Monitoramento do ciclo estrous de roedores utilizando lavage vaginal: não existe tal coisa como um ciclo normal

Resumo

Este estudo detalha os fatores cruciais a serem considerados em projetos experimentais envolvendo ratos fêmeas. Em um sentido maior, esses dados servem para diminuir o estigma e auxiliar no desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico e intervenção mais inclusivas.

Resumo

A metodologia atual estabelece uma abordagem reprodutível, padronizada e econômica para monitorar o ciclo estrous de ratos adolescentes estrous fêmeas Sprague Dawley (SD). Este estudo demonstra a complexidade dos ciclos hormonais e o amplo espectro de compreensão necessário para a construção de uma técnica de monitoramento confiável e válida. Através de um exame aprofundado do desenho experimental principal e dos elementos processuais, esta descrição do ciclo e seus princípios fundamentais fornece um quadro para maior compreensão e desconstrói equívocos para replicação futura.

Juntamente com um esboço do processo de coleta de amostras empregando lavage vaginal, o procedimento descreve o mecanismo de categorização de dados no modelo de quatro estágios de proestrus, estrus, metestrus e diestrus. Essas etapas são caracterizadas por uma nova abordagem proposta, utilizando os 4 determinantes categorizadores da condição de fluido vaginal, tipo celular(s) presente, arranjo celular e quantidade celular no momento da coleta. Variações de cada estágio, amostras favoráveis e desfavoráveis, a distinção entre cíclica e acicllicidade e representações gráficas dos componentes categorizadores coletados são apresentadas juntamente com práticas interpretativas e organizacionais eficazes dos dados. No geral, essas ferramentas permitem a publicação de faixas de dados quantificáveis pela primeira vez, levando à padronização dos fatores de categorização após a replicação.

Introdução

Novas contribuições
O ciclo estrous de roedores tem sido identificado como um indicador essencial de bem-estar. No entanto, vieses inconscientes de investigadores e interpretações imprecisas sobre o corpo feminino dificultam a comunidade científica. A própria etimologia da palavra "estrous" implica um senso de inferioridade e negatividade. Eurípides usou o termo para descrever um "frenesi" ou loucura, Homer para descrever pânico, e Platão para descrever um impulso irracional. Este estudo destaca como essas perspectivas primitivas influenciam a comunidade científica atual e abordam essas preocupações através de um novo paradigma de mosaico — uma combinação atualizada de métodos previamente estudados, expandida em escopo para uma abordagem mais abrangente.

O estudo e o uso dessa técnica são necessários, em primeiro lugar, pois não há técnica de monitoramento padronizada e abrangente, e as práticas de interpretação de dados podem ser pouco claras. Em segundo lugar, embora as características do ciclo estrous dependam da estudo de ratos individuais, elas são muitas vezes universalizadas. Em terceiro lugar, enquanto os ciclos hormonais são processos rotineiros e benéficos, eles são cercados por estigmas perigosos explorados na seção "Tradução para Humanos". Este estudo tem como objetivo abordar essas três questões de três maneiras — (A) descrevendo uma técnica de monitoramento de ciclo estrous profunda e esclarecendo como os resultados podem ser interpretados, (B) delineando métodos que mantêm a integridade e a individualidade de cada ciclo, e (C) chamando a atenção para equívocos que perpetuam práticas infundadas.

Este estudo também é único em seu foco em ratos adolescentes, período marcado por mudanças cruciais de desenvolvimento que lançam luz sobre diversas manifestações comportamentais, anatômicas e fisiológicas na idade^{adulta 1}. A construção de um projeto experimental padronizado para monitorar ciclos hormonais em uma população sub-pesquisada, ao mesmo tempo em que a desconstrução de vieses comuns permitirá o desenvolvimento de correlações hormonais confiáveis e válidas ^2,3,4 e a determinação de interrupções do ciclo dependentes da condição ^5,6,7,8,9,10 . Em última análise, essas novidades servem para ampliar critérios diagnósticos, tratamentos e intervenções de várias preocupações com o bem-estar.

