ניטור מחזור אסטרוס מכרסמים תוך שימוש בשטיפה נרתיקית: אין דבר כזה מחזור רגיל

Summary

מחקר זה מפרט את הגורמים המכריעים שיש לקחת בחשבון בתכנון ניסיוני המערב חולדות נקבות. במובן רחב יותר, נתונים אלה משמשים להפחתת הסטיגמה ומסייעים בפיתוח כלי אבחון והתערבות כוללניים יותר.

Abstract

המתודולוגיה הנוכחית קובעת גישה ניתנת לשחזור, סטנדרטית וחסכונית לניטור המחזור האסטרוס של חולדות מתבגרות מסוג ספראג דאולי (SD) נקבות. מחקר זה מדגים את המורכבות של מחזורים הורמונליים ואת הספקטרום הרחב של ההבנה הנדרשת לבניית טכניקת ניטור אמינה ותקפה. באמצעות בחינה מעמיקה של תכנון ניסויי עיקרי ואלמנטים פרוצדורליים, תיאור זה של המחזור ועקרונות היסוד שלו מספק מסגרת להבנה נוספת ולפירוק תפיסות מוטעות לשכפול עתידי.

יחד עם מתווה של תהליך איסוף הדגימות תוך שימוש בשטיפה נרתיקית, ההליך מתאר את המנגנון של סיווג הנתונים למודל בן ארבעת השלבים של בלטו, אסטרוס, מטסטרו ו-diestrus. שלבים אלה מאופיינים בגישה מוצעת חדשה, תוך שימוש ב-4 הדטרמיננטים המסווגים של מצב נוזל הנרתיק, סוג התאים הנוכחי, סידור התאים וכמות התאים בזמן האיסוף. וריאציות של כל שלב, דוגמאות חיוביות ושליליות, ההבחנה בין מחזוריות לאציקליות ותיאורים גרפיים של מרכיבי הסיווג שנאספו מוצגים לצד פרקטיקות פרשניות וארגוניות יעילות של הנתונים. באופן כללי, כלים אלה מאפשרים פרסום של טווחי נתונים הניתנים לכימות בפעם הראשונה, מה שמוביל לסטנדרטיזציה של גורמי סיווג עם שכפול.

Introduction

תרומות חדשות
מחזור האסטרוס של מכרסמים זוהה כאינדיקטור חיוני לבריאות. עם זאת, הטיות לא מודעות של חוקרים ופרשנויות לא מדויקות לגבי הגוף הנשי מעכבות את הקהילה המדעית. עצם האטימולוגיה של המילה "estrous" מרמזת על תחושה של נחיתות ושליליות. אוריפידס השתמש במונח כדי לתאר "טירוף" או טירוף, הומרוס כדי לתאר פאניקה, ואפלטון כדי לתאר דחף לא רציונלי. מחקר זה מדגיש כיצד נקודות מבט ראשוניות אלה משפיעות על הקהילה המדעית הנוכחית ומתייחס לחששות אלה באמצעות פרדיגמת פסיפס חדשנית – שילוב מעודכן של שיטות שנחקרו בעבר, שהורחבו בהיקפן לגישה מקיפה יותר.

המחקר והשימוש בטכניקה זו נחוצים, ראשית, מכיוון שאין טכניקת ניטור סטנדרטית ומקיפה, ושיטות פרשנות נתונים יכולות להיות לא ברורות. שנית, למרות שמאפייני מחזור האסטרוס תלויים בכך שחולדות בודדות נחקרות, הם לעתים קרובות אוניברסליים. שלישית, בעוד שמחזורים הורמונליים הם תהליכים שגרתיים ומועילים, הם מוקפים בסטיגמה מסוכנת הנחקרת בפרק 'תרגום לבני אדם'. מחקר זה נועד לטפל בשלוש הסוגיות הללו בשלוש דרכים – (A) על ידי תיאור טכניקת ניטור מחזורית אסטרוס מעמיקה והבהרת האופן שבו ניתן לפרש את התוצאות, (B) על ידי התוויית שיטות השומרות על השלמות והאינדיבידואליות של כל מחזור, ו-(C) על ידי הפניית תשומת הלב לתפיסות מוטעות המנציחות פרקטיקות לא מבוססות.

מחקר זה ייחודי גם בהתמקדותו בחולדות מתבגרות, תקופה המאופיינת בשינויים התפתחותיים מכריעים השופכים אור על ביטויים התנהגותיים, אנטומיים ופיזיולוגיים שונים בבגרות¹. בניית תכנון ניסיוני סטנדרטי לניטור מחזורים הורמונליים באוכלוסייה שאינה נחקרת כראוי תוך פירוק הטיות נפוצות תאפשר פיתוח של מתאמים הורמונליים אמינים ותקפים ^2,3,4 וקביעת שיבושים במחזור התלויים במצב ^{5,6,6,7,8,9,10} . בסופו של דבר, חידושים אלה משמשים להרחבת קריטריונים לאבחון, טיפולים והתערבויות של חששות בריאותיים שונים.

