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요약

이 연구는 암컷 쥐와 관련된 실험 설계에서 고려해야 할 중요한 요소를 자세히 설명합니다. 더 큰 의미에서 이러한 데이터는 낙인을 줄이고 더 포괄적 인 진단 및 개입 도구의 개발을 돕는 역할을합니다.

초록

현재의 방법론은 여성 Sprague Dawley (SD) 청소년 쥐의 발정주기를 모니터링하기위한 재현 가능하고 표준화되고 비용 효율적인 접근법을 수립합니다. 이 연구는 호르몬주기의 복잡성과 신뢰할 수 있고 유효한 모니터링 기술을 구축하는 데 필요한 광범위한 이해를 보여줍니다. 주요 실험 설계 및 절차 요소에 대한 심층적 인 검토를 통해주기와 기본 원칙에 대한 이러한 설명은 향후 복제에 대한 오해를 더 깊이 이해하고 해체하기위한 틀을 제공합니다.

질 세척을 사용하는 샘플 수집 프로세스의 개요와 함께이 절차는 proestrus, estrus, metestrus 및 diestrus의 네 단계 모델로 데이터 분류 메커니즘을 설명합니다. 이러한 단계는 질액 상태, 존재하는 세포 유형, 세포 배열 및 수집시의 세포량의 4 가지 분류 결정 요인을 활용하는 새로운 제안 된 접근법을 특징으로합니다. 각 단계의 변형, 호의적이고 불리한 샘플, 순환성과 비순환성의 구별, 수집 된 분류 구성 요소의 그래픽 묘사는 데이터의 효과적인 해석 및 조직 관행과 함께 제시됩니다. 전반적으로 이러한 도구를 사용하면 처음으로 정량화 가능한 데이터 범위를 게시할 수 있으므로 복제 시 범주화 요소가 표준화됩니다.

서문

새로운 기여
설치류 발정주기는 건강의 필수 지표로 확인되었습니다. 그러나 조사관의 무의식적 인 편견과 여성의 신체에 관한 부정확 한 해석은 과학계를 방해합니다. "estrous"라는 단어의 어원은 열등감과 부정감을 의미합니다. Euripides는이 용어를 사용하여 "광란"또는 광기를 묘사하고, 호머는 공황을 묘사하고, 플라톤은 비합리적인 드라이브를 묘사했습니다. 이 연구는 이러한 원시적 관점이 현재 과학계에 어떻게 영향을 미치는지 강조하고 이전에 연구 된 방법의 업데이트 된 조합 인 새로운 모자이크 패러다임을 통해보다 포괄적 인 접근 방식을 위해 범위를 확대 한 새로운 모자이크 패러다임을 통해 이러한 우려를 해결합니다.

표준화되고 포괄적 인 모니터링 기술이 없기 때문에이 기술의 연구와 사용이 필요하며 데이터 해석 관행이 불분명 할 수 있습니다. 둘째, 에스트로우스 사이클 특성은 연구되는 개별 쥐에 의존하지만, 종종 보편화됩니다. 셋째, 호르몬 순환은 일상적이고 유익한 과정이지만 '인간으로의 번역'섹션에서 탐구 된 위험한 낙인으로 둘러싸여 있습니다. 이 연구는 (A) 심층적 인 에스트로 사이클 모니터링 기술을 설명하고 결과를 해석 할 수있는 방법을 명확히하고, (B) 각 사이클의 무결성과 개성을 유지하는 방법을 요약하고, (C) 입증되지 않은 관행을 영속시키는 오해에주의를 환기시킴으로써 세 가지 방법으로이 세 가지 문제를 해결하는 것을 목표로합니다.

이 연구는 또한 청소년기 쥐에 초점을 맞추는 데있어 독특합니다.이 기간은 성인기의 다양한 행동, 해부학 적 및 생리적 징후를 밝히는 중요한 발달 변화로 특징 지어집니다1. 공통적 편향을 해체하면서 연구가 부족한 인구의 호르몬 주기를 모니터링하기 위한 표준화된 실험 설계를 구축하면 신뢰할 수 있고 유효한 호르몬 상관관계 2,3,4의 개발과 상태 의존적 주기 중단 5,6,7,8,9,10 의 결정이 가능합니다. . 궁극적으로, 이러한 참신함은 진단 기준, 치료 및 다양한 건강 문제의 개입을 확장하는 역할을합니다.