Definições e usos fundamentais
O ciclo estrous é uma coleção de processos fisiológicos dinâmicos que ocorrem em resposta aos três hormônios esteroides sexuais femininos oscilantes: estradiol, hormônio leuteinizador (LH) e progesterona (Figura 1A,B). As interações entre o sistema nervoso endócrino e central regulam o ciclo, que na maioria das vezes persiste por 4-5 dias e se repete desde o início da maturação sexual até senescência reprodutiva e/ou cessação. Ele é dividido em categorias separadas com base nos níveis hormonais — mais comumente nos 4 estágios de diestrus (DIE), proestrus (PRO), estrus (EST) e metestrus (MET), que progridem de forma circular. O número de divisões pode variar de 3 estágios¹¹ a 13 estágios¹², dependendo da natureza do estudo¹³. O menor número de divisões muitas vezes exclui o MET como um estágio e classifica-o como um período de transição de curta duração. O número maior normalmente inclui subseções que permitem uma inspeção mais aprofundada de fenômenos como desenvolvimento de tumores ou pseudopregnação espontânea, o estado fisiológico da gravidez sem implantação embrionária 12,14,15.

Neste estudo, os estágios foram identificados por meio de componentes do canal vaginal, denominados os 3 classificados de determinantes-células presentes, arranjo celular e quantidade celular (Figura 2A-D). Embora a condição do fluido vaginal não tenha sido monitorada neste estudo, recomenda-se incluí-lo como um quarto componente categorizador. Mais informações sobre o exame do fluido vaginal podem ser encontradas na lista de referência¹⁶. Os componentes categorizadores podem ser examinados extraindo células através de lavagem vaginal, a técnica primária recomendada no monitoramento do ciclo estrous moderno. Embora os processos fisiológicos aprofundados dentro de cada etapa estejam fora do escopo deste estudo, mais informações podem ser encontradas na literatura¹⁷.

O uso e o desenvolvimento contínuo desta técnica de monitoramento de ciclo estrous está enraizado nas conexões entre hormônios esteroides sexuais e a função de sistemas corporais como o sistema cardiovascular¹⁸, sistema endócrino⁸ e sistema nervoso central 19,20,21. Ao mesmo tempo, o monitoramento do ciclo estrous pode nem sempre ser necessário quando os roedores femininos estão envolvidos 22,23,24,25. Em vez disso, é importante primeiro considerar se as diferenças sexuais foram relatadas na área específica do estudo, o que pode ser ainda mais explorado nas revisões publicadas^22,23. Embora o monitoramento do ciclo estrous seja vital em um amplo espectro de investigações de pesquisa, não deve ser visto como um obstáculo para incluir roedores fêmeas em experimentos. Embora essa técnica possa parecer complexa e demorada, o procedimento em si pode levar menos de 15 minutos para ser concluído, dependendo do investigador, e é econômico. No geral, a inclusão de roedores femininos em estudos científicos é vantajosa para a compreensão dos sistemas corporais, das diversas condições e patologias e do bem-estar geral, uma vez que esses desenvolvimentos têm sido baseados principalmente no modelo corporal masculino.

Parâmetros universais e variabilidades naturais no roedor
Estabelecer faixas para aspectos vistos como "típicos" é necessário para definir padrões de ciclo padrão, definir parâmetros para fins comparativos e analíticos e detectar anormalidades e outliers. Ao mesmo tempo, também é importante reconhecer que o ciclo de cada rato é único, e são esperados desvios baseados em cepas animais, processos fisiológicos e condições ambientais. Na verdade, um dos aspectos mais "normais" do ciclo estrous é a variabilidade. Isso é visto no comprimento total do ciclo, com um intervalo de 3-38 dias^26,27; a idade de maturação sexual que pode variar de 32 a 34 dias a várias semanas 28,29,30; o que é considerado acíclico¹¹, e os padrões determinantes categorizadores ^11,13. No geral, não há um modelo universal para o ciclo estrous, e traduzir isso tanto para a comunidade científica quanto para o público em geral é uma parte importante do processo experimental.