הגדרות ושימושים בסיסיים
מחזור האסטרוס הוא אוסף של תהליכים פיזיולוגיים דינמיים המתרחשים בתגובה לשלושת הורמוני המין הסטרואידים הנשיים המתנדנדים: אסטרדיול, הורמון לוטיניזציה (LH) ופרוגסטרון (איור 1A,B). אינטראקציות בין מערכת העצבים האנדוקרינית והמרכזית מווסתות את המחזור, שנמשך לרוב 4-5 ימים וחוזר על עצמו מתחילת ההבשלה המינית ועד לסנסנציה ו/או הפסקה של הרבייה. הוא מחולק לקטגוריות נפרדות המבוססות על רמות ההורמונים – לרוב ל-4 השלבים של diestrus (DIE), proestrus (PRO), estrus (EST) ו-metestrus (MET), המתקדמים באופן מעגלי. מספר החטיבות יכול לנוע בין 3 שלבים¹¹ ל -13 שלבים¹², בהתאם לאופי המחקר¹³. המספר הנמוך יותר של החטיבות אינו כולל לעתים קרובות את MET כשלב ומסווג אותו כתקופת מעבר קצרה למשך זמן. המספר הגבוה יותר כולל בדרך כלל תתי-סעיפים המאפשרים בחינה מדוקדקת יותר של תופעות כגון התפתחות הגידול או פסאודו-אופרגנטיה ספונטנית, המצב הפיזיולוגי של ההריון ללא השתלה עוברית 12,14,15.

במחקר זה זוהו השלבים באמצעות מרכיבים של תעלת הנרתיק, שנקראו 3 הדטרמיננטים המסווגים - סוג(ים) של תאים, סידור תאים וכמות תאים (איור 2A-D). אמנם מצבו של נוזל הנרתיק לא היה במעקב במחקר זה, אך מומלץ לכלול אותו כמרכיב סיווג רביעי. מידע נוסף על בדיקת נוזל הנרתיק ניתן למצוא ברשימת ההפניות¹⁶. ניתן לבחון את מרכיבי הסיווג על ידי חילוץ תאים באמצעות שטיפה נרתיקית, הטכניקה העיקרית המומלצת בניטור מחזורי אסטרוס מודרני. בעוד שהתהליכים הפיזיולוגיים המעמיקים בתוך כל שלב נמצאים מחוץ לתחום מחקר זה, מידע נוסף ניתן למצוא בספרות¹⁷.

השימוש והמשך הפיתוח של טכניקת ניטור מחזור אסטרוס זו מושרש בקשרים בין הורמוני סטרואידים מיניים לבין תפקוד מערכות הגוף כגון מערכת הלב וכלי הדם¹⁸, מערכת אנדוקרינית⁸ ומערכת העצבים המרכזית 19,20,21. יחד עם זאת, ייתכן שלא תמיד יהיה צורך בניטור מחזורי אסטרוס כאשר נקבות מכרסמים מעורבות 22,23,24,25. במקום זאת, חשוב תחילה לשקול אם דווחו הבדלים בין המינים בתחום הספציפי של המחקר, אותם ניתן לבחון עוד יותר בסקירות שפורסמו^22,23. אף על פי שניטור מחזורי אסטרוס הוא חיוני במגוון רחב של מחקרים, אין לראות בו מכשול להכללת מכרסמים נקבות בניסויים. בעוד שטכניקה זו עשויה להיראות מורכבת וגוזלת זמן רב, ההליך עצמו יכול להימשך פחות מ -15 דקות, תלוי בחוקר, והוא חסכוני. באופן כללי, הכללתם של מכרסמים נקבות במחקרים מדעיים היא יתרון להבנת מערכות הגוף, מצבים ופתולוגיות שונות ובריאות כללית, שכן התפתחויות אלה התבססו בעיקר על תבנית הגוף הגברי.

פרמטרים אוניברסליים ושונות טבעית במכרסם
קביעת טווחים להיבטים הנתפסים כ"טיפוסיים" נחוצה כדי להגדיר דפוסי מחזור סטנדרטיים, לקבוע פרמטרים למטרות השוואתיות ואנליטיות, ולזהות חריגות וחריגות. יחד עם זאת, חשוב גם להכיר בכך שהמחזור של כל חולדה הוא ייחודי, וצפויות סטיות המבוססות על זן בעלי חיים, תהליכים פיזיולוגיים ותנאי סביבה. למעשה, אחד ההיבטים ה"נורמליים" ביותר של מחזור האסטרוס הוא השתנות. זה נראה באורך המחזור הכולל, עם טווח של 3-38 ימים^26,27; גיל ההתבגרות המינית שיכול לנוע בין 32-34 ימים למספר שבועות ^28,29,30; מה שנחשב אציקלי¹¹, והדפוסים הדטרמיננטיים המסווגים ^11,13. באופן כללי, אין תבנית אוניברסלית למחזור האסטרוס, ותרגום זה הן לקהילה המדעית והן לציבור הרחב הוא חלק חשוב בתהליך הניסויי.

