遗传学小鼠进行，以在刺激目标神经元群体期间实时研究光厌恶。

该程序已用于研究CD1和C57BL / 6J小鼠^10，16的外周CGRP治疗以及C57BL / 6J小鼠¹⁹中丘脑后核神经元的光学刺激对光厌恶行为的影响。实验中使用小鼠，包括10-20周龄的雄性和雌性（

讨论

浅/暗检测广泛用于评估焦虑样行为¹²。该测定依赖于小鼠对光的先天厌恶以及当放置在新环境（光区）中时探索的驱动力。然而，正如我们在这里报道的那样，这种测定也可用于评估光厌恶行为。

在测试之前考虑预先暴露的数量和必要性至关重要。这取决于小鼠品系或型号。例如，在我们的光/暗测定方案中，朴素野生型CD1和C57BL / 6J小鼠在进行治疗测试程序...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Activity monitor	Med Assoc. Inc		Software tracking mouse behavior
Customized acrylic shelf			For adjusting the height of the LED panel
Dark box insert	Med Assoc. Inc	ENV-511
DC power supply	Med Assoc. Inc	SG-500T
DC regulated power supply	Med Assoc. Inc	SG-506
Fiber-optic cannula	Doric	MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT
Germicidal disposable wipes	Sani-Cloth	SKU # Q55172
Heat Sink	Wakefield	490-6K	Connecting to LED panel
IR controller power cable	Med Assoc. Inc	SG-520USB-1
IR USB controller	Med Assoc. Inc	ENV-520USB
Mating sleeve	Doric	SLEEVE_ZR_1.25
Modified LED light panel	Genaray Spectro	SP-E-360D	Daylight-balanced color (5600K)
Power supply	MEAN WELL USA	SP-320-12	Connecting to LED panel
Seamless open field chamber	Med Assoc. Inc	ENV-510S
Sound-attenuating cubicle	Med Assoc. Inc	ENV-022MD-027
Stand and clamp
Three 16-beam IR arrays	Med Assoc. Inc	ENV-256