Pontos de tempo experimentais e idade do desenvolvimento
Reconhecer esse princípio de variabilidade auxilia na construção de um design experimental confiável e válido. Por exemplo, o início do monitoramento do ciclismo estrous depende do desenvolvimento anatômico e fisiológico dos ratos, que varia de acordo com fatores ambientais e fisiológicos. O monitoramento não pode começar até o desenvolvimento da abertura vaginal (VO), que é o orifício vaginal externo cercado pela vulva que leva à porção interna do canal vaginal (Figura 3A-D). Embora o VO muitas vezes se desenvolva plenamente entre as idades de 32 e 34 dias, ele permanece individualizado para cada sujeito, e muito sobre o processo permanece desconhecido. Esta abertura tem sido utilizada para identificar o início do amadurecimento sexual, que tem sido associado ao aumento do estradiol³¹, ao amadurecimento do eixo hipotalâmica-pituitário-ovário³² e à primeira ovulação em ratos 17,33,34,35. No entanto, publicações recentes descobriram que é apenas um marcador indireto do desenvolvimento reprodutivo, pois pode se desacoplar de ocorrências hormonais e de desenvolvimento em ambientes desfavoráveis³¹ e pode representar mudanças nos níveis estradiol em vez de maturação sexual³³. Portanto, recomenda-se não depender apenas do VO para determinar a idade do desenvolvimento e como qualificação para o monitoramento do ciclo estrous³⁶, mas também utilizar o aparecimento do primeiro estágio EST e a cornificação das células epiteliais³⁰ para marcar o início da maturação sexual.

O peso corporal está notavelmente correlacionado com a idade de desenvolvimento durante o período adolescente em roedores^30,37 e, portanto, também pode auxiliar na determinação da idade do desenvolvimento nesse período. Os mecanismos propostos relacionados a esse fenômeno incluem a estimulação de hormônios necessários para o desenvolvimento reprodutivo, como o hormônio do crescimento, e a inibição do eixo adrenal hipotalâmico-pituitário (HPA) pelo regulador do apetite, a leptina³⁰. No entanto, não é recomendável utilizar essa medida como único indicador da idade do desenvolvimento devido à grande variância observada entre ratos entre espécies e fornecedores de fornecedores³⁸. A variabilidade observada no desenvolvimento do VO e do peso corporal exemplificam a importância do conceito no processo experimental global.

Tradução para humanos: contextos culturais e científicos
A relação translacional dos estudos reprodutivos animal-humano é bidirecional. Os resultados de estudos em animais influenciam a forma como os processos humanos são avaliados, abordados e analisados³⁹. A percepção do sistema reprodutivo humano e seus processos relacionados influenciam a forma como os animais são estudados. De fato, uma das indicações mais altas para novas pesquisas nessa área decorre de crenças socioculturais tendenciosas relacionadas a ciclos hormonais que influenciam o processo científico. Muitas dessas convenções são derivadas de uma aversão cultural geral à discussão da menstruação, o que levou a uma lacuna de dados no conhecimento bem fundamentado^40,41. Isso tem um espectro de consequências que vão de menor a letal — desde altura de prateleira e tamanho do smartphone até a montagem da armadura da polícia e diagnósticos de câncer perdidos⁴².

A descrição da menstruação como insalubre, destrutiva e tóxica — vista em textos reverenciados, mídia, dicionários e ensinamentos médicos — é conservada por publicações científicas. Isso ocorre através de descrições imprecisas e tendenciosas de ciclos hormonais, o isolamento do sistema reprodutivo de suas contrapartes neuroendócrinas e influências ambientais, e a perspectiva reducionista da conclusão de um ciclo como uma "falha na ^{concepção"43,44}. Isso leva à criação de práticas experimentais insalubres, como a omissão de variáveis externas que influenciam os ciclos hormonais, determinando os pontos de partida e os pontos finais baseados apenas em desenvolvimentos anatômicos e medindo o avanço do ciclo de forma linear e não circular. Apesar da correlação direta entre fatores socioculturais e consequências biológicas, muitas vezes não é considerada na literatura científica. Através da inspeção de publicações mais holísticas 43,44,45, os pesquisadores podem desconstruir esses estigmas e criar projetos experimentais mais confiáveis e válidos.

Protocolo

Todos os métodos de manuseio e procedimento descritos neste protocolo estão alinhados com as diretrizes de cuidados e uso de animais dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Pepperdine University e pelo Comitê de Pesquisa Animal (ARC) do Chanceler da UCLA.