기본 정의 및 사용
에스트로우스 사이클은 세 가지 진동하는 여성 성 스테로이드 호르몬, 즉 에스트라 디올, 류틴 화 호르몬 (LH) 및 프로게스테론 (그림 1A, B)에 반응하여 발생하는 역동적 인 생리 학적 과정의 모음입니다. 내분비와 중추 신경계 사이의 상호 작용은 사이클을 조절하며, 이는 대부분 4-5 일 동안 지속되며 성적 성숙의 시작부터 생식 노화 및 / 또는 중단까지 재발합니다. 그것은 호르몬 수준에 따라 별도의 범주로 나뉩니다 - 가장 일반적으로 원형 방식으로 진행되는 디스트러스 (DIE), 돌출부 (PRO), 발정기 (EST) 및 metestrus (MET)의 4 단계로 나뉩니다. 분할의수는 연구 13의 성격에 따라 3 단계11에서 13 단계 12까지 다양 할 수 있습니다. 부서 수가 적을수록 MET는 종종 스테이지로 제외되고 단기간의 과도기 기간으로 분류됩니다. 더 높은 숫자는 전형적으로 종양 발달 또는 자발적 위임신과 같은 현상의 면밀한 검사를 허용하는 하위섹션, 배아 이식 없이 임신의 생리학적 상태(12,14,15)를 포함한다.

이 연구에서, 단계는 질 운하의 구성 요소를 통해 확인되었으며, 3 가지 분류 결정 인자 - 세포 유형 (들) 존재, 세포 배열 및 세포 양 (그림 2A-D)으로 명명되었습니다. 이 연구에서 질액의 상태는 모니터링되지 않았지만 네 번째 분류 구성 요소로 포함하는 것이 좋습니다. 질 유체를 검사하는 것에 대한 추가 정보는 참조 리스트(16)에서 찾을 수 있다. 분류 구성 요소는 질 세척을 통해 세포를 추출하여 검사 할 수 있습니다.이 기술은 현대 발정주기 모니터링에서 권장되는 기본 기술입니다. 각 단계 내의 심층적 인 생리 학적 과정이이 연구의 범위를 벗어나는 반면, 더 많은 정보는 문헌17에서 찾을 수 있습니다.

이 에스트로우스 사이클 모니터링 기술의 사용 및 지속적인 개발은 성 스테로이드 호르몬과 심혈관 시스템(18), 내분비계(8) 및 중 추신경계(19,20,21)와 같은신체 시스템의 기능 사이의 연결에 뿌리를 두고 있다. 동시에, 여성 설치류가22,23,24,25와 관련되어있을 때 발정주기 모니터링이 항상 필요한 것은 아닙니다. 오히려, 성별 차이가 연구의 특정 영역에서보고되었는지 여부를 고려하는 것이 중요하며, 이는 출판 된 리뷰22,23에서 더 탐구 될 수 있습니다. 에스트로우스 사이클 모니터링은 광범위한 연구 조사에서 필수적이지만, 실험에 여성 설치류를 포함시키는 데 장애물로 간주되어서는 안됩니다. 이 기술은 복잡하고 시간이 많이 걸리는 것처럼 보일 수 있지만 조사자에 따라 절차 자체를 완료하는 데 15 분 미만이 걸릴 수 있으며 비용 효율적입니다. 전반적으로, 과학 연구에 여성 설치류를 포함시키는 것은 신체 시스템, 다양한 조건 및 병리학 및 일반적인 건강에 대한 이해에 유리하며, 이러한 개발은 주로 남성 신체 템플릿에 기반을두고 있기 때문입니다.

설치류의 보편적 인 매개 변수와 자연 다양성
"전형적인"것으로 보이는 측면에 대한 범위를 설정하는 것은 표준 사이클 패턴을 정의하고, 비교 및 분석 목적을 위해 매개 변수를 설정하고, 이상 및 이상값을 감지하는 데 필요합니다. 동시에 각 쥐의주기가 독특하며 동물의 변형, 생리 학적 과정 및 환경 조건에 따른 편차가 예상된다는 것을 인식하는 것도 중요합니다. 사실, 에스트로우스 사이클의 가장 "정상적인"측면 중 하나는 변동성입니다. 이것은 3-38 일26,27의 범위와 함께 총 사이클 길이에서 볼 수 있습니다. 32-34 일에서 여러 주에 이르기까지 다양 할 수있는 성적 성숙의 나이28,29,30; 비주기적 11로 간주되는 것, 및 분류된 결정자 패턴(11,13)이 있다. 전반적으로, 에스트로우스 사이클에 대한 보편적 인 템플릿은 없으며, 과학계와 일반 대중 모두에게 그것을 번역하는 것은 실험 과정의 중요한 부분입니다.

실험 시점과 발달 연령
이러한 변동성 원칙을 인식하면 신뢰할 수 있고 유효한 실험 설계를 구축하는 데 도움이됩니다. 예를 들어, 에스트로우스 사이클링 모니터링의 시작은 쥐의 해부학 적 및 생리적 발달에 의존하며, 이는 환경 및 생리 학적 요인에 따라 다릅니다. 모니터링은 질 운하의 내부 부분으로 이어지는 외음부로 둘러싸인 외부 질 오리피스 인 질 개구부 (VO)가 발달 할 때까지 시작할 수 없습니다 (그림 3A-D). VO는 종종 32 일에서 34 일 사이에 완전히 발달하지만, 각 과목마다 개별화 된 채로 남아 있으며 그 과정에 대한 많은 부분은 알려지지 않았습니다. 이 개구부는 에스트라디올 31의 증가, 시상 하부 - 뇌하수체 - 난소 축 (32)의 성숙 및 쥐 17,33,34,35의 첫 번째 배란과 관련된 성적 성숙의 시작을 확인하는 데 사용되었습니다. 그러나, 최근의 간행물들은 그것이 불리한 환경(31)에서 호르몬 및 발달 발생으로부터 결합되지 않을 수 있고, 성적 성숙(33)보다는 에스트라디올 수준의 변화를 나타낼 수 있기 때문에, 생식 발달의 간접적인 마커일 뿐이라는 것을발견하였다. 따라서, 발달 연령을 결정하기 위해 VO에만 의존하지 않고, 발정기 모니터링(36)을 위한 한정자로서, 또한 성적 성숙의 개시를 표시하기 위해 상피 세포(30)의 첫 번째 EST 단계의 출현 및 각질화를 활용하는 것이 바람직하다.

