Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تفصل هذه الدراسة العوامل الحاسمة التي يجب مراعاتها في التصاميم التجريبية التي تشمل إناث الفئران. وبمعنى أوسع، تعمل هذه البيانات على تقليل وصمة العار والمساعدة في تطوير أدوات تشخيص وتدخل أكثر شمولا.

Abstract

تضع المنهجية الحالية نهجا قابلا للتكرار وموحدا وفعالا من حيث التكلفة لرصد الدورة الاستروسية لإناث الفئران المراهقة Sprague Dawley (SD). توضح هذه الدراسة مدى تعقيد الدورات الهرمونية والطيف الواسع من الفهم المطلوب لبناء تقنية مراقبة موثوقة وصالحة. ومن خلال دراسة متعمقة للتصميم التجريبي الرئيسي والعناصر الإجرائية، يوفر هذا الوصف للدورة ومبادئها الأساسية إطارا لمزيد من الفهم وتفكيك المفاهيم الخاطئة لتكرارها في المستقبل.

جنبا إلى جنب مع مخطط لعملية جمع العينات التي تستخدم غسل المهبل ، يصف الإجراء آلية تصنيف البيانات في نموذج من أربع مراحل من proestrus ، شبق ، metestrus ، و diestrus. تتميز هذه المراحل بنهج مقترح جديد ، باستخدام محددات تصنيف 4 لحالة السائل المهبلي ، ونوع (أنواع) الخلايا الموجودة ، وترتيب الخلايا ، وكمية الخلية في وقت الجمع. يتم تقديم الاختلافات في كل مرحلة ، والعينات المواتية وغير المواتية ، والتمييز بين الدورية واللادورية ، والصور البيانية لمكونات التصنيف التي تم جمعها جنبا إلى جنب مع الممارسات التفسيرية والتنظيمية الفعالة للبيانات. وعموما، تسمح هذه الأدوات بنشر نطاقات بيانات قابلة للقياس الكمي لأول مرة، مما يؤدي إلى توحيد عوامل التصنيف عند تكرارها.

Introduction

مساهمات جديدة
تم تحديد دورة استروس القوارض كمؤشر أساسي للعافية. ومع ذلك ، فإن التحيزات اللاواعية للمحققين والتفسيرات غير الدقيقة فيما يتعلق بالجسد الأنثوي تعيق المجتمع العلمي. إن أصل كلمة "estrous" ينطوي على شعور بالدونية والسلبية. استخدم يوريبيدس المصطلح لوصف "الجنون" أو الجنون ، وهوميروس لوصف الذعر ، وأفلاطون لوصف الدافع غير العقلاني. تسلط هذه الدراسة الضوء على كيفية تأثير هذه المنظورات البدائية على المجتمع العلمي الحالي وتعالج هذه المخاوف من خلال نموذج فسيفساء جديد - وهو مزيج محدث من الأساليب التي تمت دراستها سابقا ، وتم توسيعها في نطاق نهج أكثر شمولا.

ودراسة هذه التقنية واستخدامها ضروريان، أولا، نظرا لعدم وجود تقنية رصد موحدة وشاملة، ويمكن أن تكون ممارسات تفسير البيانات غير واضحة. ثانيا ، على الرغم من أن خصائص دورة estrous تعتمد على الفئران الفردية التي تتم دراستها ، إلا أنها غالبا ما تكون عالمية. ثالثا ، في حين أن الدورات الهرمونية هي عمليات روتينية ومفيدة ، إلا أنها محاطة بوصمة عار خطيرة تم استكشافها في قسم "الترجمة إلى البشر". تهدف هذه الدراسة إلى معالجة هذه القضايا الثلاث بثلاث طرق - (أ) من خلال وصف تقنية مراقبة دورة استروس متعمقة وتوضيح كيفية تفسير النتائج ، (ب) من خلال تحديد الطرق التي تحافظ على سلامة وفردية كل دورة ، و (ج) من خلال لفت الانتباه إلى المفاهيم الخاطئة التي تديم الممارسات غير المثبتة.

هذه الدراسة فريدة من نوعها أيضا في تركيزها على الفئران المراهقة ، وهي فترة تميزت بتغيرات تنموية حاسمة تلقي الضوء على مختلف المظاهر السلوكية والتشريحية والفسيولوجية في مرحلة البلوغ1. إن بناء تصميم تجريبي موحد لمراقبة الدورات الهرمونية في مجموعة سكانية لم يتم بحثها بشكل كاف مع تفكيك التحيزات الشائعة سيسمح بتطوير ارتباطات هرمونية موثوقة وصالحة2،3،4 وتحديد اضطرابات الدورة المعتمدة على الحالة5،6،7،8،9،10 . في نهاية المطاف ، تعمل هذه المستجدات على توسيع معايير التشخيص والعلاجات والتدخلات لمختلف المخاوف الصحية.

التعاريف والاستخدامات الأساسية
دورة estrous هي مجموعة من العمليات الفسيولوجية الديناميكية التي تحدث استجابة لهرمونات الستيرويد الجنسية الأنثوية الثلاثة المتذبذبة: استراديول ، هرمون leuteinizing (LH) ، والبروجسترون (الشكل 1A ، B). التفاعلات بين الغدد الصماء والجهاز العصبي المركزي تنظم الدورة ، والتي غالبا ما تستمر لمدة 4-5 أيام وتتكرر من بداية النضج الجنسي حتى الشيخوخة الإنجابية و / أو التوقف. وهي مقسمة إلى فئات منفصلة بناء على مستويات الهرمونات - الأكثر شيوعا في 4 مراحل من diestrus (DIE) ، proestrus (PRO) ، شبق (EST) ، و metestrus (MET) ، والتي تتطور بطريقة دائرية. يمكن أن يتراوح عدد الأقسام من 3 مراحل11 إلى 13 مرحلة 12 ، اعتمادا على طبيعة الدراسة13. وغالبا ما يستبعد العدد الأدنى من الشعب برنامج العمل المتعدد الأطراف كمرحلة ويصنفه على أنه فترة انتقالية قصيرة الأجل. يتضمن العدد الأكبر عادة أقساما فرعية تسمح بإجراء فحص دقيق لظواهر مثل تطور الورم أو الحمل الكاذب التلقائي ، والحالة الفسيولوجية للحمل دون زرع جنيني12،14،15.

في هذه الدراسة ، تم تحديد المراحل من خلال مكونات القناة المهبلية ، وسميت 3 محددات تصنيف - نوع (أنواع) الخلايا الموجودة ، وترتيب الخلايا ، وكمية الخلية (الشكل 2A-D). في حين لم يتم رصد حالة السائل المهبلي في هذه الدراسة ، فمن المستحسن إدراجه كمكون تصنيف رابع. يمكن العثور على مزيد من المعلومات حول فحص السائل المهبلي في القائمة المرجعية16. يمكن فحص مكونات التصنيف عن طريق استخراج الخلايا عن طريق غسل المهبل ، وهي التقنية الأساسية الموصى بها في مراقبة دورة استروس في العصر الحديث. في حين أن العمليات الفسيولوجية المتعمقة داخل كل مرحلة هي خارج نطاق هذه الدراسة ، يمكن العثور على مزيد من المعلومات في الأدبيات17.