1. Cuidados e uso de animais

1. Adquirir ratos fêmeas, em números de acordo com a análise de energia, e ratos machos para promover o efeito Whitten ou ciclismo mais consistente⁴⁶. Determinar a cepa com base no objetivo do estudo em bancos de dados conhecidos⁴⁷.
   NOTA: Os dados atuais refletem o do Programa Internacional de Padronização Genética (IGS) da adolescente na presença de ratos SD masculinos localizados nos laboratórios da Pepperdine University e da UCLA como parte de um estudo colaborativo. Esses ratos chegaram em grupos separados aos 28 dias de idade, e a progressão do ciclo estrous foi monitorada por 10 ou 20 dias para demonstrar diferenças em níveis agudos e crônicos, começando aos 34 dias de idade (após um período de aclimatação de 7 dias).
2. Antes do manuseio, permita uma quarentena e/ou um período de aclimatação para estabilização fisiológica após o transporte e ajuste ao novo ambiente.
   NOTA: Foi citado um período mínimo de 3 dias, com um período de 7 dias recomendado 48,49,50,51,52. No geral, isso depende das condições de transporte, da cepa animal e dos objetivos do estudo.
3. Certifique-se de que o estresse seja reduzido com o uso de um período de aclimatação, pois o estresse pode interromper o funcionamento adequado do sistema reprodutivo⁵³. No entanto, não compuscompensa ao tentar eliminá-lo, pois uma quantidade moderada de estresse é benéfica para o bem-estar dos animais⁵¹.
4. Ratos hospedeiros em ambiente de temperatura ( 68-79 °F, ou seja, 20-26 °C) e controlados pela umidade (30-70%) ao entrar em contato com os gerentes de vivarium ou laboratório e garantir essas características. Distribua água e chow ad libitum com componentes de nutrientes listados no site da empresa e limpeza de gaiolas uma vez por semana.
   NOTA: Neste estudo, os ratos foram alojados em grupos de 2 separados por sexo em gaiolas de plástico reutilizáveis transparentes de 19" x 10" x 8" e tiveram acesso à cama corncob que era alterada uma vez por semana. A temperatura foi mantida em 70 °F e umidade em 35-79%, com média de 62%.
5. Verifique o desenvolvimento de rabo de anel ou necrose isquêmica da cauda e dos dedos dos dedos para obter evidências de baixos níveis de umidade relativa e temperaturas extremas, o que pode causar a alternância de respostas biológicas.
   NOTA: Temperatura e umidade são importantes para o sistema reprodutivo, maturação sexual e cíclica estrous 54,55,56,57,58.
6. Garanta uma iluminação adequada e equilibrada em todo o espaço habitacional, depositando quantidades iguais de fontes de luz em todo o espaço de laboratório que atuam em um sistema claro controlado pelo tempo: escuro.
   NOTA: Aqui, um ciclo claro de 12:12 h: escuro, com luzes acesas das 06:00-18:00 h, foi controlado por lâmpadas LED Lineares de 2.550 lúmen.
7. Siga os requisitos lux fornecidos⁵² com base em variações de pigmentação, idade, tensão, sexo e estado hormonal dos animais.
   NOTA: Quando os pesquisadores categorizam as amostras de células coletadas, a iluminação consistente permitirá detecção visual adequada e estadiamento^{confiável 59}. A duração e intensidade da luz estão diretamente relacionadas ao sistema reprodutivo, ao amadurecimento sexual e ao ciclismo estrous 54,55,56,57,60,61.