נקודות זמן ניסיוניות וגיל התפתחותי
הכרה בעקרון זה של השתנות מסייעת בבניית תכנון ניסיוני אמין ותקף. לדוגמה, תחילתו של ניטור מחזורי אסטרוס מסתמכת על ההתפתחות האנטומית והפיזיולוגית של החולדות, המשתנה בהתאם לגורמים סביבתיים ופיזיולוגיים. הניטור לא יכול להתחיל עד להתפתחות פתח הנרתיק (VO), שהוא פתח הנרתיק החיצוני המוקף בפות שמוביל לחלק הפנימי של תעלת הנרתיק (איור 3A-D). בעוד שה-VO מתפתח לעתים קרובות באופן מלא בין הגילאים 32 ל-34 ימים, הוא נשאר אינדיבידואלי לכל נושא, והרבה על התהליך עדיין לא ידוע. פתח זה שימש לזיהוי הופעת ההבשלה המינית, אשר נקשרה לעלייה של אסטרדיול³¹, ההבשלה של ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-השחלות³², והביוץ הראשון בחולדות 17,33,34,35. עם זאת, פרסומים אחרונים מצאו כי הוא רק סמן עקיף של התפתחות הרבייה, שכן הוא יכול להיות מנותק מהתרחשויות הורמונליות והתפתחותיות בסביבות שליליות³¹ ועשוי לייצג שינויים ברמות האסטרדיול ולא התבגרות מינית³³. לכן, מומלץ לא להסתמך אך ורק על VO כדי לקבוע את הגיל ההתפתחותי וכמזהה לניטור מחזור אסטרוס³⁶ אלא גם לנצל את המראה של שלב ה- EST הראשון וקורניפיקציה של תאי האפיתל³⁰ כדי לסמן את תחילת ההבשלה המינית.

משקל הגוף מתואם באופן בולט עם הגיל ההתפתחותי בתקופת ההתבגרות במכרסמים^30,37 ולכן יכול גם לסייע בקביעת הגיל ההתפתחותי בתקופה זו. המנגנונים המוצעים הקשורים לתופעה זו כוללים גירוי של הורמונים הדרושים להתפתחות הרבייה, כגון הורמון גדילה, ועיכוב ציר יותרת הכליה ההיפותלמית-יותרת המוח (HPA) על ידי וסת התיאבון, לפטין³⁰. עם זאת, לא מומלץ להשתמש במדד זה כאינדיקטור היחיד לגיל ההתפתחותי בשל השונות הגדולה שנראתה בין חולדות על פני מינים שונים לבין ספקי הספקים³⁸. השונות הנראית בהתפתחות ה-VO ומשקל הגוף מדגימה את חשיבותו של המושג בתהליך הניסוי הכולל.

תרגום לבני אדם: הקשרים תרבותיים ומדעיים
מערכת היחסים התרגומית של מחקרי רבייה בין בעלי חיים לבני אדם היא דו-כיוונית. התוצאות ממחקרים המבוססים על בעלי חיים משפיעות על האופן שבו מעריכים, ניגשים ומנתחים את התהליכים האנושיים³⁹. התפיסה של מערכת הרבייה האנושית והתהליכים הקשורים אליה משפיעים על האופן שבו נחקרים בעלי חיים. למעשה, אחת האינדיקציות הקולניות ביותר למחקר נוסף בתחום זה נובעת מאמונות חברתיות-תרבותיות מוטות הקשורות למחזורים הורמונליים המשפיעים על התהליך המדעי. רבות מהמוסכמות הללו נגזרות מסלידה תרבותית כללית מדיון במחזור החודשי, מה שהוביל לפער נתונים בידע מבוסס היטב^40,41. יש לכך ספקטרום של השלכות המשתרעות בין מינוריות לקטלניות – מגובה מדפים וגודל הסמארטפון ועד התאמת שריון גוף משטרתי והחמצת אבחנות סרטן⁴².

התיאור של הווסת כבלתי סניטרית, הרסנית ורעילה – הנראה בטקסטים, בתקשורת, במילונים ובתורות רפואיות נערצות – נשמר על ידי פרסומים מדעיים. זה קורה באמצעות תיאורים לא מדויקים ומוטים של מחזורים הורמונליים, בידוד מערכת הרבייה ממקביליה הנוירואנדוקריניים והשפעותיה הסביבתיות, והפרספקטיבה הרדוקציוניסטית של השלמת מחזור כ'כישלון להרות'43,44. זה מוביל ליצירת פרקטיקות ניסיוניות לא מבוססות, כגון השמטת משתנים חיצוניים המשפיעים על מחזורים הורמונליים, קביעת נקודות התחלה וסיום המבוססות אך ורק על התפתחויות אנטומיות, ומדידת התקדמות המחזור באופן ליניארי ולא מעגלי. למרות הקשר הישיר בין גורמים סוציו-תרבותיים לבין השלכות ביולוגיות, הוא אינו נחשב לעתים קרובות בספרות המדעית. באמצעות בדיקה של פרסומים הוליסטיים יותר 43,44,45, חוקרים יכולים לפרק את הסטיגמות הללו וליצור עיצובים ניסיוניים אמינים ותקפים יותר.

Protocol

כל שיטות הטיפול והפרוצדורה המפורטות בפרוטוקול זה תואמות את הנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת פפרדיין והוועדה לחקר בעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (ARC).