체중은 설치류30,37의 청소년 기간 동안 발달 연령과 특히 관련이 있으므로이 기간의 발달 연령을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 현상과 관련된 제안 된 메커니즘은 성장 호르몬과 같은 생식 발달에 필요한 호르몬의 자극, 및 식욕 조절제, 렙틴30에 의한 시상 하부 - 뇌하수체 부신 (HPA) 축의 억제를 포함한다. 그러나, 종에 걸친 쥐와 공급 업체 제공자(38) 사이에서 볼 수있는 큰 차이로 인해이 측정을 발달 연령의 유일한 지표로 활용하는 것은 권장되지 않습니다. VO 및 체중의 발달에서 볼 수있는 변동성은 전체 실험 과정에서 개념의 중요성을 예증합니다.

인간에 대한 번역 : 문화적, 과학적 맥락
동물과 인간의 생식 연구의 번역 관계는 양방향입니다. 동물 기반 연구의 결과는 인간 과정이 어떻게 평가되고, 접근하고, 분석되는지에 영향을 미친다39. 인간의 생식 시스템과 관련 과정에 대한 인식은 동물을 연구하는 방법에 영향을 미칩니다. 사실,이 분야의 추가 연구에 대한 가장 큰 징후 중 하나는 과학적 과정에 영향을 미치는 호르몬주기와 관련된 편향된 사회 문화적 신념에서 비롯됩니다. 이러한 관습의 대부분은 월경을 논의하는 일반적인 문화적 혐오감에서 파생되었으며, 이는 잘 입증 된 지식40,41의 데이터 격차를 초래했습니다. 이것은 선반 높이와 스마트 폰 크기에서부터 경찰 갑옷 피팅 및 놓친 암 진단42에 이르기까지 사소한 것부터 치명적인 것까지 다양한 결과를 초래합니다.

월경을 비위생적이고 파괴적이며 독성이 강한 것으로 묘사하는 것은 존경받는 텍스트, 미디어, 사전 및 의학적 가르침에서 볼 수 있습니다 - 과학 출판물에 의해 보존됩니다. 이것은 호르몬 순환에 대한 부정확하고 편향된 설명, 생식 기관이 신경 내분비 대응 물 및 환경 영향으로부터 분리되는 것, 그리고 '임신 실패'로서의 순환의 완성에 대한 환원 주의적 관점을 통해 발생합니다.43,44. 이것은 호르몬 순환에 영향을 미치는 외부 변수의 생략, 해부학 적 발달만을 기반으로 시작과 종점을 결정하고, 순환 방식이 아닌 선형으로주기 진행을 측정하는 것과 같은 건전하지 않은 실험 관행의 창출로 이어집니다. 사회 문화적 요인과 생물학적 결과 사이의 직접적인 상관 관계에도 불구하고 과학 문헌에서는 종종 고려되지 않습니다. 보다 전체적인 출판물 43,44,45의 검사를 통해 연구자들은 이러한 오명을 해체하고보다 신뢰할 수 있고 유효한 실험 설계를 만들 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜에 설명 된 모든 취급 및 절차 방법은 NIH (National Institutes of Health) 동물 관리 및 사용 지침과 일치하며 Pepperdine University의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) 및 UCLA Chancellor 's Animal Research Committee (ARC)의 승인을 받았습니다.