2. Preparação de equipamentos e experimentos

1. Revise os determinantes categorizadores (vistos na Figura 2A): como identificar cada etapa do ciclo estrous e como operar o microscópio e o equipamento de câmera.
2. Certifique-se de que cada assunto a ser monitorado tenha atingido o amadurecimento sexual e mostre indicadores apropriados de desenvolvimento — VO, peso corporal e idade. Pesar os ratos e examiná-los para VO entre o mesmo tempo todos os dias para comparações precisas e transferi-los com um método de manuseio aprovado. Consulte o veterinário afiliado à universidade se um animal perde mais de 20% do seu peso corporal anterior.
   NOTA: O VO permanece caudal à abertura uretral e craniana ao ânus, localizado entre os dois, como descrito na Figura 3.
3. Como esses fatores são dependentes de tensão, verifique com o fornecedor as especificações e considere fatores ambientais específicos para o laboratório⁶².
   NOTA: Em geral, isso ocorrerá entre 32-34 dias de idade e um peso corporal médio variando de 75-150 gramas⁶³ para ratos SD e é indicado por uma abertura em forma circular previamente coberta por um baia membranouso.
4. Selecione um período de coleta de amostras apropriado para o grupo de ratos que está sendo monitorado para evitar a coleta de amostras transitórias. Primeiro, prove alguns animais em 2 ou 3 pontos de tempo diferentes ao longo do dia para determinar o horário em que a maioria dos estágios de ciclo estão presentes (por exemplo, amostragem às 12:00 horas, 13:00 horas e 14:00 horas para diferentes animais). Complete a lavagem vaginal ao mesmo tempo todos os dias para uma encenação consistente e confiável.
   NOTA: Foi relatado que as horas entre 12:00 e 14:00 h são melhores para capturar todas as etapas. Neste estudo, o monitoramento do ciclo estrous ocorreu entre 12:00 e 14:00 h, manuseado com o porão estilo de compressão (ver passo 3.4). A importância do tempo de monitoramento do ciclo estrous em relação a outras intervenções experimentais (por exemplo, condicionamento comportamental, medicação) é uma área de desenvolvimento da pesquisa e pode ser ainda mais explorada¹¹. Determinar a duração do monitoramento do ciclo estrous é dependente do estudo e pode ser ainda mais explorado em estudos publicados^11,33.
5. Remova a tampa protetora do microscópio e conecte a câmera ao computador removendo a tampa da lente protetora da câmera e colocando a lente sobre a ocular do microscópio.
6. Em seguida, abra o software pré-selecionado no computador. Para usar o software selecionado neste estudo, selecione a câmera anexada ao USB localizado no lado esquerdo da tela, sob a lista de câmeras rotulada pela guia. Certifique-se de que a câmera USB está conectada corretamente ao computador, que lerá No Device sob a lista de câmeras rotulada pela guia, se não.
7. Uma vez que a câmera USB tenha sido selecionada sob a guia, ligue o interruptor de luz do microscópio localizado na base.
8. Crie uma pasta no computador designado para as fotos de amostra de celular. Crie uma pasta de arquivo para cada dia separado que os dados são coletados, pré-preparados antes que as imagens sejam tiradas.
9. Com o equipamento preparado, recupere a gaiola do sujeito de seu local de detenção e leve-a para a estação de coleta de amostras.

3. Coleta de células vaginais

1. Recupere uma seringa descartável e encha cada uma das seringas com 0,2 mL de NaCl estéril de 0,9%. Se as bolhas de ar estiverem presentes, gire suavemente a seringa do barril até que todas as bolhas de ar tenham atingido a ponta aberta da seringa e expulse o ar. Se ainda houver bolhas de ar presentes, expulse a solução de volta para o recipiente de NaCl e refil até que não haja nenhuma.
   NOTA: O excesso de movimentos pode resultar na formação de mais bolhas de ar.
2. Devolva cada seringa ao plástico para manter um campo estéril, com a ponta da seringa dentro da porção selada do embrulho.
3. Abra a gaiola e levante suavemente o assunto pela base da cauda ou pelo tronco do corpo, fechando a tampa da gaiola para evitar que outros saiam. Selecione um método de retenção entre os listados abaixo com base na preferência pessoal e resposta animal.
4. Use o porão estilo de compressão para ratos adolescentes colocando o sujeito contra a região superior do tórax, com o nariz do sujeito apontando para o chão. Antes de iniciar o cotonete, certifique-se de que o sujeito esteja comprimido o suficiente para evitar o movimento, mas é confortável e seguro no porão. Exponha o canal vaginal do sujeito flexionando suavemente a cauda antes de inserir a seringa.
5. Use o Elevador de Perna Traseira para ratos adultos colocando as patas dianteiras do animal na parte superior ou lateral da gaiola, enquanto a cauda e as barras traseiras são contidas com um segurar suavemente entre o primeiro e o segundo dedo, deixando o polegar livre para operar a seringa⁶⁴.
6. Permita que os animais se aclimatar ao manuseio e monitoramento. Manuseie os animais com cuidado, mas com segurança, para reduzir o excesso de estresse e proteger o pesquisador de agressões como a mordida.
   NOTA: Os primeiros dias de monitoramento podem não produzir os resultados desejados à medida que os animais se aclimatam às suas condições. O manuseio dos animais para coletar pesos corporais durante o período de aclimatação pode auxiliar nessa transição³³.
7. Enquanto segura a seringa firme com o dedo indicador e o dedo médio, insira a ponta da seringa (não mais de 2 mm) em um ângulo paralelo ao canal vaginal. Lentamente expulse o NaCl para dentro do canal empurrando o êmbolo para dentro. Não insira a seringa mais adiante no canal, pois isso pode interromper o ciclo estrous.
8. Extrair o NaCl do canal vaginal puxando o êmbolo da seringa para longe do forro epitelial (para cima). Se houver dificuldade em manter o sujeito no porão durante esse processo, coloque-os de volta na gaiola por um curto período de descanso antes de tentar a extração de NaCl.
9. Uma vez coletada a amostra celular, coloque o sujeito de volta na gaiola e repita este procedimento para cada animal antes que todas as amostras sejam avaliadas sob o microscópio.
   NOTA: Alternativamente, cada amostra pode ser coletada e avaliada antes de passar para o próximo animal. Um animal pode exigir uma segunda lavagem se a amostra não puder ser categorizada. A mesma seringa da coleção inicial pode ser reutilizada se não entrar em contato diretamente com o soro fisiológico no recipiente e apenas para o mesmo animal.