1. טיפול ושימוש בבעלי חיים

1. לרכוש חולדות נקבות, במספרים על פי ניתוח כוח, וחולדות זכריות כדי לקדם את אפקט וויטן או רכיבה עקבית יותר על אופניים⁴⁶. לקבוע את הזן על סמך מטרת המחקר במאגרי מידע ידועים⁴⁷.
   הערה: הנתונים הנוכחיים משקפים את זה של נקבות מתבגרות בתוכנית התקינה הגנטית הגנטית הבינלאומית של SD (IGS) בנוכחות חולדות SD זכריות הממוקמות הן באוניברסיטת פפרדין והן במעבדות UCLA כחלק ממחקר משותף. חולדות אלה הגיעו לקבוצות נפרדות בגיל 28 ימים, והתקדמות מחזור האסטרוס הייתה במעקב במשך 10 או 20 יום כדי להדגים הבדלים ברמות אקוטיות וכרוניות, החל מגיל 34 ימים (לאחר תקופת התאקלמות של 7 ימים).
2. לפני הטיפול, יש לאפשר הסגר ו/או תקופת התאקלמות לייצוב פיזיולוגי לאחר הובלה והתאמה לסביבה החדשה.
   הערה: צוינה תקופת מינימום של 3 ימים, עם תקופה של 7 ימים מומלצת 48,49,50,51,52. באופן כללי, זה תלוי בתנאי ההובלה, בזן של בעלי החיים ובמטרות המחקר.
3. ודא כי הלחץ מופחת עם השימוש בתקופת התאקלמות, כמו מתח יכול לשבש תפקוד תקין של מערכת הרבייה⁵³. עם זאת, אין לפצות יתר על המידה על ידי ניסיון לחסל אותו, שכן כמות מתונה של מתח מועילה לרווחתם של בעלי החיים⁵¹.
4. חולדות מארחות בסביבה של טמפרטורה (68-79 מעלות פרנהייט, כלומר 20-26 מעלות צלזיוס) וסביבה מבוקרת לחות (30-70%) על ידי יצירת קשר עם הוויבריום או עם מנהלי המעבדות והבטחת תכונות אלה. הפיצו מים ו-chow ad libitum עם רכיבים מזינים המופיעים באתר החברה וניקוי כלובים פעם בשבוע.
   הערה: במחקר זה, החולדות שוכנו בקבוצות של 2 מופרדות על ידי מין בכלובי פלסטיק רב פעמיים שקופים בגודל 19 אינץ' x 10 אינץ' x 8 אינץ', והייתה להן גישה למצעי קוביות תירס שהוחלפו פעם בשבוע. הטמפרטורה נשמרה על 70 מעלות צלזיוס ולחות ב 35-79%, עם ממוצע של 62%.
5. בדוק את התפתחותו של זנב טבעת או נמק איסכמי של הזנב והבהונות לקבלת עדות לרמות לחות יחסיות נמוכות וטמפרטורות קיצוניות, שעלולות לגרום לשינוי בתגובות הביולוגיות.
   הערה: הטמפרטורה והלחות חשובות למערכת הרבייה, להתבגרות המינית ולמחזוריות^{האסטרוס} 54,55,56,57,58.
6. הבטיחו תאורה נכונה ומאוזנת בכל חלל המגורים על ידי הפקדת כמויות שוות של מקורות אור ברחבי חלל המעבדה הפועלים על מערכת אור:חושך מבוקרת זמן.
   הערה: כאן, מחזור אור:חושך של 12:12 שעות, עם אורות דולקים בין השעות 06:00-18:00 שעות, נשלט על ידי נורות LED ליניאריות של 2,550 לומן.
7. עקוב אחר דרישות לוקס שסופקו⁵² בהתבסס על וריאציות של פיגמנטציה, גיל, מתח, מין ומצב הורמונלי של בעלי חיים.
   הערה: כאשר חוקרים מסווגים את דגימות התאים שנאספו, תאורה עקבית תאפשר זיהוי חזותי נכון ובימוי אמין⁵⁹. משך האור ועוצמתו קשורים ישירות למערכת הרבייה, להתבגרות המינית ולרכיבת האסטרוס 54,55,56,56,57,60,61^.