إن استخدام تقنية مراقبة دورة estrous هذه وتطويرها المستمر متجذر في الروابط بين هرمونات الستيرويد الجنسية ووظيفة الأنظمة الجسدية مثل نظام القلب والأوعية الدموية18 ونظام الغدد الصماء8 والجهاز العصبي المركزي19،20،21. في الوقت نفسه ، قد لا يكون من الضروري دائما مراقبة دورة estrous عندما تشارك القوارض الإناث22،23،24،25. بدلا من ذلك ، من المهم أولا النظر فيما إذا كان قد تم الإبلاغ عن الاختلافات بين الجنسين في مجال الدراسة المحدد ، والذي يمكن استكشافه بشكل أكبر في المراجعات المنشورة22,23. على الرغم من أن مراقبة دورة الاستروس أمر حيوي في مجموعة واسعة من التحقيقات البحثية ، إلا أنه لا ينبغي النظر إليها على أنها عقبة أمام إشراك القوارض الإناث في التجارب. في حين أن هذه التقنية قد تبدو معقدة وتستغرق وقتا طويلا ، إلا أن الإجراء نفسه قد يستغرق أقل من 15 دقيقة لإكماله ، اعتمادا على المحقق ، وهو فعال من حيث التكلفة. بشكل عام ، فإن إدراج القوارض الإناث في الدراسات العلمية مفيد لفهم أنظمة الجسم ، والظروف والأمراض المختلفة ، والعافية العامة ، حيث استندت هذه التطورات بشكل أساسي إلى قالب جسم الذكور.

المعلمات العالمية والتغيرات الطبيعية في القوارض
ومن الضروري تحديد نطاقات للجوانب التي ينظر إليها على أنها "نموذجية" لتحديد أنماط الدورات القياسية، ووضع بارامترات لأغراض المقارنة والتحليل، والكشف عن التشوهات والقيم المتطرفة. في الوقت نفسه ، من المهم أيضا إدراك أن دورة كل فأر فريدة من نوعها ، ومن المتوقع حدوث انحرافات بناء على سلالة الحيوان والعمليات الفسيولوجية والظروف البيئية. في الواقع ، واحدة من أكثر الجوانب "الطبيعية" لدورة estrous هي التباين. وينظر إلى هذا في طول الدورة الإجمالية, مع مجموعة من 3-38 يوما26,27; عمر النضج الجنسي الذي يمكن أن يتراوح من 32-34 يوما إلى عدة أسابيع28،29،30 ؛ ما يعتبر غير دوري 11 ، وتصنيف الأنماط المحددة11,13. بشكل عام ، لا يوجد قالب عالمي لدورة estrous ، وترجمة ذلك إلى كل من المجتمع العلمي وعامة الناس هو جزء مهم من العملية التجريبية.

النقاط الزمنية التجريبية وعمر النمو
إن الاعتراف بمبدأ التباين هذا يساعد في بناء تصميم تجريبي موثوق وصالح. على سبيل المثال ، تعتمد بداية مراقبة ركوب الدراجات الاستروس على التطور التشريحي والفسيولوجي للفئران ، والذي يختلف بناء على العوامل البيئية والفسيولوجية. لا يمكن أن تبدأ المراقبة حتى تطور الفتحة المهبلية (VO) ، وهي الفتحة المهبلية الخارجية المحاطة بالفرج التي تؤدي إلى الجزء الداخلي من القناة المهبلية (الشكل 3A-D). في حين أن VO غالبا ما يتطور بشكل كامل بين سن 32 و 34 يوما ، إلا أنه يظل فرديا لكل موضوع ، ولا يزال الكثير عن العملية غير معروف. تم استخدام هذه الفتحة لتحديد بداية النضج الجنسي ، والتي تم ربطها بزيادة استراديول31 ، ونضج محور ما تحت المهاد والغدة النخامية والمبيض32 ، والإباضة الأولى في الفئران17،33،34،35. ومع ذلك ، فقد وجدت المنشورات الحديثة أنه ليس سوى علامة غير مباشرة على التطور التناسلي ، حيث يمكن أن يصبح منفصلا عن الأحداث الهرمونية والتنموية في البيئات غير المواتية31 وقد يمثل تغيرات في مستويات الاستراديول بدلا من النضج الجنسي33. لذلك ، يوصى بعدم الاعتماد فقط على VO لتحديد عمر النمو وكمؤهل لمراقبة دورة estrous36 ولكن أيضا الاستفادة من ظهور المرحلة الأولى من EST وكورن الخلايا الظهارية30 للاحتفال ببداية النضج الجنسي.

يرتبط وزن الجسم بشكل ملحوظ بعمر النمو خلال فترة المراهقة في القوارض30,37 وبالتالي يمكن أن يساعد أيضا في تحديد عمر النمو في هذه الفترة. تشمل الآليات المقترحة المتعلقة بهذه الظاهرة تحفيز الهرمونات اللازمة للنمو التناسلي ، مثل هرمون النمو ، وتثبيط محور الغدة الكظرية تحت المهاد والغدة النخامية (HPA) بواسطة منظم الشهية ، اللبتين30. ومع ذلك ، لا ينصح باستخدام هذا المقياس كمؤشر وحيد لعمر النمو بسبب التباين الكبير الذي شوهد بين الفئران عبر الأنواع ومقدمي البائعين38. التباين الذي شوهد في تطوير VO ووزن الجسم يجسد أهمية المفهوم في العملية التجريبية الشاملة.

الترجمة إلى البشر: السياقات الثقافية والعلمية
العلاقة الانتقالية للدراسات الإنجابية بين الحيوان والإنسان ثنائية الاتجاه. تؤثر نتائج الدراسات القائمة على الحيوانات على كيفية تقييم العمليات البشرية والتعامل معها وتحليلها39. يؤثر تصور الجهاز التناسلي البشري والعمليات المرتبطة به على كيفية دراسة الحيوانات. في الواقع ، تنبع واحدة من أعلى المؤشرات لمزيد من البحث في هذا المجال من المعتقدات الاجتماعية والثقافية المتحيزة المتعلقة بالدورات الهرمونية التي تؤثر على العملية العلمية. العديد من هذه الاتفاقيات مستمدة من نفور ثقافي عام من مناقشة الحيض ، مما أدى إلى فجوة في البيانات في المعرفة المثبتة جيدا40,41. هذا له مجموعة من العواقب التي تمتد من طفيفة إلى قاتلة - من ارتفاع الرفوف وحجم الهاتف الذكي إلى تركيب دروع جسم الشرطة وتشخيص السرطان الفائت42.

إن وصف الحيض بأنه غير صحي ومدمر وسام - ينظر إليه في النصوص الموقرة ووسائل الإعلام والقواميس والتعاليم الطبية - محفوظ من خلال المنشورات العلمية. يحدث هذا من خلال أوصاف غير دقيقة ومتحيزة للدورات الهرمونية ، وعزل الجهاز التناسلي عن نظرائه من الغدد الصماء العصبية والتأثيرات البيئية ، والمنظور الاختزالي لإكمال الدورة على أنها "فشل في الحمل"43,44. وهذا يؤدي إلى خلق ممارسات تجريبية غير سليمة، مثل إغفال المتغيرات الخارجية التي تؤثر على الدورات الهرمونية، وتحديد نقاط البداية والنهاية استنادا فقط إلى التطورات التشريحية، وقياس تقدم الدورة بطريقة خطية بدلا من دائرية. على الرغم من العلاقة المباشرة بين العوامل الاجتماعية والثقافية والعواقب البيولوجية ، إلا أنه لا يتم النظر فيها غالبا في الأدبيات العلمية. من خلال فحص المنشورات الأكثر شمولية43،44،45 ، يمكن للباحثين تفكيك هذه الوصمات وإنشاء تصميمات تجريبية أكثر موثوقية وصلاحية.