1. 동물 관리 및 사용

  1. 암컷 래트를 전력 분석에 따른 숫자로 획득하고, 수컷 래트를 획득하여 휘튼 효과 또는 보다 일관된 사이클링(46)을 촉진시킨다. 공지된 데이터베이스(47)에서 연구의 목적에 기초하여 변형을 결정한다.
    참고 : 현재 데이터는 공동 연구의 일환으로 Pepperdine University와 UCLA 실험실에 위치한 남성 SD 쥐가있는 여성 청소년 SD 국제 유전 표준화 프로그램 (IGS)의 데이터를 반영합니다. 이들 래트는 생후 28일에 별개의 그룹에 도착하였고, 발정주기 진행을 10일 또는 20일 동안 모니터링하여, 생후 34일(7일간의 순응 기간 후)부터 급성 및 만성 수준에 대한 차이를 입증하였다.
  2. 취급하기 전에, 새로운 환경으로의 운송 및 조정에 따른 생리적 안정화를 위한 격리 및/또는 순응 기간을 허용한다.
    참고: 3일의 최소 기간이 인용되었으며, 7일 기간은 48,49,50,51,52일 권장됩니다. 전반적으로, 이것은 운송 조건, 동물 균주 및 연구 목표에 달려 있습니다.
  3. 스트레스가 적절한 생식 시스템 기능을 방해할 수 있기 때문에, 순응 기간의 사용에 따라 스트레스가 감소되도록 보장한다(53). 그러나 적당한 양의 스트레스가 동물의 복지51에 도움이되므로 그것을 제거하려고 시도함으로써 과잉 보상하지 마십시오.
  4. 숙주 쥐는 온도-(68-79°F, 즉, 20-26°C) 및 습도-조절된(30-70%) 환경에서 vivarium 또는 실험실 관리자에게 연락함으로써 이러한 특징을 보장한다. 회사 웹 사이트에 나열된 영양 성분과 함께 물과 차우 광고 리비툼 을 배포하고 일주일에 한 번 케이지 청소를하십시오.
    참고 :이 연구에서, 쥐는 19 "x 10"x 8"투명 재사용 가능한 플라스틱 케이지에서 성으로 분리 된 2 개의 그룹에 수용되었으며 일주일에 한 번 변경된 옥수수 속구에 접근 할 수있었습니다. 온도는 70°F, 습도는 35-79%로 유지하였고, 평균 62%로 유지하였다.
  5. 꼬리와 발가락의 고리 꼬리 또는 허혈성 괴사의 발달을 확인하여 생물학적 반응의 교대를 일으킬 수있는 낮은 상대 습도 수준과 극한의 온도의 증거를 확인하십시오.
    참고 : 온도와 습도는 생식 기관, 성적 성숙 및 발정 순환도54,55,56,57,58에 중요합니다.
  6. 시간 제어 된 light:dark 시스템에서 작동하는 실험실 공간 전체에 동일한 양의 광원을 증착하여 하우징 공간 전체에 적절하고 균형 잡힌 조명을 보장하십시오.
    참고: 여기에서는 12:12-h 라이트:다크 사이클(06:00-18:00 h)의 조명이 켜진 상태에서 2,550루멘 리니어 LED 전구로 제어되었습니다.
  7. 동물의 색소 침착, 나이, 긴장, 성별 및 호르몬 상태의 변화에 따라제공되는 52 가지 럭스 요구 사항을 따르십시오.
    참고 : 연구원이 수집 된 세포 샘플을 분류 할 때 일관된 조명은 적절한 시각적 탐지 및 신뢰할 수있는 스테이징59를 허용합니다. 빛의 지속 기간과 강도는 생식 기관, 성적 성숙 및 에스트로우스 사이클링 54,55,56,57,60,61과 직접 관련이 있습니다.

2. 장비 및 실험 준비

  1. 분류 결정 요인을 검토하십시오 ( 그림 2A 참조) : 발정주기의 각 단계를 식별하는 방법과 현미경 및 카메라 장비를 작동하는 방법.
  2. 모니터링해야 할 각 피험자가 성적 성숙에 도달했는지 확인하고 적절한 발달 지표 (VO, 체중 및 나이)를 표시하십시오. 정확한 비교를 위해 쥐의 무게를 측정하고 매일 동시에 VO를 검사하고 승인 된 처리 방법으로 옮깁니다. 동물이 이전 체중의 20 % 이상을 잃는 경우 대학 산하 수의사와 상담하십시오.
    참고: VO는 그림 3에 묘사된 바와 같이 요도 개구부와 두개골 항문 사이에 위치한 항문에 대한 인과적으로 남아 있습니다.
  3. 이러한 요인은 변형에 따라 다르므로 공급자에게 사양을 확인하고 실험실62와 관련된 환경 요인을 고려하십시오.
    참고 : 일반적으로 이것은 생후 32-34 일 사이에 발생하며 SD 쥐의 경우 75-150 그램63 그램의 평균 체중이 발생하며 이전에 막강한 외피로 덮인 원형 모양의 개구부로 표시됩니다.
  4. 과도기 샘플 수집을 방지하기 위해 모니터링되는 래트 그룹에 적합한 샘플 수집 기간을 선택합니다. 먼저, 하루 종일 2 또는 3개의 서로 다른 시간대에서 몇 마리의 동물을 샘플링하여 대부분의 주기 단계가 존재하는 시간을 결정한다(예를 들어, 상이한 동물의 경우 12:00시간, 13:00시간, 14:00시간에 샘플링). 일관되고 신뢰할 수있는 스테이징을 위해 매일 동시에 질 세척을 완료하십시오.
    참고: 12:00~14:00 사이의 시간은 모든 단계를 캡처하는 데 가장 적합한 것으로 보고되었습니다. 이 연구에서, 에스트로우스 사이클 모니터링은 12:00 내지 14:00 h 사이에 발생하였고, 압축 스타일 홀드로 처리되었다(단계 3.4 참조). 다른 실험적 개입 (예 : 행동 조절, 약물 치료)과 비교하여 에스트로 사이클 모니터링 타이밍의 중요성은 연구의 개발 영역이며 더 탐구 될 수 있습니다11. 발정 주기 모니터링의 지속 기간을 결정하는 것은 연구 의존적이며 발표된 연구11,33에서 더 탐구될 수 있다.
  5. 현미경에서 보호 커버를 제거하고 보호 카메라 렌즈 커버를 제거하고 현미경의 접안 렌즈 위에 렌즈를 올려 카메라를 컴퓨터에 부착하십시오.
  6. 그런 다음 컴퓨터에서 미리 선택한 소프트웨어를 엽니다. 이 연구에서 선택한 소프트웨어를 사용하려면 카메라 목록이라는 탭 아래에서 화면 왼쪽에 있는 USB에 연결된 카메라를 선택합니다. USB 카메라가 컴퓨터에 제대로 연결되어 있는지 확인하십시오. USB 카메라는 카메라 목록이라고 표시된 탭 아래에 있는 장치 없음(그렇지 않은 경우)으로 표시됩니다.
  7. 탭 아래에서 USB 카메라를 선택했으면 베이스에 있는 현미경 조명 스위치를 켭니다.
  8. 셀 샘플 사진으로 지정된 컴퓨터에 폴더를 만듭니다. 이미지를 촬영하기 전에 미리 준비된 데이터가 수집되는 개별 날짜마다 파일 폴더를 만듭니다.
  9. 장비를 준비한 상태에서 피사체의 케이지를 보유 장소에서 회수하여 샘플 수집 스테이션으로 가져옵니다.