2. ציוד והכנת ניסויים

1. סקור את הדטרמיננטים המסווגים (נראה באיור 2A): כיצד לזהות כל שלב במחזור האסטרוס וכיצד להפעיל את המיקרוסקופ ואת ציוד המצלמה.
2. ודא שכל נושא שיש לעקוב אחריו הגיע להתבגרות מינית ומציג אינדיקטורים מתאימים להתפתחות – VO, משקל גוף וגיל. שקלו את החולדות ובדקו אותן ל-VO בין באותה השעה בכל יום להשוואות מדויקות והעבירו אותן בשיטת טיפול מאושרת. יש להתייעץ עם הווטרינר המסונף לאוניברסיטה אם בעל חיים מאבד יותר מ-20% ממשקל גופו הקודם.
   הערה: ה-VO נשאר קאודלי לפתח השופכה ולגולגולת לפי הטבעת, הממוקם בין השניים, כפי שמתואר באיור 3.
3. מכיוון שגורמים אלה תלויי מאמץ, בדקו עם הספק אם יש מפרטים ושקלו גורמים סביבתיים ספציפיים למעבדה⁶².
   הערה: באופן כללי, זה יתרחש בין גיל 32-34 ימים למשקל גוף ממוצע הנע בין 75-150 גרם⁶³ לחולדות SD והוא מסומן על ידי פתח בצורת מעגל שכוסה בעבר על ידי נדן ממברני.
4. בחר תקופת איסוף דגימות המתאימה לקבוצת החולדות הנמצאות במעקב כדי למנוע איסוף דגימות מעבר. ראשית, יש לדגום כמה בעלי חיים ב-2 או 3 נקודות זמן שונות במהלך היום כדי לקבוע את השעה שבה נמצאים רוב שלבי המחזור (למשל, דגימה בשעה 12:00, 13:00 שעות ו-14:00 שעות עבור בעלי חיים שונים). השלם את שטיפת הנרתיק באותה השעה בכל יום לקבלת בימוי עקבי ואמין.
   הערה: דווח כי השעות שבין 12:00 ל-14:00 שעות הן הטובות ביותר ללכידת כל השלבים. במחקר זה, ניטור מחזורי אסטרוס התרחש בין השעות 12:00 ל-14:00 שעות, וטופל באמצעות החזקה בסגנון דחיסה (ראו שלב 3.4). החשיבות של תזמון ניטור מחזורי אסטרוס ביחס להתערבויות ניסיוניות אחרות (למשל, התניה התנהגותית, תרופות) היא תחום מחקר מתפתח וניתן לחקור אותה עוד¹¹. קביעת משך הניטור של מחזור האסטרוס תלויה במחקר וניתן לבחון אותה עוד יותר במחקרים שפורסמו^11,33.
5. הסר את כיסוי המגן מהמיקרוסקופ והצמד את המצלמה למחשב על ידי הסרת כיסוי עדשת המצלמה המגן והצבת העדשה מעל עינית המיקרוסקופ.
6. לאחר מכן, פתח את התוכנה שנבחרה מראש במחשב. כדי להשתמש בתוכנה שנבחרה במחקר זה, בחר את המצלמה המחוברת ל- USB הממוקמת בצד שמאל של המסך, תחת הלשונית שכותרתה רשימת מצלמה. ודא שמצלמת ה- USB מחוברת כראוי למחשב, אשר יקרא את No Device תחת הכרטיסייה שכותרתה רשימת מצלמה, אם לא.
7. לאחר שמצלמת ה- USB נבחרה תחת הכרטיסייה, הפעל את מתג האור של המיקרוסקופ הממוקם בבסיס.
8. צור תיקייה במחשב המיועדת לתמונות לדוגמת התא. צור תיקיית קבצים עבור כל יום נפרד שבו הנתונים נאספים, מוכנים מראש לפני צילום התמונות.
9. עם הכנת הציוד, שלפו את כלוב הנבדק ממקום ההחזקה שלו והביאו אותו לתחנת איסוף הדגימות.

3. איסוף תאי הנרתיק

1. שלפו מזרק חד פעמי ומלאו כל אחד מהמזרקים ב-0.2 מ"ל של NaCl סטרילי 0.9%. אם קיימות בועות אוויר, סובבו בעדינות את מזרק הקנה עד שכל בועות האוויר הגיעו לקצה הפתוח של המזרק וגירשו את האוויר. אם עדיין קיימות בועות אוויר, הוציאו את התמיסה בחזרה לכלי הקיבול של NaCl ומלאו אותה מחדש עד שאין כאלה.
   הערה: הבהוב מוגזם עלול לגרום להיווצרות של בועות אוויר רבות יותר.
2. מחזירים כל מזרק לעטיפת הניילון כדי לשמור על שדה סטרילי, עם קצה המזרק בתוך החלק האטום של העטיפה.
3. פתחו את הכלוב והרימו בעדינות את הנושא על ידי בסיס הזנב או תא המטען של הגוף, סוגרים את מכסה הכלוב כדי למנוע מאחרים לצאת. בחר שיטת החזקה מתוך אלה המפורטים להלן בהתבסס על העדפה אישית ותגובת בעלי חיים.
4. השתמשו באחיזה בסגנון דחיסה לחולדות מתבגרות על ידי הצבת הנבדק על אזור החזה העליון, כאשר האף של המצולם מצביע כלפי מטה על הקרקע. לפני תחילת המטוש, יש לוודא שהנבדק דחוס מספיק כדי למנוע תנועה, אך הוא נוח ובטוח באחיזה. חשוף את תעלת הנרתיק של הנושא על ידי כיפוף בעדינות של הזנב לפני החדרת המזרק.
5. השתמשו בהרמת הרגליים האחוריות עבור חולדות בוגרות על ידי הנחת המצחים של החיה על החלק העליון או הצדדי של הכלוב, בעוד שהזנב והאחוריים מרוסנים באחיזה עדינה בין האצבע הראשונה לשנייה, ומשאירים את האגודל פנוי להפעלת המזרק⁶⁴.
6. לאפשר לבעלי החיים להתאקלם לטיפול ולניטור. טפלו בבעלי החיים בעדינות אך בבטחה כדי להפחית את הלחץ העודף ולהגן על החוקר מפני תוקפנות כגון נשיכה.
   הערה: ייתכן שהימים הראשונים של הניטור לא יניבו את התוצאות הרצויות מכיוון שבעלי החיים מתאקלמים לתנאיהם. טיפול בבעלי החיים לאיסוף משקלי גוף במהלך תקופת ההתאקלמות יכול לסייע במעבר זה³³.
7. תוך כדי החזקת המזרק יציב עם האצבע הקדמית והאצבע האמצעית, יש להכניס את קצה המזרק (לא יותר מ-2 מ"מ) בזווית מקבילה לתעלת הנרתיק. לאט לאט לגרש את ה-NaCl לתעלה על ידי דחיפת הבוכנה פנימה. אין להכניס את המזרק עוד יותר לתעלה, שכן הדבר עלול לשבש את מחזור האסטרוס.
8. הוציאו את ה-NaCl מתעלת הנרתיק על ידי משיכת הבוכנה של המזרק הרחק מציפוי האפיתל (כלפי מעלה). אם יש קושי לשמור על הנושא באחיזה במהלך תהליך זה, החזירו אותו לכלוב לתקופת מנוחה קצרה לפני שתנסה לחלץ את NaCl.
9. לאחר איסוף דגימת התא, הניחו את הנבדק בחזרה בכלוב וחזרו על הליך זה עבור כל חיה לפני שכל הדגימות יוערכו תחת המיקרוסקופ.
   הערה: לחלופין, ניתן לאסוף ולהעריך כל דגימה לפני המעבר לבעל החיים הבא. בעל חיים עשוי לדרוש שטיפה שנייה אם לא ניתן לסווג את הדגימה. ניתן לעשות שימוש חוזר באותו מזרק מהאוסף הראשוני אם הוא אינו יוצר קשר עם המלוח ישירות במיכל ורק עבור אותה חיה.