Protocol

تتوافق جميع طرق المناولة والإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول مع إرشادات رعاية واستخدام الحيوانات التابعة للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) وقد تمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) بجامعة Pepperdine ولجنة أبحاث الحيوان التابعة لجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (ARC).

1. رعاية الحيوانات واستخدامها

  1. الحصول على الفئران الإناث ، بأعداد وفقا لتحليل الطاقة ، والفئران الذكور لتعزيز تأثير ويتن أو ركوب الدراجات أكثر اتساقا46. تحديد السلالة بناء على الهدف من الدراسة في قواعد البيانات المعروفة47.
    ملاحظة: تعكس البيانات الحالية بيانات برنامج التقييس الجيني الدولي SD (IGS) للمراهقات في وجود ذكور فئران SD الموجودة في كل من مختبرات جامعة Pepperdine و UCLA كجزء من دراسة تعاونية. وصلت هذه الفئران في مجموعات منفصلة في عمر 28 يوما ، وتم رصد تطور دورة استروس لمدة 10 أو 20 يوما لإظهار الاختلافات على المستويات الحادة والمزمنة ، بدءا من 34 يوما من العمر (بعد فترة تأقلم مدتها 7 أيام).
  2. قبل المناولة ، اسمح بالحجر الصحي و / أو فترة التأقلم لتحقيق الاستقرار الفسيولوجي بعد النقل والتكيف مع البيئة الجديدة.
    ملاحظة: تم الاستشهاد بفترة لا تقل عن 3 أيام ، مع فترة 7 أيام موصى بها48،49،50،51،52. بشكل عام ، يعتمد هذا على ظروف النقل ، وسلالة الحيوانات ، وأهداف الدراسة.
  3. تأكد من تقليل التوتر باستخدام فترة التأقلم ، لأن الإجهاد يمكن أن يعطل أداء الجهاز التناسلي السليم53. ومع ذلك ، لا تبالغ في التعويض من خلال محاولة القضاء عليه ، لأن كمية معتدلة من الإجهاد مفيدة لرفاهية الحيوانات51.
  4. استضافة الفئران في بيئة درجة حرارة (68-79 درجة فهرنهايت ، أي 20-26 درجة مئوية) وبيئة يتم التحكم فيها بالرطوبة (30-70٪) عن طريق الاتصال بمديري vivarium أو المختبرات وضمان هذه الميزات. توزيع المياه و chow ad libitum مع المكونات الغذائية المدرجة على موقع الشركة وتنظيف الأقفاص مرة واحدة في الأسبوع.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم إيواء الفئران في مجموعات من 2 مفصولة بالجنس في أقفاص بلاستيكية شفافة قابلة لإعادة الاستخدام مقاس 19 بوصة × 10 بوصة × 8 بوصة وكان بإمكانها الوصول إلى فراش كوز الذرة الذي تم تغييره مرة واحدة في الأسبوع. تم الحفاظ على درجة الحرارة عند 70 درجة فهرنهايت والرطوبة عند 35-79 ٪ ، بمتوسط 62 ٪.
  5. تحقق من تطور الذيل الحلقي أو النخر الإقفاري للذيل وأصابع القدم للحصول على دليل على انخفاض مستويات الرطوبة النسبية ودرجات الحرارة القصوى ، والتي قد تسبب تناوب الاستجابات البيولوجية.
    ملاحظة: درجة الحرارة والرطوبة مهمة للجهاز التناسلي ، والنضج الجنسي ، ودورية estrous54,55,56,57,58.
  6. ضمان الإضاءة المناسبة والمتوازنة في جميع أنحاء مساحة السكن عن طريق إيداع كميات متساوية من مصادر الضوء في جميع أنحاء مساحة المختبر التي تعمل على نظام الضوء المظلم الذي يتم التحكم فيه زمنيا.
    ملاحظة: هنا ، تم التحكم في دورة الضوء 12:12-h : الظلام ، مع أضواء مضاءة من 06:00-18:00 h ، بواسطة مصابيح LED خطية 2,550 لومن.
  7. اتبع متطلبات لوكس المقدمة52 بناء على الاختلافات في تصبغ الحيوانات وعمرها وإجهادها وجنسها وحالتها الهرمونية.
    ملاحظة: عندما يصنف الباحثون عينات الخلايا التي تم جمعها ، فإن الإضاءة المتسقة ستسمح بالكشف البصري السليم والتدريج الموثوق به59. ترتبط مدة وشدة الضوء ارتباطا مباشرا بالجهاز التناسلي والنضج الجنسي وركوب الدراجاتفي المناطق الشرقية 54,55,56,57,60,61.