4. Avaliação amostral

1. Comece a categorização examinando a amostra de fluido vaginal extraída. Registo a viscosidade como viscoso ou não e a coloração como opaca ou transparente no documento de descrição ou outro sistema de gravação.
   NOTA: Esta seção do protocolo pode ser realizada no momento da coleta da amostra ou posteriormente.
2. Expelir 2-3 gotas do fluido em um slide de microscópio e coloque um vidro de tampa de microscópio em cima do slide. Coloque o vidro de cobertura no deslizamento do microscópio do topo do slide para o fundo ou de um lado do slide para o outro para evitar a formação de bolhas de ar. Se possível, deixe aproximadamente metade da amostra coletada na seringa se for necessário um exame mais aprofundado e para evitar que um excesso de fluido seja colocado no slide.
3. Localize as células coletadas movendo o deslizamento do microscópio através do palco. Se houver poucas células ou uma grande quantidade de detritos, expulse o fluido restante em um novo slide e reexamina. Se a quantidade de amostra deixada na seringa for insuficiente ou se a segunda gota estiver apresentando problemas semelhantes, colete outra amostra do sujeito antes de tentar identificar o estágio do ciclo estrous.
4. Uma vez que as células tenham sido localizadas e antes de tocar no computador ou no teclado do computador, remova a única luva para evitar sujar o teclado.
5. Adquira imagens das amostras de células clicando na função rotulada Snap no lado esquerdo do painel de software.
6. Em seguida, salve o arquivo clicando em Salvar como no ícone Arquivo no canto superior esquerdo da página. Salve a foto sob uma pasta pré-rotulada no computador.
   NOTA: Modelo de etiqueta de exemplo: #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective lente usada.
7. Tire mais de uma foto em cada lente objetiva se não houver muitas células dentro de cada quadro.
   NOTA: Rótulos de exemplo para múltiplas imagens: #1_01/09/2021_EST_4x1 e #1_01/09/2021_EST_4x2.
8. Repita o procedimento para cada amostra coletada em múltiplas lentes objetivas. Inclua pelo menos uma objetificação menor, como 4x, e pelo menos uma objetificação maior, como 20x.
9. Carregue as imagens em uma unidade/pasta compartilhada ou em um disco rígido externo para que todos os pesquisadores envolvidos tenham acesso aos arquivos e haja cópias de backup disponíveis.