4. הערכה לדוגמה

1. התחל את הסיווג על ידי בחינת דגימת הנוזל הנרתיקי שחולצה. תעד את הצמיגות כצמיגות או לא-ויזואלית ואת הצביעה כאטומה או שקופה במסמך התיאור או במערכת הקלטה אחרת.
   הערה: ניתן לבצע חלק זה של הפרוטוקול בזמן איסוף הדגימה או מאוחר יותר.
2. הוציאו 2-3 טיפות של נוזל על מגלשת מיקרוסקופ והניחו זכוכית כיסוי מיקרוסקופ על גבי המגלשה. הניחו את זכוכית הכיסוי על החלקה של המיקרוסקופ מהחלק העליון של המגלשה לתחתית או מצד אחד של המגלשה לצד השני כדי למנוע היווצרות בועות אוויר. במידת האפשר, השאירו כמחצית מהדגימה שנאספה במזרק אם נדרשת בדיקה נוספת וכדי למנוע הנחת כמות עודפת של נוזל על המגלשה.
3. אתר את התאים שנאספו על ידי הזזת החלקת המיקרוסקופ על פני הבמה. אם יש מעט מדי תאים או כמות גבוהה של פסולת, הוציאו את הנוזל הנותר למגלשה חדשה ובחנו מחדש. אם כמות הדגימה שנותרה במזרק אינה מספיקה, או אם הטיפה השנייה מציגה בעיות דומות, אספו דגימה נוספת מהנבדק לפני שתתנסו לזהות את שלב מחזור האסטרוס.
4. לאחר שהתאים אותרו ולפני שהם נוגעים במחשב או במקלדת המחשב, הסר את הכפפה האחת כדי למנוע לכלוך את המקלדת.
5. השג תמונות של דגימות התא על-ידי לחיצה על הפונקציה המסומנת Snap בצד שמאל של לוח התוכנה.
6. לאחר מכן, שמור את הקובץ על-ידי לחיצה על שמור כמו תחת סמל הקובץ בפינה הימנית העליונה של הדף. שמור את התמונה תחת תיקייה עם תווית מראש במחשב.
   הערה: תבנית תווית לדוגמה: עדשה #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective בשימוש.
7. צלם יותר מתמונה אחת בכל עדשה אובייקטיבית אם אין תאים רבים בתוך כל פריים.
   הערה: תוויות לדוגמה עבור תמונות מרובות: #1_01/09/2021_EST_4x1 ו - #1_01/09/2021_EST_4x2.
8. חזור על ההליך עבור כל דגימה שנאספה תחת עדשות אובייקטיביות מרובות. כלול לפחות החפצה אחת קטנה יותר, כגון 4x, ולפחות החפצה אחת גדולה יותר, כגון 20x.
9. העלה את התמונות לכונן/תיקיה משותפים או לכונן קשיח חיצוני כדי שלכל החוקרים המעורבים תהיה גישה לקבצים ויהיו עותקי גיבוי זמינים.