2. المعدات وإعداد التجارب

  1. مراجعة محددات التصنيف (كما هو موضح في الشكل 2A): كيفية تحديد كل مرحلة من مراحل دورة estrous وكيفية تشغيل المجهر ومعدات الكاميرا.
  2. تأكد من أن كل موضوع يخضع للمراقبة قد وصل إلى مرحلة النضج الجنسي ويظهر مؤشرات مناسبة للنمو - VO ووزن الجسم والعمر. وزن الفئران وفحصها بحثا عن VO في نفس الوقت كل يوم لإجراء مقارنات دقيقة ونقلها باستخدام طريقة معالجة معتمدة. استشر الطبيب البيطري التابع للجامعة إذا فقد أكثر من 20٪ من وزن جسمه السابق.
    ملاحظة: يبقى VO ذيليا إلى فتحة مجرى البول وجمجمة إلى فتحة الشرج ، وتقع بين الاثنين ، كما هو موضح في الشكل 3.
  3. وبما أن هذه العوامل تعتمد على الإجهاد، تحقق مع المورد من المواصفات والنظر في العوامل البيئية الخاصة بالمختبر62.
    ملاحظة: بشكل عام ، سيحدث هذا بين 32-34 يوما من العمر ومتوسط وزن الجسم يتراوح بين 75-150 جراما63 للفئران SD ويشار إليه بفتحة دائرية الشكل كانت مغطاة سابقا بغمد غشائي.
  4. حدد فترة جمع العينات المناسبة لمجموعة الفئران التي يتم رصدها لمنع جمع العينات الانتقالية. أولا ، قم بأخذ عينة من عدد قليل من الحيوانات في 2 أو 3 نقاط زمنية مختلفة على مدار اليوم لتحديد الوقت الذي توجد فيه معظم مراحل الدورة (على سبيل المثال ، أخذ العينات في الساعة 12:00 و 13:00 و 14:00 ساعة للحيوانات المختلفة). أكمل غسل المهبل في نفس الوقت كل يوم للحصول على تدريج متسق وموثوق.
    ملاحظة: تم الإبلاغ عن أن الساعات بين الساعة 12:00 و 14:00 هي الأفضل لالتقاط جميع المراحل. في هذه الدراسة ، حدث رصد دورة estrous بين الساعة 12:00 و 14:00 ، وتم التعامل معه باستخدام عقد نمط الضغط (انظر الخطوة 3.4). تعد أهمية توقيت مراقبة دورة estrous بالنسبة للتدخلات التجريبية الأخرى (مثل التكييف السلوكي والأدوية) مجالا متطورا للبحث ويمكن استكشافه بشكل أكبر11. يعتمد تحديد مدة مراقبة دورة estrous على الدراسة ويمكن استكشافه بشكل أكبر في الدراسات المنشورة11,33.
  5. قم بإزالة الغطاء الواقي من المجهر وقم بتوصيل الكاميرا بالكمبيوتر عن طريق إزالة غطاء عدسة الكاميرا الواقية ووضع العدسة فوق عدسة المجهر.
  6. ثم افتح البرنامج المحدد مسبقا على الكمبيوتر. لاستخدام البرنامج المحدد في هذه الدراسة، حدد الكاميرا المرفقة ب USB الموجودة على الجانب الأيسر من الشاشة، ضمن علامة التبويب المسماة قائمة الكاميرات. تأكد من توصيل كاميرا USB بالكمبيوتر بشكل صحيح، والتي ستقرأ " لا يوجد جهاز " ضمن علامة التبويب المسماة "قائمة الكاميرات"، إن لم يكن الأمر كذلك.
  7. بمجرد تحديد كاميرا USB ضمن علامة التبويب ، قم بتشغيل مفتاح ضوء المجهر الموجود على القاعدة.
  8. إنشاء مجلد على الكمبيوتر المخصص لصور عينة الخلية. قم بإنشاء مجلد ملفات لكل يوم منفصل يتم فيه جمع البيانات ، وإعدادها مسبقا قبل التقاط الصور.
  9. مع إعداد المعدات ، استرجع قفص الموضوع من مكان احتجازه وأحضره إلى محطة جمع العينات.

3. جمع الخلايا المهبلية

  1. استرجع حقنة يمكن التخلص منها واملأ كل حقنة من المحاقن ب 0.2 مل من كلوريد الصوديوم المعقم بنسبة 0.9٪. في حالة وجود فقاعات هواء ، قم بتحريك حقنة البرميل بلطف حتى تصل جميع فقاعات الهواء إلى الطرف المفتوح من المحقنة وطرد الهواء. إذا كانت لا تزال هناك فقاعات هواء موجودة ، فقم بطرد المحلول مرة أخرى إلى وعاء كلوريد الصوديوم وأعد تعبئته حتى لا يكون هناك أي شيء.
    ملاحظة: قد يؤدي الخفقان المفرط إلى تكوين المزيد من فقاعات الهواء.
  2. أعد كل حقنة إلى الغلاف البلاستيكي للحفاظ على حقل معقم ، مع طرف المحقنة داخل الجزء المختوم من اللف.
  3. افتح القفص وارفع الموضوع برفق إما عن طريق قاعدة الذيل أو جذع الجسم ، وأغلق غطاء القفص لمنع الآخرين من الخروج. حدد طريقة احتجاز من تلك المدرجة أدناه بناء على التفضيل الشخصي واستجابة الحيوان.
  4. استخدم عقد الضغط على غرار الفئران المراهقة عن طريق وضع الهدف على منطقة الصدر العليا ، مع توجيه أنف الشخص إلى الأرض. قبل البدء في المسحة ، تأكد من أن الهدف مضغوط بما يكفي لمنع الحركة ولكنه مريح وآمن في الانتظار. كشف القناة المهبلية للموضوع عن طريق ثني الذيل بلطف قبل إدخال المحقنة.
  5. استخدم Hind Leg Lift للفئران البالغة عن طريق وضع الكفوف الأمامية للحيوان إما على الجزء العلوي أو الجانبي من القفص ، في حين يتم تقييد الذيل والأطراف الخلفية بقبضة لطيفة بين الإصبعين الأول والثاني ، مما يترك الإبهام حرا في تشغيل المحقنة64.
  6. السماح للحيوانات بالتأقلم مع التعامل والرصد. تعامل مع الحيوانات بلطف ولكن بأمان للحد من الإجهاد الزائد وحماية الباحث من العدوان مثل العض.
    ملاحظة: قد لا تسفر الأيام القليلة الأولى من المراقبة عن النتائج المرجوة حيث تتأقلم الحيوانات مع ظروفها. التعامل مع الحيوانات لجمع أوزان الجسم خلال فترة التأقلم يمكن أن يساعد في هذا الانتقال33.
  7. أثناء تثبيت المحقنة بالسبابة والإصبع الأوسط، أدخل طرف المحقنة (لا يزيد عن 2 مم) بزاوية موازية للقناة المهبلية. اطرد كلوريد الصوديوم ببطء إلى القناة عن طريق دفع المكبس إلى الداخل. لا تقم بإدخال المحقنة أكثر في القناة ، لأن القيام بذلك قد يعطل دورة الاستروس.
  8. استخرج كلوريد الصوديوم من القناة المهبلية عن طريق سحب مكبس المحقنة بعيدا عن البطانة الظهارية (لأعلى). إذا كانت هناك صعوبة في إبقاء الموضوع في الانتظار أثناء هذه العملية ، فضعه مرة أخرى في القفص لفترة راحة قصيرة قبل محاولة استخراج كلوريد الصوديوم.
  9. بمجرد جمع عينة الخلية ، ضع الموضوع مرة أخرى في القفص وكرر هذا الإجراء لكل قبل تقييم جميع العينات تحت المجهر.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن جمع كل عينة وتقييمها قبل الانتقال إلى الحيوان التالي. قد يحتاج الحيوان إلى غسل ثان إذا لم يكن من الممكن تصنيف العينة. يمكن إعادة استخدام نفس المحقنة من المجموعة الأولية إذا لم تتصل بالمياه المالحة مباشرة في الحاوية وفقط لنفس الحيوان.