3. 질 세포의 수집

  1. 일회용 주사기를 회수하고 각 주사기를 0.2 mL의 멸균 0.9% NaCl로 채운다. 기포가 있으면 모든 기포가 주사기의 열린 끝에 도달 할 때까지 배럴 주사기를 부드럽게 흔들고 공기를 배출하십시오. 여전히 기포가 있으면 용액을 NaCl 리셉터클에 다시 넣고 아무 것도 없을 때까지 다시 채우십시오.
    참고: 과도한 깜박임은 더 많은 기포의 형성을 초래할 수 있습니다.
  2. 각 주사기를 플라스틱 래핑으로 돌려 보내 멸균 필드를 유지하고, 주사기의 팁이 래핑의 밀봉된 부분 내부에 있다.
  3. 케이지를 열고 꼬리 밑이나 몸통으로 피사체를 부드럽게 들어 올려 케이지의 뚜껑을 닫아 다른 사람이 빠져 나오지 않도록하십시오. 개인 선호도와 동물 반응에 따라 아래에 나열된 방법 중에서 보유 방법을 선택하십시오.
  4. 사춘기 쥐에게 압축 스타일의 홀드를 사용하여 피사체를 흉부 위쪽 영역에 놓고 피사체의 코가 땅을 가리 키도록하십시오. 면봉을 시작하기 전에 피사체가 움직임을 방지하기에 충분히 압축되어 있지만 홀드에서 편안하고 안전한지 확인하십시오. 주사기를 삽입하기 전에 꼬리를 부드럽게 구부려 피험자의 질 운하를 노출시킵니다.
  5. 동물의 앞발을 케이지의 위쪽 또는 측면에 배치하여 성인 쥐에게 뒷다리 리프트를 사용하고, 꼬리와 뒷다리는 첫 번째 손가락과 두 번째 손가락 사이의 부드러운 보류로 억제되어 엄지 손가락이 주사기(64)를 자유롭게 작동 할 수있게하십시오.
  6. 동물들이 취급 및 모니터링에 적응할 수 있도록하십시오. 과도한 스트레스를 줄이고 물기와 같은 공격성으로부터 연구원을 보호하기 위해 동물을 부드럽게 그러나 안전하게 다루십시오.
    참고 : 처음 며칠 동안의 모니터링은 동물이 자신의 상태에 적응함에 따라 원하는 결과를 얻지 못할 수 있습니다. 순응 기간 동안 체중을 수집하기 위해 동물을 취급하는 것은 이러한 전이를 도울 수 있다(33).
  7. 검지와 가운데 손가락으로 주사기를 안정적으로 잡고 주사기 끝 (2mm 이하)을 질 운하와 평행 한 각도로 삽입하십시오. 플런저를 안쪽으로 밀어 NaCl을 운하로 천천히 밀어 넣습니다. 주사기를 운하에 더 이상 삽입하지 마십시오, 그렇게하면 발정주기가 방해 될 수 있습니다.
  8. 주사기의 플런저를 상피 내벽(위쪽)에서 멀리 당겨 질 운하에서 NaCl을 추출합니다. 이 과정에서 피사체를 홀드에 보관하는 데 어려움이 있는 경우, NaCl 추출을 시도하기 전에 짧은 휴식 기간 동안 케이지에 다시 넣으십시오.
  9. 세포 샘플이 수집되면 피험자를 케이지에 다시 넣고 모든 샘플이 현미경으로 평가되기 전에 각 동물에 대해이 절차를 반복하십시오.
    참고: 대안적으로, 각 샘플은 다음 동물로 이동하기 전에 수집되고 평가될 수 있다. 동물을 분류할 수 없는 경우 두 번째 세척이 필요할 수 있습니다. 초기 수집품의 동일한 주사기는 용기에 직접 식염수에 접촉하지 않고 동일한 동물에 대해서만 재사용 할 수 있습니다.