5. סיווג שלבים

1. הגדר את מסך המחשב כך שיציג בו-זמנית את התמונות שצולמו ואת גיליון ההקלטה (איור 4A-C).
   הערה: פעולה זו תאפשר לתיעוד להתרחש בעת הצגת הדגימה שנאספה. חלק זה של הפרוטוקול יכול להסתיים בזמן איסוף הדגימה או מאוחר יותר.
2. קבע אילו סוגי תאים קיימים בדגימה. בחר מבין ארבע האפשרויות המפורטות בשלבים 5.2.1-5.2.4 באמצעות הקריטריונים ותעד את הממצאים.
   1. אפיתל קרטיניזציה (AKE)/תאי אפיתל קורנים
      1. חפשו תאים משוננים או בעלי קצוות זוויתיים, כפי שניתן לראות באיור 2B ובאיור 5C, שלמרות המחסור בגרעינים, עשויים להראות אזורים עגולים בהירים (רוחות רפאים גרעיניות) בתוך התא שמייצגים את המקום שבו גרעין היה קיים בעבר. השתמש בהגדלה גבוהה יותר, כגון פי 20 ומעלה, כדי להבדיל בין תאים מנוקלים כאלה לבין תאים מחונכים.
      2. השתמש בהגדלה גבוהה יותר כדי להבחין בין החלק הקרטיני או הקורנדי של התא – שכבה דקה של תאים חסרי גרעינים ומלאים בקרטין – אם תרצה בכך.
         הערה: בנוסף למראה המשונן שלהם, ניתן להבחין בהם גם על ידי האופן שבו הם יכולים להתקפל או לפרק, וליצור מבנים משוננים ומוארכים המכונים חטיפי קרטין.
   2. תאי אפיתל גרעיניים גדולים (LNE)
      1. חפשו את התאים האלה, שבדרך כלל הם עגולים עד מצולעים, עטופים בגבולות לא סדירים, משוננים או זוויתיים.
      2. שימו לב כיצד הגרעינים שלהם עשויים ללבוש צורות שונות, החל משלמים ועד מנוונים או פיקונטיים, הקשורים לעיבוי בלתי הפיך של הכרומטין בגרעין של תא שעובר מוות או הידרדרות, כפי שניתן לראות באיור 2B ובאיור 5D1,2. שימו לב כיצד גרעינים אלה תופסים פחות מקום מאשר הציטופלסמה בתוך התא, עם יחס גרעיני לציטופלסמי נמוך יותר (N:C) מאשר תאי האפיתל הקטנים. חפשו גרגירים ציטופלסמיים שניתן לראות בהגדלה גבוהה יותר¹³.
   3. לויקוציטים (LEUs)/נויטרופילים/תאים פולימורפונוקליאריים
      1. חפשו את התאים הקומפקטיים והכדוריים האלה עם גרעינים מרובי-בולטים (ולכן, המכונים תאים פולימורפונוקליאריים), שנעלמים ככל שהתא מתבגר (איור 2B ואיור 5A). ניתן להשתמש בהגדלה גבוהה יותר (למשל, פי 40) כדי לצפות בגרעינים הרב-תחומיים.
         הערה: בעת האיסוף וההכנה, תאים אלה עלולים להתעבות, להתקפל או להיקרע.
   4. תאי אפיתל גרעיניים קטנים (SNE)
      1. חפשו את התאים העגולים עד הסגלגלים האלה, הגדולים יותר מהנויטרופילים שתוארו לעיל.
      2. שימו לב לגרעינים העגולים של תאי האפיתל הלא-קריאטיניים האלה (איור 2B), שתופסים שטח גדול יותר מהציטופלסמה בתוך התא, ויוצרים יחס N:C גבוה יותר ביחס לתאי אפיתל גדולים.
         הערה: בעת האיסוף וההכנה, תאים אלה עשויים להתקפל או לחפוף כדי ליצור צורה הדומה למחרוזת או לפס, כפי שמודגם באיור 5B1.
3. בדוק כיצד התאים הקיימים בדגימה מאורגנים עבור כל אובייקטיוויקציה. השתמש בהחפצה התחתונה, כגון 4x, כדי להציג תצוגה מייצגת של סידור התאים הכולל. רשמו אם התאים גושים יחד (C), מפוזרים באופן שווה (ED) או מפוזרים באופן אקראי (RD) (ראו איור 4C), ושימו לב לארגון הספציפי של כל סוג תא (לדוגמה, תאי אפיתל גרעין קטנים מתקבצים, ונייטרופילים מתפלגים באופן שווה).
4. לאחר מכן, להעריך באופן חזותי ולתעד את כמות התא הכוללת (כמות בינונית, בינונית, מרובה) ואת כמויות התאים הבודדות (אחוז מכל סוג תא קיים).
   הערה: smidge מייצג את המספר הקטן ביותר של תאים שנמצאים שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את סיווג הדגימה, רבים מייצגים נוכחות של מספר אינסופי של תאים המהווים את רוב אם לא את כל השטח בשקופית או נערמים זה על גבי זה, ומספר מתון של תאים מייצג מספר ממוצע יחסית של תאים (דוגמאות שנראו באיור 5A-D ובאיור 6A-D).
5. שימו לב אם יש סטיות מהקריטריונים המפורטים או מהיבטים האופייניים לנושא הספציפי בקטגוריית 'חריגות' והתייעצו עם וטרינר במידת הצורך.
6. קבע איזה שלב מחזור אסטרוס מוצג במדגם תוך שימוש ברכיבי הסיווג ובתיאורים שלהלן.
   1. למות
      1. חפשו את ה-LEUs כסוג התא הדומיננטי או היחיד הקיים, המסודרים בצורה מגושמת בתחילת DIE אך מפוזרים יותר בשלבים מאוחרים.
         הערה: בעת המעבר ל-DIE, כמות התאים עשויה לרדת ככל שתאי האפיתל מתחילים להתפרק, כפי שניתן לראות באיור 6D1. במקביל, מספר ה- LEUs מתחיל לגדול, והם נוטים להיות מסודרים בצורה מגושמת בתחילה ולהתפזר עם הזמן.
      2. שים לב שהכמות הכוללת של התאים עשויה להיות נמוכה יחסית, לרוב בשלבים המאוחרים יותר של תקופת DIE, ביום השני או השלישי.
      3. שימו לב לכמות הגבוהה של הריר שעשויה להיות נוכחת בשלב זה, המוצגת כ גדילים מרוכזים של LEUs (איור 5A1). חפשו גושים קטנים או גדילים תאיים של תאי SNE המלווים את ה-LEUs בשלבים מאוחרים במעבר ל-PRO (איור 5A1,2).
      4. שימו לב למראה הצמיג והאטום של נוזל הנרתיק בעת המעבר, המעבר המלא ל-DIE ומעבר אליו.
         הערה: משך הזמן הממוצע של שלב זה הוא 48 שעות במהלך מחזור של 4 ימים ואולי 72 שעות במהלך מחזור של 5 ימים.
   2. מקצוען
      1. חפשו את תאי ה-SNE כתאים הדומיננטיים ואת תאי ה-LEUs, ה-LNE ו/או ה-AKE שניתן לראותם במספרים נמוכים. השתמשו בהחפצה גבוהה כדי לצפות במראה הגרגירי של תאי ה-SNE המסודרים בדרך כלל באשכולות, ביריעות או בגדילים בשלב זה (איור 5B1,2).
      2. שימו לב למראה הצמיג והאטום של נוזל הנרתיק בעת מעבר מ-DIE ל-PRO, וכיצד הוא הופך ללא-ויזואלי ושקוף לאחר המעבר המלא לשלב ה-PRO (משך זמן ממוצע של 14 שעות בחולדות).
   3. EST
      1. חפשו דומיננטיות של תאי AKE, ירידה של תאי ה-SNE ב-EST ועלייה במספר ובגודל התאים ככל ש-EST ממשיך^ב-11,13.
      2. שימו לב לתכונה המבדילה של הסידור המקובץ לעתים קרובות של תאי AKE, בצורה של פסי קרטין או המכילים גרעיני רפאים, שיכולים להתפזר באופן אקראי יותר במעבר מ-PRO (איור 6B) ול-MET (איור 6C).
      3. שימו לב לנוזל הנרתיקי הלא-ויזואלי והשקוף האופייני, שניתן לצפות לו כאשר החולדות עוברות לתוך ה-EST, עוברות אליו באופן מלא ועוברות אותו מ-EST.
         הערה: ההתקדמות של EST כוללת גיוון רב (איור 5C ואיור 6B, C). השלב מתרחש בדרך כלל במשך 24 שעות בממוצע במחזור של 4 ימים או אולי 48 שעות במחזור של 5 ימים.
   4. פגשתי
      1. חפשו מספרים גבוהים יותר של תאי SNE ו-LNE כאשר החולדה עוברת ל-MET, בין אם הם דומיננטיים מבחינת פרופורציה של התאים בתוך התעלה או קרוב ליחס שווה ל-LEUs^11,13. יתר על כן, שים לב לכמות הגדולה יותר של פסולת ב- MET ולמעברים מאשר בשלבים אחרים עקב דעיכת תאי האפיתל בעקבות EST ומעבר ל- DIE.
      2. שימו לב להיעדר סידור עקבי כאשר כל סוגי התאים נראים ובכמויות שונות (איור 5D1-3). עם זאת, חפשו את ה-LEUs הארוזים או הדחוסים בסמיכות לתאי האפיתל בשלבים הראשונים שעשויים לחזור לסידור הגושני בעת המעבר ל-DIE.
      3. שימו לב למראה הלא-ויזואלי והשקוף של נוזל הנרתיק בשלב זה ולשינוי למראה צמיג ואטום יותר תוך כדי מעבר ל-DIE.
         הערה: משך הזמן הממוצע של שלב זה הוא 6-8 שעות.
7. תייג דוגמאות במעברים עם השלב שאליו הנושא מתקדם, עם המעבר בסוגריים כדי לעקוב אחר מועדי איסוף אלה. מידע נוסף על אופן ההבחנה בין 4 שלבים אלה לבין המעברים שלהם ניתן למצוא בתוצאות המייצגות.
   הערה: מכיוון שהדגימות שנאספו הן סטטיות והמחזור הוא דינמי, השקופיות עשויות לתאר מעברים בין שלבים (ניתן לראות באיור 6A-D).
8. השלם תהליך זה עבור כל בעל חיים עד להשלמת שלב הניטור.
9. בכל יום 11 (גיל 45 ימים) או 21 (גיל 55 ימים), המתים את החולדות עם 5% איזופלורן ו-2% חמצן לפני עריפת גיליוטינה. נקודות זמן אלה עשויות להשתנות בהתאם לאופי המחקר.