4. تقييم العينة

  1. ابدأ التصنيف بفحص عينة السائل المهبلي المستخرجة. سجل اللزوجة إما لزجة أو غير لزجة والتلوين إما غير شفاف أو شفاف على مستند الوصف أو نظام تسجيل آخر.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ هذا القسم من البروتوكول في وقت جمع العينات أو في وقت لاحق.
  2. اطرد 2-3 قطرات من السائل على شريحة المجهر وضع زجاج غطاء المجهر أعلى الشريحة. ضع زجاج الغطاء على شريحة المجهر من أعلى الشريحة إلى أسفلها أو من جانب واحد من الشريحة إلى الآخر لمنع تكوين فقاعات الهواء. إذا كان ذلك ممكنا، اترك ما يقرب من نصف العينة التي تم جمعها في المحقنة إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من الفحص ولمنع وضع كمية زائدة من السوائل على الشريحة.
  3. حدد موقع الخلايا التي تم جمعها عن طريق تحريك شريحة المجهر عبر المرحلة. إذا كان هناك عدد قليل جدا من الخلايا أو كمية كبيرة من الحطام، اطرد السائل المتبقي إلى شريحة جديدة وأعد فحصه. إذا كانت كمية العينة المتبقية في المحقنة غير كافية ، أو إذا كانت القطرة الثانية تمثل مشكلات مماثلة ، فقم بجمع عينة أخرى من الموضوع قبل محاولة تحديد مرحلة دورة estrous.
  4. بمجرد تحديد موقع الخلايا وقبل لمس الكمبيوتر أو لوحة مفاتيح الكمبيوتر ، قم بإزالة القفاز الواحد لمنع تلويث لوحة المفاتيح.
  5. احصل على صور لعينات الخلايا من خلال النقر على الوظيفة المسماة Snap على الجانب الأيسر من لوحة البرامج.
  6. ثم احفظ الملف بالنقر فوق حفظ باسم أسفل أيقونة الملف في الزاوية العلوية اليسرى من الصفحة. احفظ الصورة ضمن مجلد مسمى مسبقا على الكمبيوتر.
    ملاحظة: مثال قالب التسمية: #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective العدسة المستخدمة.
  7. التقط أكثر من صورة واحدة في كل عدسة موضوعية إذا لم يكن هناك العديد من الخلايا داخل كل إطار.
    ملاحظة: أمثلة على التسميات لصور متعددة: #1_01/09/2021_EST_4x1 و#1_01/09/2021_EST_4x2.
  8. كرر الإجراء لكل عينة تم جمعها تحت عدسات موضوعية متعددة. قم بتضمين كائن واحد أصغر على الأقل ، مثل 4x ، وكائن واحد أكبر على الأقل ، مثل 20x.
  9. قم بتحميل الصور إلى محرك أقراص / مجلد مشترك أو محرك أقراص ثابت خارجي حتى يتمكن جميع الباحثين المعنيين من الوصول إلى الملفات وهناك نسخ احتياطية متاحة.