4. 시료 평가

  1. 추출된 질액 샘플을 검사하여 분류를 시작하십시오. 점도를 점성 또는 비점성으로 기록하고 착색을 설명 문서 또는 기타 기록 시스템에 불투명하거나 투명하게 기록하십시오.
    참고: 프로토콜의 이 섹션은 샘플 수집 시 또는 그 이상을 수행할 수 있습니다.
  2. 2-3 방울의 액체를 현미경 슬라이드에 배출하고 슬라이드 위에 현미경 커버 글라스를 놓습니다. 커버 글라스를 슬라이드의 상단에서 하단으로 또는 슬라이드의 한쪽에서 다른쪽으로 현미경 슬라이드에 올려 놓아 기포가 형성되지 않도록하십시오. 가능하다면, 추가 검사가 필요한 경우 수집된 샘플의 약 절반을 주사기에 보관하고 과도한 양의 유체가 슬라이드에 놓이지 않도록 하십시오.
  3. 현미경 슬라이드를 스테이지를 가로질러 움직여 수집한 세포를 찾습니다. 세포가 너무 적거나 파편이 많으면 남은 액체를 새 슬라이드로 배출하고 다시 검사하십시오. 주사기에 남아있는 샘플의 양이 충분하지 않거나 두 번째 방울이 유사한 문제를 나타내는 경우 발정주기 단계를 확인하기 전에 피험자로부터 다른 샘플을 수집하십시오.
  4. 셀이 발견되면 컴퓨터 또는 컴퓨터 키보드를 만지기 전에 키보드가 더러워지지 않도록 장갑 하나를 제거하십시오.
  5. 소프트웨어 패널의 왼쪽에 있는 Snap 이라고 표시된 기능을 클릭하여 셀 샘플의 이미지를 가져옵니다.
  6. 그런 다음 페이지의 왼쪽 상단 모서리에있는 파일 아이콘 아래의 다른 이름으로 저장을 클릭하여 파일을 저장하십시오. 컴퓨터의 미리 레이블이 지정된 폴더 아래에 사진을 저장합니다.
    참고: 레이블 템플릿 예: 사용된 #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective 렌즈입니다.
  7. 각 프레임 내에 셀이 많지 않은 경우 각 대물 렌즈에서 두 장 이상의 사진을 찍으십시오.
    참고: 여러 이미지의 레이블 예: #1_01/09/2021_EST_4x1 및 #1_01/09/2021_EST_4x2.
  8. 여러 대물 렌즈에서 수집된 각 샘플에 대해 이 절차를 반복합니다. 4x와 같은 적어도 하나의 더 작은 객체화 및 20x와 같은 적어도 하나의 더 큰 객체화를 포함한다.
  9. 이미지를 공유 드라이브/폴더 또는 외장 하드 드라이브에 업로드하여 관련된 모든 연구원이 파일에 액세스할 수 있고 사용 가능한 백업 복사본이 있도록 합니다.