תוצאות

הנתונים הנוכחיים משקפים את זה של תוכנית התקינה הגנטית הבינלאומית של SD מתבגרת (IGS) בנוכחות חולדות SD זכריות. בעלי חיים אלה היו ממוקמים הן באוניברסיטת פפרדין והן במעבדות UCLA כחלק ממחקר משותף. איור 5 מציג וריאציות מרובות של 4 שלבי המחזור. איור 5A1 זוהה כדגי...

Discussion

צעדים מרכזיים ושיקולים חשובים
שלבים קריטיים מסוימים בפרוטוקול המסופק דורשים דגש, במיוחד באוסף תאי הנרתיק. במהלך מיצוי נוזל הנרתיק, הבטחת הזווית והעומק הנכונים של החדרת המזרק היא המפתח להפקת תוצאות משביעות רצון ובסופו של דבר למניעת גירוי, פציעה או גירוי צוואר הרחם לבעל החיים. ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9%	Live Action Safety	ABB079830939	https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH Supplies	BH Supplies	ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821	https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7& keywords=1ml+sterile+syringe&qid= 1572478649&s=industrial &sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa= ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM 0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja 1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2 xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen	Allentown	LV40326013	https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad	Medline	EAN: 0480196288558  Global Trade Identification Number: 40080196288558	https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4