5. تصنيف المرحلة

  1. قم بإعداد شاشة الكمبيوتر لعرض الصور التي تم التقاطها وورقة التسجيل في وقت واحد (الشكل 4A-C).
    ملاحظة: سيسمح ذلك بحدوث الوثائق أثناء عرض العينة التي تم جمعها. يمكن إكمال هذا الجزء من البروتوكول في وقت جمع العينات أو في وقت لاحق.
  2. حدد أنواع الخلايا الموجودة في العينة. اختر من بين الخيارات الأربعة المدرجة في الخطوات 5.2.1-5.2.4 باستخدام المعايير وسجل النتائج.
    1. الخلايا الظهارية الكيراتينية (AKE) / الخلايا الظهارية المتقرنة
      1. ابحث عن الخلايا الخشنة أو ذات الحواف الزاوية، كما هو موضح في الشكل 2B والشكل 5C، والتي على الرغم من عدم وجود نواة، قد تظهر مناطق مستديرة ضوئية (أشباح نووية) داخل الخلية تمثل المكان الذي كانت توجد فيه النواة ذات يوم. استخدم تكبيرات أعلى ، مثل 20x وما فوق ، للتمييز بين هذه الخلايا النووية والخلايا غير النواة.
      2. استخدم تكبيرا أعلى لتمييز الجزء الكيراتيني أو المتقرن من الخلية - وهي طبقة رقيقة من الخلايا تفتقر إلى النوى ومليئة بالكيراتين - إذا رغبت في ذلك.
        ملاحظة: بالإضافة إلى مظهرها الخشن ، يمكن تمييزها أيضا عن طريق كيفية طيها أو تفكيكها ، وإنشاء هياكل خشنة وممدودة تعرف باسم قضبان الكيراتين.
    2. الخلايا الظهارية النووية الكبيرة (LNE)
      1. ابحث عن هذه الخلايا المستديرة إلى المضلع الشكل عادة المغطاة بحدود غير منتظمة أو خشنة أو زاوية.
      2. لاحظ كيف يمكن أن تتخذ نواتها أشكالا مختلفة ، تتراوح من سليمة إلى منحلة أو pykontic ، فيما يتعلق بالتكثيف الذي لا رجعة فيه للكروماتين في نواة خلية تمر بالموت أو التدهور ، كما هو موضح في الشكل 2B والشكل 5D1,2. لاحظ كيف تشغل هذه النوى مساحة أقل من السيتوبلازم داخل الخلية ، مع نسبة نووية إلى سيتوبلازمية أقل (N: C) من الخلايا الظهارية الصغيرة. ابحث عن حبيبات السيتوبلازم التي يمكن رؤيتها عند التكبيرات الأعلى13.
    3. الكريات البيض (LEUs)/العدلات/الخلايا النووية المتعددة الأشكال
      1. ابحث عن هذه الخلايا الكروية المدمجة ذات النوى متعددة الفصيصات (وبالتالي ، تعرف باسم الخلايا متعددة الأشكال النووية) ، والتي تختفي مع نضوج الخلية (الشكل 2B والشكل 5A). يمكن استخدام تكبير أعلى (على سبيل المثال ، 40x) لمراقبة النوى متعددة الفصوص.
        ملاحظة: عند الجمع والتحضير، قد تتكثف هذه الخلايا أو تطوى أو تتمزق.
    4. الخلايا الظهارية الصغيرة النواة (SNE)
      1. ابحث عن هذه الخلايا المستديرة إلى البيضاوية الشكل التي هي أكبر من العدلات الموصوفة أعلاه.
      2. راقب النوى المستديرة لهذه الخلايا الظهارية غير الكيراتينية (الشكل 2B) ، والتي تشغل مساحة أكبر من السيتوبلازم داخل الخلية ، مما يخلق نسبة N: C أعلى بالنسبة للخلايا الظهارية الكبيرة.
        ملاحظة: عند الجمع والتحضير، قد تطوى هذه الخلايا أو تتداخل لإنشاء شكل يشبه سلسلة أو شريط، كما هو موضح في الشكل 5B1.
  3. افحص كيفية تنظيم الخلايا الموجودة في العينة لكل تشييئ. استخدم التجسيد السفلي، مثل 4x، لعرض طريقة عرض تمثيلية لترتيب الخلايا الكلي. سجل ما إذا كانت الخلايا مجمعة معا (C) أو مشتتة بالتساوي (ED) أو مشتتة عشوائيا (RD) (انظر الشكل 4C) ، ولاحظ التنظيم المحدد لكل نوع من أنواع الخلايا (على سبيل المثال ، يتم تكتل الخلايا الظهارية الصغيرة ذات النواة ، ويتم توزيع العدلات بالتساوي).
  4. بعد ذلك ، قم بتقدير وتسجيل إجمالي كمية الخلايا (smidge ، معتدلة ، عديدة) وكميات الخلايا الفردية (النسبة المئوية لكل نوع خلية موجود).
    ملاحظة: يمثل ال smidge أصغر عدد من الخلايا الموجودة التي يمكن استخدامها لتحديد تصنيف العينة، ويمثل العديد منها وجود عدد لا يحصى من الخلايا التي تمثل إما معظم إن لم يكن كل المساحة الموجودة على الشريحة أو مكدسة فوق بعضها البعض، ويمثل عدد معتدل من الخلايا عددا متوسطا نسبيا من الخلايا (الأمثلة الموضحة في الشكل 5A-D والشكل 6A-D).
  5. لاحظ ما إذا كانت هناك أي انحرافات عن المعايير المدرجة أو الجوانب النموذجية للموضوع المحدد في فئة "الشذوذ" واستشر الطبيب البيطري إذا لزم الأمر.
  6. حدد مرحلة دورة الاستروس التي يتم تقديمها في العينة باستخدام مكونات التصنيف والأوصاف أدناه.
    1. مات
      1. ابحث عن LEUs كنوع الخلايا السائد أو الوحيد الموجود ، مرتبة بطريقة متكتلة في بداية DIE ولكنها أكثر تشتتا في المراحل المتأخرة.
        ملاحظة: أثناء الانتقال إلى DIE ، قد تنخفض كمية الخلايا عندما تبدأ الخلايا الظهارية في الانهيار ، كما هو موضح في الشكل 6D1. في الوقت نفسه ، يبدأ عدد LEUs في الزيادة ، وتميل إلى ترتيبها بطريقة متكتلة في البداية وتنتشر بمرور الوقت.
      2. لاحظ أن الكمية الإجمالية للخلايا قد تكون منخفضة نسبيا ، وغالبا في المراحل اللاحقة من فترة DIE ، في اليوم الثاني أو الثالث.
      3. لاحظ الكمية العالية من المخاط التي قد تكون موجودة في هذه المرحلة ، والتي تظهر كخيوط مركزة من LEUs (الشكل 5A1). ابحث عن كتل صغيرة أو خيوط خلوية من خلايا SNE المصاحبة ل LEUs خلال المراحل المتأخرة في الانتقال إلى PRO (الشكل 5A1,2).
      4. راقبي المظهر اللزج وغير الشفاف للسائل المهبلي عند الانتقال إلى DIE والانتقال إليه بالكامل والخروج منه.
        ملاحظة: متوسط مدة هذه المرحلة هو 48 ساعة خلال دورة مدتها 4 أيام وربما 72 ساعة خلال دورة مدتها 5 أيام.
    2. برو
      1. ابحث عن خلايا SNE كخلايا مهيمنة وعن LEUs و / أو LNE و / أو خلايا AKE التي يمكن رؤيتها بأعداد منخفضة. استخدم التشييء العالي لمراقبة المظهر الحبيبي لخلايا SNE التي يتم ترتيبها عادة في مجموعات أو أوراق أو خيوط خلال هذه المرحلة (الشكل 5B1,2).
      2. راقبي المظهر اللزج وغير الشفاف للسائل المهبلي عند الانتقال من DIE إلى PRO ، وكيف يصبح غير لزج وشفاف بمجرد انتقاله بالكامل إلى مرحلة PRO (متوسط مدة 14 ساعة في الفئران).
    3. مؤسسه
      1. ابحث عن هيمنة خلايا AKE ، وتناقص خلايا SNE في EST ، وزيادة في عدد وحجم الخلايا مع استمرار EST11,13.
      2. دون السمة المميزة للترتيب العنقودي في كثير من الأحيان لخلايا AKE ، في شكل قضبان كيراتين أو تحتوي على نوى أشباح ، والتي يمكن أن تصبح أكثر تشتتا بشكل عشوائي في الانتقال من PRO (الشكل 6B) وإلى MET (الشكل 6C).
      3. راقبي السائل المهبلي الشفاف وغير اللزج المميز، والذي يمكن توقعه أثناء انتقال الفئران إلى EST وانتقالها بالكامل إليها وخروجها منها.
        ملاحظة: يتضمن تقدم EST الكثير من التنويع (الشكل 5C والشكل 6B ، C). تحدث المرحلة عادة بمعدل 24 ساعة في دورة مدتها 4 أيام أو ربما 48 ساعة في دورة مدتها 5 أيام.
    4. اجتمع
      1. ابحث عن أعداد أكبر من خلايا SNE و LNE أثناء انتقال الفئران إلى MET ، إما مهيمنة من حيث نسبة الخلايا داخل القناة أو قريبة من نسبة متساوية مع LEUs11,13. علاوة على ذلك ، لاحظ الكمية الأكبر من الحطام في MET والتحولات مقارنة بالمراحل الأخرى بسبب اضمحلال الخلايا الظهارية بعد EST والانتقال إلى DIE.
      2. لاحظ عدم وجود ترتيب متسق حيث يتم رؤية جميع أنواع الخلايا وبكميات مختلفة (الشكل 5D1-3). ومع ذلك ، ابحث عن LEUs المعبأة أو المتجمعة بالقرب من الخلايا الظهارية في المراحل الأولى التي قد تعود إلى الترتيب المتكتل عند الانتقال إلى DIE.
      3. راقبي المظهر غير اللزج والشفاف للسائل المهبلي في هذه المرحلة والتغيير إلى مظهر أكثر لزوجة وغير شفاف أثناء الانتقال إلى DIE.
        ملاحظة: متوسط مدة هذه المرحلة هو 6-8 ساعات.
  7. عينات التسمية في الانتقالات مع المرحلة التي يتحرك الموضوع نحوها ، مع الانتقال بين قوسين لتتبع وقت جمعها. يمكن العثور على مزيد من المعلومات حول كيفية التمييز بين هذه المراحل ال 4 وانتقالاتها في النتائج التمثيلية.
    ملاحظة: نظرا لأن العينات التي تم جمعها ثابتة والدورة ديناميكية، فقد تصور الشرائح الانتقالات بين المراحل (كما هو موضح في الشكل 6A-D).
  8. أكمل هذه العملية لكل حتى تكتمل مرحلة الرصد.
  9. في أي من اليومين 11 (45 يوما من العمر) أو 21 (55 يوما من العمر) ، قم بالقتل الرحيم للفئران بنسبة 5٪ من الأيزوفلوران و 2٪ من الأكسجين قبل قطع الرأس بالمقصلة. قد تختلف هذه النقاط الزمنية اعتمادا على طبيعة الدراسة.

النتائج

وتعكس البيانات الحالية بيانات المراهقات في البرنامج الدولي للتوحيد الجيني SD (IGS) في وجود ذكور من فئران SD. كانت هذه الحيوانات موجودة في كل من جامعة بيبردين ومختبرات جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس كجزء من دراسة تعاونية. يعرض الشكل 5 اختلافات متعددة لمراحل الدورة ال 4. تم تحديد ...

Discussion

الخطوات الرئيسية والاعتبارات الهامة
تتطلب بعض الخطوات الحاسمة في البروتوكول المقدم التركيز ، خاصة داخل مجموعة الخلايا المهبلية. أثناء استخراج السائل المهبلي ، يعد ضمان الزاوية والعمق المناسبين لإدخال المحقنة أمرا أساسيا لتحقيق نتائج مرضية ومنع التهيج أو الإصابة أو تحفيز عنق...