5. Categorização do estágio

1. Configure a tela do computador para visualizar simultaneamente as fotos tiradas e a folha de gravação (Figura 4A-C).
   NOTA: Isso permitirá que a documentação ocorra durante a visualização da amostra coletada. Esta parte do protocolo pode ser concluída no momento da coleta da amostra ou posteriormente.
2. Determine quais tipos de células estão presentes na amostra. Selecione entre as quatro opções listadas nas etapas 5.2.1-5.2.4 usando os critérios e registos.
   1. Epitelial queratinizada anucleada (AKE)/células epiteliais cornificadas
      1. Procure por células irregulares ou com bordas angulares, como visto na Figura 2B e Figura 5C, que apesar da falta de núcleos, podem mostrar áreas redondas leves (fantasmas nucleares) dentro da célula que representam onde um núcleo já esteve presente. Use ampliação maior, como 20x ou mais, para diferenciar entre tais células nucleadas e anucleadas.
      2. Use uma ampliação mais elevada para distinguir a porção queratinizada ou cornificada da célula — uma fina camada de células sem núcleos e preenchidas com queratina — se desejar.
         NOTA: Além de sua aparência irregular, estes também podem ser distinguidos por como eles podem dobrar ou desmontar, criando estruturas irregulares e alongadas conhecidas como barras de queratina.
   2. Grandes células epiteliais nucleadas (LNE)
      1. Procure por essas células tipicamente redondas e em forma de poligonal envoltas em bordas irregulares, irregulares ou angulares.
      2. Observe como seus núcleos podem assumir várias formas, variando de intacto a degenerado ou pykontic, relacionado à condensação irreversível da cromatina no núcleo de uma célula submetida à morte ou deterioração, como visto na Figura 2B e Figura 5D1,2. Tome nota de como esses núcleos ocupam menos espaço do que o citoplasma dentro da célula, com uma proporção nuclear menor para citoplasmática (N:C) do que as pequenas células epiteliais. Cuidado com os grânulos citoplasmológicos que podem ser vistos em ampliações mais altas¹³.
   3. Leucócitos (LEUs)/neutrófilos/células polimorfórnucleares
      1. Procure por essas células compactas e esféricas com núcleos multilobulados (daí, conhecidos como células polimorfonucleares), que desaparecem à medida que a célula amadurece (Figura 2B e Figura 5A). Maior ampliação (por exemplo, 40x) pode ser usada para observar os núcleos multilojados.
         NOTA: Após a coleta e preparação, essas células podem condensar, dobrar ou romper.
   4. Pequenas células epiteliais nucleadas (SNE)
      1. Cuidado com essas células redondas e ovais que são maiores do que os neutrófilos descritos acima.
      2. Observe os núcleos redondos dessas células epiteliais não enquetinadas (Figura 2B), que tomam uma quantidade maior de espaço do que o citoplasma dentro da célula, criando uma maior razão N:C em relação às grandes células epiteliais.
         NOTA: Após a coleta e preparação, essas células podem dobrar ou se sobrepor para criar uma forma que se assemelha a uma corda ou barra, como demonstrado na Figura 5B1.
3. Examine como as células presentes na amostra são organizadas para cada objetificação. Use a objetificação inferior, como 4x, para visualizar uma visão representativa do arranjo celular geral. Regissuor se as células estão agrupadas (C), uniformemente dispersas (ED) ou dispersas aleatoriamente (RD) (ver Figura 4C), e observe a organização específica de cada tipo de célula (por exemplo, pequenas células epiteliais nucleadas são agrupadas, e os neutrófilos são distribuídos uniformemente).
4. Em seguida, estime visualmente e regise a quantidade total de células (um smidge, moderada, numerosa) e as quantidades celulares individuais (porcentagem de cada tipo de célula presente).
   NOTA: Um smidge representa o menor número de células presentes que podem ser utilizadas para determinar a categorização da amostra, numerosos representam a presença de um número incontável de células que são responsáveis pela maioria, se não todo o espaço no slide ou são empilhados em cima umas das outras, e um número moderado de células representa um número comparativamente médio de células (exemplos vistos na Figura 5A-D e Figura 6A-D).
5. Observe se há algum desvio dos critérios listados ou aspectos típicos do sujeito específico na categoria "anormalidades" e consulte um veterinário, se necessário.
6. Determine qual estágio de ciclo estrous está sendo apresentado na amostra utilizando os componentes de categorização e as descrições abaixo.
   1. Morrer
      1. Procure leus como o tipo de célula dominante ou único presente, dispostos de forma desajeitada no início do DIE, mas mais dispersos em estágios finais.
         NOTA: Durante a transição para o DIE, a quantidade de células pode diminuir à medida que as células epiteliais começam a se quebrar, como visto na Figura 6D1. Ao mesmo tempo, o número de LEUs começa a aumentar, e elas tendem a ser organizadas de forma desajeitada inicialmente e se dispersam ao longo do tempo.