5. 단계 분류

  1. 촬영한 사진과 기록지를 동시에 볼 수 있도록 컴퓨터 화면을 설정합니다(그림 4A-C).
    참고: 이렇게 하면 수집된 샘플을 보는 동안 설명서가 발생할 수 있습니다. 프로토콜의 이 부분은 샘플 수집 시 또는 그 이후에 완료될 수 있다.
  2. 샘플에 어떤 세포 유형이 존재하는지 확인합니다. 기준을 사용하여 5.2.1-5.2.4단계에 나열된 네 가지 옵션 중에서 선택하고 결과를 기록합니다.
    1. 항문 각질화 상피 (AKE) / 각막 상피 세포
      1. 도 2B 및 도 5C에서 볼 수 있듯이 들쭉날쭉하거나 각진 모서리가 있는 세포를 찾으면, 핵이 부족함에도 불구하고 핵이 한때 존재했던 곳을 나타내는 세포 내의 밝은 둥근 영역(핵 유령)을 보여줄 수 있다. 20x 이상과 같은 더 높은 배율을 사용하여 그러한 유핵과 항핵화 된 세포를 구별하십시오.
      2. 원하는 경우 더 높은 배율을 사용하여 세포의 케라틴화 또는 각질화 된 부분 (핵이 부족하고 케라틴으로 채워진 얇은 세포 층)을 구별하십시오.
        참고 : 들쭉날쭉한 모양 외에도 접거나 분해하여 케라틴 막대로 알려진 들쭉날쭉하고 길쭉한 구조를 만드는 방법으로 구별 할 수 있습니다.
    2. 큰 유핵상피(LNE) 세포
      1. 불규칙, 들쭉날쭉한 또는 각진 경계로 둘러싸인 이러한 전형적으로 둥글고 다각형 모양의 세포를 찾으십시오.
      2. 그들의 핵이 어떻게 무손상에서 퇴화 또는 pykontic에 이르기까지 다양한 형태를 취할 수 있는지, 도 2B 및 도 5D1,2에서 볼 수 있듯이 죽음 또는 악화를 겪고있는 세포의 핵에서 크로마틴의 비가역적 응축과 관련하여 관찰하십시오. 이 핵이 세포 내의 세포질보다 적은 공간을 차지하는 방법에 주목하고, 작은 상피 세포보다 핵 대 세포질 (N : C) 비율이 낮습니다. 더 높은 배율(13)에서 볼 수 있는 세포질 과립을 조심하라.
    3. 백혈구 (LEU) / 호중구 / 다형성 핵 세포
      1. 세포가 성숙함에 따라 사라지는 다중핵(따라서 다형핵 세포로 알려짐)을 가진 이 콤팩트한 구형 세포를 찾으십시오(그림 2B 및 그림 5A). 더 높은 배율(예를 들어, 40x)은 다중배엽화된 핵을 관찰하는데 사용될 수 있다.
        참고: 수집 및 준비 시, 이러한 세포는 응축, 접힘 또는 파열될 수 있습니다.
    4. 작은 유핵상피(SNE) 세포
      1. 위에서 설명한 호중구보다 큰 이러한 원형 내지 타원형 세포를 조심하십시오.
      2. 이러한 비각질화 상피 세포의 둥근 핵을 관찰하고(도 2B), 이는 세포 내부의 세포질보다 더 많은 양의 공간을 차지하여 큰 상피 세포에 비해 더 높은 N:C 비율을 생성한다.
        참고: 수집 및 준비 시 이러한 셀은 접히거나 겹쳐서 그림 5B1에 표시된 것처럼 문자열 또는 막대와 유사한 모양을 만들 수 있습니다.
  3. 샘플에 존재하는 세포가 각 객관화에 대해 어떻게 구성되는지 조사하십시오. 4x와 같은 더 낮은 객체화를 사용하여 전체 셀 배열의 대표적인 뷰를 볼 수 있습니다. 세포가 함께 뭉쳐지는지(C), 고르게 분산되는지(ED), 또는 무작위로 분산되는지(RD)를 기록하고( 도 4C 참조), 각 세포 유형의 특정 조직을 주목한다(예를 들어, 작은 유핵화된 상피 세포는 응집되고, 호중구는 고르게 분포된다).
  4. 다음으로, 총 세포량(스미지, 보통, 수)과 개별 세포량(존재하는 각 세포 유형의 백분율)을 시각적으로 추정하고 기록한다.
    참고: 스미지는 샘플 분류를 결정하는 데 사용할 수 있는 가장 작은 셀 수를 나타내며, 수많은 셀이 슬라이드의 모든 공간이 아니더라도 대부분을 차지하거나 서로 위에 쌓여 있는 셀 수 없이 많은 수의 셀의 존재를 나타내며, 적당한 수의 셀은 비교적 평균적인 셀 수를 나타냅니다(그림 5A-D 및 그림 6A-D에서 볼 수 있는 예).
  5. 나열된 기준 또는 '이상'범주의 특정 주제에 대해 전형적인 측면과의 편차가 있는지 확인하고 필요한 경우 수의사와 상담하십시오.
  6. 분류 구성 요소와 아래 설명을 사용하여 샘플에 어떤 에스트로 사이클 단계가 제공되는지 확인합니다.
    1. 죽다
      1. LEU를 지배적 또는 유일한 세포 유형으로 찾고, DIY의 시작 부분에는 뭉친 방식으로 배열되었지만 후기 단계에서는 더 분산되어 있습니다.
        참고: DIE로 전환하는 동안, 도 6D1에서 볼 수 있듯이 상피 세포가 분해되기 시작하면 세포의 양이 감소할 수 있다. 동시에, LEU의 수는 증가하기 시작하고, 처음에는 뭉친 방식으로 배열되고 시간이 지남에 따라 분산되는 경향이 있습니다.
      2. 세포의 총 양은 비교적 낮을 수 있으며, 가장 자주 DIE 기간의 후기 단계, 두 번째 또는 세 번째 날에 발생할 수 있습니다.