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

أجريت هذه الدراسة من خلال تعاون تموله المعاهد الوطنية للصحة بين مركز أبحاث إصابات الدماغ بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (BIRC).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB CameraAmScopePart Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV&
keywords=usb+camera+for+microscope&
qid=1572477663&s=industrial
&sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short BevelFischer Scientific14-815-526https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8NEWCO93009https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glassFischer Scientific12-553-7Ahttps://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover GlassesFischer Scientific12-553-464https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-PlyFischer Scientific06-666https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001 NEWCO Specialty and LabDiet5012https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lmGrainger36UX10https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_
LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7
zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4
cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696
!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id=
CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW
1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ
Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo
Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc=
PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9%Live Action SafetyABB079830939https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH SuppliesBH SuppliesASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7&
keywords=1ml+sterile+syringe&qid=
1572478649&s=industrial
&sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa=
ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy
PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm
VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ
yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy
eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM
0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h
bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja
1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2
xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimenAllentownLV40326013https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable UnderpadMedlineEAN: 0480196288558
 Global Trade Identification Number: 40080196288558		https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853&
sr=8-4

References

  1. Schneider, M. Adolescence as a vulnerable period to alter rodent behavior. Cell and Tissue Research. 354 (1), 99-106 (2013).
  2. Camacho-Arroyo, I., Montor, J. M. Beyond reproductive effects of sex steroids. MiniReviews in Medicinal Chemistry. 12 (11), 1037-1039 (2012).
  3. Shah, S. I. A. Systemic non-reproductive effects of sex steroids in adult males and females. Human Physiology. 44, 83-87 (2018).
  4. Wierman, M. E. Sex steroid effects at target tissues: mechanisms of action. Advances in Physiology Education. 31 (1), 26-33 (2007).
  5. An, G., et al. Pathophysiological changes in female rats with estrous cycle disorder induced by long-term heat stress. BioMed Research International. 2020, 4701563 (2020).
  6. Donato, J., et al. The ventral premammillary nucleus links fasting-induced changes in leptin levels and coordinated luteinizing hormone secretion. Journal of Neuroscience. 29 (16), 5240-5250 (2009).
  7. Fortress, A. M., Avcu, P., Wagner, A. K., Dixon, C. E., Pang, K. Experimental traumatic brain injury results in estrous cycle disruption, neurobehavioral deficits, and impaired GSK3β/β-catenin signaling in female rats. Experimental Neurology. 315, 42-51 (2019).
  8. Hatsuta, M., et al. Effects of hypothyroidism on the estrous cycle and reproductive hormones in mature female rats. European Journal of Pharmacology. 486 (3), 343-348 (2004).
  9. Jaini, R., Altuntas, C. Z., Loya, M. G., Tuohy, V. K. Disruption of estrous cycle homeostasis in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 279, 71-74 (2015).
  10. Tropp, J., Markus, E. J. Effects of mild food deprivation on the estrous cycle of rats. Physiology and Behavior. 73 (4), 553-559 (2001).
  11. Goldman, J. M., Murr, A. S., Cooper, R. L. The rodent estrous cycle: characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth Defects Research. Part B, Developmental and Reproductive Toxicology. 80 (2), 84-97 (2007).
  12. Thung, P. J., Boot, L. M., Muhlbock, O. Senile changes in the oestrous cycle and in ovarian structure in some inbred strains of mice. Acta Endocrinologica. 23 (1), 8-32 (1956).
  13. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
  14. . Biochemical and endocrinological studies of normal and neoplastic tissue: The metabolism of estrogen-producing ovarian tumors and other malignancies in the mouse Available from: https://www.translatetheweb.com/?from=nl&to=en&ref=SERP&dl=en&rr=UC&a=https%3a%2f%2frepository.tudelft.nl%2fislandora%2fobject%2fuuid%253A8776d58a-6695-4a38-99ca-0abf607480f0 (2021)
  15. Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. Acta Physiologica Pharmacologica Neerlandica. 4 (3), 442-444 (1955).
  16. Paccola, C., Resende, C., Stumpp, T., Miraglia, S., Cipriano, I. The rat estrous cycle revisited: a quantitative and qualitative analysis. Animal Reproduction. 10 (4), 677-683 (2013).
  17. Ojeda, S. R., Urbanski, H. F., Knobil, E., Neill, J. D. Puberty in the rat. The Physiology of Reproduction. , 363-409 (1994).
  18. Schallmayer, S., Hughes, B. M. Impact of oral contraception and neuroticism on cardiovascular stress reactivity across the menstrual cycle. Psychology, Health & Medicine. 15 (1), 105-115 (2010).
  19. Barreto-Cordero, L. M., et al. Cyclic changes and actions of progesterone andallopregnanolone on cognition and hippocampal basal (stratum oriens) dendritic spinesof female rats. Behavioural Brain Research. 379, 112355 (2020).
  20. de Zambotti, M., Trinder, J., Colrain, I. M., Baker, F. C. Menstrual cycle-related variation in autonomic nervous system functioning in women in the early menopausal transition with and without insomnia disorder. Psychoneuroendocrinology. 75, 44-51 (2017).
  21. Maghool, F., Khaksari, M., Khachki, A. S. Differences in brain edema and intracranial pressure following traumatic brain injury across the estrous cycle: Involvement of female sex steroid hormones. Brain Research. 1497, 61-72 (2013).
  22. Bale, T. L., Epperson, C. N. Sex as a biological variable: Who, what, when, why, and how. Neuropsychopharmacology. 42 (2), 386-396 (2017).
  23. Becker, J. B., Prendergast, B. J., Liang, J. W. Female rats are not more variable than male rats: a meta-analysis of neuroscience studies. Biology of Sex Differences. 7, 34 (2016).
  24. Prendergast, B. J., Onishi, K. G., Zucker, I. Female mice liberated for inclusion in neuroscience and biomedical research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 40, 1-5 (2014).
  25. Joel, D., McCarthy, M. M. Incorporating sex as a biological variable in neuropsychiatric research: where are we now and where should we be. Neuropsychopharmacology. 42 (2), 379-385 (2017).
  26. Long, J. A., Evans, H. M. The oestrous cycle in the rat and its associated phenomena. Memoirs of the University of California. 6, 1 (1922).
  27. Westwood, F. R. The female rat reproductive cycle: A practical histological guide to staging. Toxicologic Pathology. 36 (3), 375-384 (2008).
  28. Lenschow, C., Sigl-Glöckner, J., Brecht, M. Development of rat female genital cortex and control of female puberty by sexual touch. PLoS Biology. 15 (9), 2001283 (2017).
  29. Lewis, E. M., Barnett, J. F., Freshwater, L., Hoberman, A. M., Christian, M. S. Sexual maturation data for Crl Sprague-Dawley rats: Criteria and confounding factors. Drug and Chemistry Toxicology. 25 (4), 437-458 (2002).
  30. Spear, L. P. The adolescent brain and age-related behavioral manifestations. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 24 (4), 417-463 (2000).