      2. Observe que a quantidade total de células pode ser relativamente baixa, na maioria das vezes nos estágios posteriores do período DIE, no segundo ou terceiro dia.
      3. Observe a alta quantidade de muco que pode estar presente nesta etapa, que apresenta como fios concentrados de LEUs (Figura 5A1). Cuidado com pequenos aglomerados ou fios celulares de células SNE que acompanham as LEUs durante fases tardias na transição para PRO (Figura 5A1,2).
      4. Observe a aparência viscosa e opaca do fluido vaginal ao fazer a transição para, totalmente transitória e a transição para fora do DIE.
         NOTA: A duração média desta etapa é de 48 horas durante um ciclo de 4 dias e possivelmente 72 h durante um ciclo de 5 dias.
   2. Pró
      1. Procure por células SNE como as células dominantes e para células LEU, LNE e/ou AKE que podem ser vistas em números baixos. Use alta objetificação para observar a aparência granular das células SNE que são tipicamente dispostas em aglomerados, folhas ou fios durante esta fase (Figura 5B1,2).
      2. Observe a aparência viscosa e opaca do fluido vaginal ao mover-se do DIE para o PRO, e como ele se torna não-vísco e transparente uma vez totalmente transicionado para o estágio PRO (duração média de 14 h em ratos).
   3. Est
      1. Procure o domínio das células AKE, uma diminuição das células SNE no EST, e um aumento no número e tamanho das células à medida que o EST continua^{em 11,13}.
      2. Anote a característica distintiva do arranjo muitas vezes agrupado das células AKE, na forma de barras de queratina ou contendo núcleos fantasmas, que podem se tornar mais aleatoriamente dispersos na transição de PRO (Figura 6B) e para MET (Figura 6C).
      3. Observe a característica não-ocous e fluido vaginal transparente, que pode ser esperado à medida que os ratos estão em transição, totalmente transicionados para, e transicionados para fora do EST.
         NOTA: A progressão do EST inclui muita diversificação (Figura 5C e Figura 6B, C). O estágio normalmente ocorre por uma média de 24 horas em um ciclo de 4 dias ou possivelmente 48 horas em um ciclo de 5 dias.
   4. Conheci
      1. Procure por maior número de células SNE e LNE à medida que o rato está em transição para MET, seja dominante em termos de proporção celular dentro do canal ou perto da mesma proporção das LEUs^11,13. Além disso, anote a maior quantidade de detritos no MET e as transições do que em outros estágios devido à decadência das células epiteliais após o EST e a mudança para o DIE.
      2. Observe a falta de arranjo consistente, pois todos os tipos de células são vistos e em várias quantidades (Figura 5D1-3). No entanto, procure as LEUs que estão embaladas ou agrupadas nas proximidades das células epiteliais nos estágios iniciais que podem retornar ao arranjo desajeitado ao fazer a transição para o DIE.
      3. Observe a aparência não vícua e transparente do fluido vaginal nesta fase e a mudança para uma aparência mais viscosa e opaca ao se mover para DIE.
         NOTA: A duração média desta etapa é de 6-8 h.
7. Amostras de rótulos em transições com o estágio em que o sujeito está se movendo, com a transição entre parênteses para rastrear quando estas são coletadas. Podem ser encontradas mais informações sobre como distinguir entre essas 4 etapas e suas transições nos Resultados Representativos.
   NOTA: Como as amostras coletadas são estáticas e o ciclo é dinâmico, os slides podem representar transições entre os estágios (vistos na Figura 6A-D).
8. Complete este processo para cada animal até que a fase de monitoramento esteja completa.
9. Nos dias 11 (45 dias de idade) ou 21 (55 dias de idade), eutanize os ratos com 5% de isoflurane e 2% de oxigênio antes de uma decapitação de guilhotina. Esses pontos de tempo podem variar dependendo da natureza do estudo.

Resultados

Os dados atuais refletem o do Programa Internacional de Padronização Genética (IGS) da adolescente na presença de ratos SD masculinos. Esses animais foram localizados nos laboratórios pepperdine e ucla como parte de um estudo colaborativo. A Figura 5 apresenta múltiplas variações dos 4 estágios do ciclo. A Figura 5A1 foi identificada como uma amostra de diestrus com vários tipos de células presentes. Este exemplo demonstra que amostra...

Discussão

Principais passos e considerações importantes
Certas etapas críticas no protocolo fornecido requerem ênfase, especialmente dentro da coleta de células vaginais. Durante a extração do fluido vaginal, garantir o ângulo adequado e a profundidade da inserção da seringa é fundamental para produzir resultados satisfatórios e, em última instância, prevenir irritação, lesão ou estimulação cervical ao animal. A estimulação do colo do útero pode ser uma fonte de indução de pseudopregnaç...

Materiais

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AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
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Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad	Medline	EAN: 0480196288558  Global Trade Identification Number: 40080196288558	https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4