      3. 이 단계에서 존재할 수 있는 많은 양의 점액을 관찰하고, 이는 LEU의 농축된 가닥으로 나타납니다(그림 5A1). PRO로의 전환에서 후기 단계 동안 LEU를 수반하는 SNE 세포의 작은 덩어리 또는 세포 가닥을 조심하십시오 (그림 5A1,2).
      4. DIE로 전환하고, 완전히 전환하고, DIE에서 전환 할 때 질 유체의 점성과 불투명 한 모습을 관찰하십시오.
        참고: 이 단계의 평균 지속 시간은 4일 주기 동안 48시간이고 5일 주기에는 72시간입니다.
    2. 프로
      1. SNE 세포를 지배적 인 세포로 찾고 낮은 숫자로 볼 수있는 LOU, LNE 및 / 또는 AKE 세포를 찾으십시오. 높은 객관화를 사용하여 이 단계에서 일반적으로 클러스터, 시트 또는 가닥으로 배열되는 SNE 세포의 세분화된 모양을 관찰하십시오(그림 5B1,2).
      2. DIY에서 PRO로 이동할 때 질액의 점성과 불투명 한 모습을 관찰하고, PRO 단계 (쥐에서 평균 지속 시간 14 시간)로 완전히 전환되면 점성이 없고 투명해지는 방법을 관찰하십시오.
    3. 증권 시세 표시기
      1. AKE 세포의 우세, EST에서 SNE 세포의 감소, EST가11,13을 계속함에 따라 세포의 수와 크기의 증가를 찾으십시오.
      2. AKE 세포의 종종 클러스터링된 배열의 구별되는 특징을 주목하여, 케라틴 막대 또는 고스트 핵을 함유하며, 이는 PRO (도 6B) 및 MET로의 전이 (도 6C)에서 보다 무작위로 분산될 수 있다.
      3. 특징적인 비점성 및 투명한 질 유체를 관찰하십시오.이 액은 쥐가 EST로 전환되고, 완전히 전환되고, EST에서 빠져 나올 때 기대할 수 있습니다.
        참고: EST의 진행에는 많은 다양화가 포함됩니다(그림 5C 및 그림 6B, C). 이 단계는 일반적으로 4 일주기에서 평균 24 시간 또는 5 일주기에서 48 시간 동안 발생합니다.
    4. 만난
      1. 쥐가 MET로 전환함에 따라 더 많은 수의 SNE 및 LNE 세포를 찾으십시오.이 세포는 운하 내의 세포 비율면에서 우세하거나 LEU11,13과 거의 동일한 비율에 가깝습니다. 또한, EST에 이어 상피 세포 붕괴로 인한 다른 단계보다 MET의 더 많은 양의 파편과 전이를 기록하고 DIE로 이동시킨다.
      2. 모든 세포 유형이 다양한 양으로 보여짐에 따라 일관된 배열의 결여를 관찰한다 (도 5D1-3). 그러나, DIE로 전환될 때 뭉친 배열로 돌아갈 수 있는 초기 단계에서 상피 세포에 근접하여 패킹되거나 뭉쳐지는 LEU를 찾으십시오.
      3. 이 단계에서 질액의 점성이 없고 투명한 외관과 DIE로 이동하는 동안 더 점성이 있고 불투명한 외관으로의 변화를 관찰하십시오.
        참고: 이 단계의 평균 지속 시간은 6-8시간입니다.
  7. 피사체가 이동하는 스테이지와 함께 전환에서 샘플에 레이블을 지정하고, 괄호 안의 전환을 통해 이러한 샘플이 수집되는 시기를 추적합니다. 이 4 단계와 전환을 구별하는 방법에 대한 자세한 내용은 대표 결과에서 찾을 수 있습니다.
    참고: 수집된 샘플은 정적이며 주기가 동적이므로 슬라이드는 스테이지 간의 전환을 묘사할 수 있습니다(그림 6A-D 참조).
  8. 모니터링 단계가 완료될 때까지 각 동물에 대해 이 프로세스를 완료합니다.
  9. 11일째(생후 45일) 또는 21일(생후 55일)에 단두대 탈구 전에 5% 이소플루란과 2% 산소로 쥐를 안락사시킨다. 이러한 시점은 연구의 성격에 따라 달라질 수 있습니다.

결과

현재의 데이터는 남성 SD 쥐가있는 여성 청소년 SD 국제 유전 표준화 프로그램 (IGS)의 데이터를 반영합니다. 이 동물들은 공동 연구의 일환으로 페퍼딘 대학과 UCLA 실험실에 위치했다. 그림 5는 4 사이클 단계의 여러 변형을 보여줍니다. 도 5A1은 여러 세포 유형이 존재하는 디스트러스 샘플로서 확인되었다. 이 예는 더 많은 수의 상피 세포를 ...

토론

주요 단계 및 중요한 고려 사항
제공된 프로토콜의 특정 중요한 단계는 특히 질 세포 수집 내에서 강조가 필요합니다. 질액 추출 중에 주사기 삽입의 적절한 각도와 깊이를 보장하는 것이 만족스러운 결과를 산출하고 궁극적으로 동물에 대한 자극, 부상 또는 자궁 경부 자극을 예방하는 열쇠입니다. 자궁 경부의 자극은 백혈구 전용 질 도말 (11)의 12-14 일로 표시된 의사 임신 유도의 ...

공개

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 캘리포니아 대학 로스 앤젤레스 뇌 손상 연구 센터 (BIRC) 간의 NIH 자금 협력을 통해 수행되었습니다.

자료

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