  31. Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: the puberty ovarian maturation score (pub-score). Scientific Reports. 7, 46381 (2017).
  32. da Silva Faria, T., da Fonte Ramos, C., Sampaio, F. J. Puberty onset in the female offspring of rats submitted to protein or energy restricted diet during lactation. Journal of Nutritional Biochemistry. 15 (2), 123-127 (2004).
  33. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. 48 (1), 1 (2009).
  34. Engelbregt, M. J., et al. Delayed first cycle in intrauterine growth-retarded and postnatally undernourished female rats: follicular growth and ovulation after stimulation with pregnant mare serum gonadotropin at first cycle. Journal of Endocrinology. 173 (2), 297-304 (2002).
  35. Pescovitz, O. H., Walvoord, E. C. . When puberty is precocious: Scientific and clinical aspects. , (2007).
  36. . Standard Evaluation Procedure Test Guidelines 890.1450: Pubertal development and thyroid function in intact juvenile/peripubertal female rats assay Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/final_890.1450_female_pubertal_assay_sep_8.24.11.pdf (2011)
  37. Kennedy, G. G., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. Journal of Physiology. 166 (2), 408-418 (1963).
  38. Sengupta, S., Arshad, M., Sharma, S., Dubey, M., Singh, M. M. Attainment of peak bone mass and bone turnover rate in relation to estrous cycle, pregnancy and lactation in colony-bred Sprague-Dawley rats: Suitability for studies on pathophysiology of bone and therapeutic measures for its management. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 94 (5), 421-429 (2005).
  39. Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats. Disease models & Mechanisms. 2 (5-6), 206-210 (2009).
  40. Koff, E., Rierdan, J., Stubbs, M. L. Conceptions and misconceptions of the menstrual cycle. Women & Health. 16 (3-4), 119-136 (1990).
  41. Sahay, N. Myths and misconceptions about menstruation: A study of adolescent school girls of Delhi. Journal of Women's Health and Development. 3 (3), 154-169 (2020).
  42. . The deadly truth about a world built for men - from stab vests to car crashes Available from: https://www.theguardian.com/lifeandstyle/2019/feb/23/truth-world-built-for-men-car-crashes (2019)
  43. Chrisler, J. C., Denmark, F. L., Paludi, M. A. The menstrual cycle in a biopsychosocial context. Women's Psychology. Psychology of Women: A Handbook of Issues and Theories. , 193-232 (2008).
  44. . Re-cycling the menstrual cycle: A multidisciplinary reinterpretation of menstruation Available from: https://scholarworks.wmich.edu/masters_theses/3942 (1998)
  45. Sato, J., Nasu, M., Tsuchitani, M. Comparative histopathology of the estrous or menstrual cycle in laboratory animals. Journal of Toxicologic Pathology. 29 (3), 155-162 (2016).
  46. Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).
  47. Smith, J. R., et al. The year of the rat: The Rat Genome Database at 20: a multi-species knowledgebase and analysis platform. Nucleic Acids Research. 48 (1), 731-742 (2020).
  48. Capdevila, S., Giral, M., Ruiz de la Torre, J. L., Russell, R. J., Kramer, K. Acclimatization of rats after ground transportation to a new animal facility. Laboratory Animals. 41 (2), 255-261 (2007).
  49. Conour, L., Murray, K., Brown, M. Preparation of animals for research-issues to consider for rodents and rabbits. ILAR journal. 47 (4), 283-293 (2006).
  50. National Academies Press (US) Committee on Guidelines for the Humane Transportation of Laboratory Animals. Guidelines for the Humane Transportation of Research Animals. National Academies Press. , (2006).
  51. Obernier, J., Baldwin, R. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR Journal. 47 (4), 364-369 (2006).
  52. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. US) . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. , (2011).
  53. Pantier, L. K., Li, J., Christian, C. A. Estrous cycle monitoring in mice with rapid data visualization and analysis. Bio-protocol. 9 (17), 1-17 (2019).
  54. Cohen, I., Mann, D. Seasonal changes associated with puberty in female rats: effect of photoperiod and ACTH administration. Biology of Reproduction. 20 (4), 757-776 (1979).
  55. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J Mice: I. cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of Reproduction. 27 (2), 327-339 (1982).
  56. Pennycuik, P. R. Seasonal changes in reproductive productivity, growth rate, and food intake in mice exposed to different regimens of day length and environmental temperature. Australian Journal of Biological Sciences. 25 (3), 627-635 (1972).
  57. Piacsek, B. E., Hautzinger, G. M. Effects of duration, intensity and spectrum of light exposure on sexual maturation time of female rats. Biology of Reproduction. 10 (3), 380-387 (1974).
  58. Rubinow, M. J., Arseneau, L. M., Beverly, J. L., Juraska, J. M. Effect of the estrous cycle on water maze acquisition depends on the temperature of the water. Behavioral Neuroscience. 118 (4), 863-868 (2004).
  59. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , (2020).
  60. Campbell, C., Schwartz, N. The impact of constant light on the estrous cycle of the rat. Endocrinology. 106 (4), 1230-1238 (1980).
  61. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Osterburg, H. H., Finch, C. E. Altered profiles of estradiol and progesterone associated with prolonged estrous cycles and persistent vaginal cornification in aging C578L/6J mice. Biology of Reproduction. 24 (4), 784-794 (1981).
  62. Rivest, R. W. Sexual maturation in female rats: Hereditary, developmental and environmental aspects. Experientia. 47 (10), 1026-1038 (1991).
  63. CD® (Sprague Dawley) IGS Rat. Charles River Laboratories Available from: https://www.criver.com/products-services/find-model/cd-sd-igs-rat?region=3611 (2021)
  64. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. JoVE. , (2020).
  65. Circulatory System. Biology Corner Available from: https://www.biologycorner.com/worksheets/rat_circulatory.html (2021)
  66. Urogenital System. n.d.). Biology Corner Available from: https://www.biologycorner.com/worksheets/rat_circulatory.html (2021)
  67. . Anatomical foundations of neuroscience: Mini-atlas of rat's brain. Anatomy and Cell Biology 9535b Available from: https://instruct.uwo.ca/anatomy/530/535downs.htm (2008)
  68. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS One. 7 (4), 1-5 (2012).
  69. Marcondes, F. K., Bianchi, F. J., Tanno, A. P. Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations. Brazilian Journal of Biology. 62 (4), 609-614 (2002).
  70. Champlin, A. K., Dorr, D. L., Gates, A. H. Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
  71. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6 (5), (2020).
  72. Bartos, L. Vaginal impedance measurement used for mating in the rat. Laboratory Animals. 11 (1), 53-55 (1977).
  73. Belozertseva, I. V., Merkulov, D. D., Vilitis, O. E., Skryabin, B. V. Instrumental method for determining the stages of the estrous cycle in small laboratory rodents. Laboratory Animals for Scientific Research. (4), (2018).
  74. Ramos, S. D., Lee, J. M., Peuler, J. D. An inexpensive meter to measure differences in electrical resistance in the rat vagina during the ovarian cycle. Journal of Applied Physiology. 91 (2), 667-670 (2001).
  75. Singletary, S. J., et al. Lack of correlation of vaginal impedance measurements with hormone levels in the rat. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (6), 37-42 (2005).
  76. Bretveld, R. W., Thomas, C. M., Scheepers, P. T., et al. Pesticide exposure: the hormonal function of the female reproductive system disrupted. Reproductive Biology Endocrinology. 4 (30), (2006).
  77. MacDonald, J. K., Pyle, W. G., Reitz, C. J., Howlett, S. E. Cardiac contraction, calcium transients, and myofilament calcium sensitivity fluctuate with the estrous cycle in young adult female mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 306 (7), 938-953 (2014).
  78. Koebele, S. V., Bimonte-Nelson, H. A. Modeling menopause: The utility of rodents in translational behavioral endocrinology research. Maturitas. 87, 5-17 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved