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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo studio descrive in dettaglio i fattori cruciali da considerare nei progetti sperimentali che coinvolgono ratti femmina. In un senso più ampio, questi dati servono a ridurre lo stigma e aiutano nello sviluppo di strumenti diagnostici e di intervento più inclusivi.

Abstract

L'attuale metodologia stabilisce un approccio riproducibile, standardizzato ed economico al monitoraggio del ciclo estrale delle femmine di ratto adolescente Sprague Dawley (SD). Questo studio dimostra la complessità dei cicli ormonali e l'ampio spettro di comprensione necessario per costruire una tecnica di monitoraggio affidabile e valida. Attraverso un esame approfondito dei principali elementi di progettazione sperimentale e procedurali, questa descrizione del ciclo e dei suoi principi fondamentali fornisce un quadro per un'ulteriore comprensione e decostruisce idee sbagliate per la replica futura.

Insieme a uno schema del processo di raccolta dei campioni che impiega la lavanda vaginale, la procedura descrive il meccanismo di categorizzazione dei dati nel modello a quattro stadi di proestro, estro, metestro e diestro. Queste fasi sono caratterizzate da un nuovo approccio proposto, utilizzando i 4 determinanti categorizzanti della condizione del fluido vaginale, del tipo o dei tipi di cellule presenti, della disposizione cellulare e della quantità cellulare al momento della raccolta. Variazioni di ogni fase, campioni favorevoli e sfavorevoli, la distinzione tra ciclicità e aciclicità e rappresentazioni grafiche delle componenti di categorizzazione raccolte sono presentate insieme a pratiche interpretative e organizzative efficaci dei dati. Nel complesso, questi strumenti consentono la pubblicazione di intervalli di dati quantificabili per la prima volta, portando alla standardizzazione dei fattori di categorizzazione al momento della replica.

Introduzione

Nuovi contributi
Il ciclo estrale del roditore è stato identificato come un indicatore essenziale di benessere. Tuttavia, i pregiudizi inconsci degli investigatori e le interpretazioni imprecise riguardanti il corpo femminile ostacolano la comunità scientifica. L'etimologia stessa della parola "estrale" implica un senso di inferiorità e negatività. Euripide usò il termine per descrivere una "frenesia" o follia, Omero per descrivere il panico e Platone per descrivere una pulsione irrazionale. Questo studio evidenzia come queste prospettive primordiali influenzino l'attuale comunità scientifica e affronti queste preoccupazioni attraverso un nuovo paradigma a mosaico, una combinazione aggiornata di metodi precedentemente studiati, ampliati nella portata di un approccio più completo.

Lo studio e l'uso di questa tecnica sono necessari, in primo luogo, in quanto non esiste una tecnica di monitoraggio standardizzata e completa e le pratiche di interpretazione dei dati possono essere poco chiare. In secondo luogo, sebbene le caratteristiche del ciclo estrale dipendano dai singoli ratti studiati, sono spesso universalizzate. In terzo luogo, mentre i cicli ormonali sono processi di routine e benefici, sono circondati da uno stigma pericoloso esplorato nella sezione "Traduzione in esseri umani". Questo studio mira ad affrontare questi tre problemi in tre modi: (A) descrivendo una tecnica di monitoraggio del ciclo estrale approfondito e chiarendo come i risultati possono essere interpretati, (B) delineando metodi che mantengono l'integrità e l'individualità di ciascun ciclo e (C) richiamando l'attenzione su idee sbagliate che perpetuano pratiche non comprovate.

Questo studio è anche unico nel suo focus sui ratti adolescenti, un periodo segnato da cambiamenti cruciali dello sviluppo che fanno luce su varie manifestazioni comportamentali, anatomiche e fisiologiche nell'età adulta1. Costruire un progetto sperimentale standardizzato per monitorare i cicli ormonali in una popolazione poco studiata mentre decostruisce i pregiudizi comuni consentirà lo sviluppo di correlazioni ormonali affidabili e valide 2,3,4 e la determinazione delle interruzioni del ciclo dipendenti dalla condizione 5,6,7,8,9,10 . In definitiva, queste novità servono ad espandere i criteri diagnostici, i trattamenti e gli interventi di vari problemi di benessere.

Definizioni e usi fondamentali
Il ciclo estrale è un insieme di processi fisiologici dinamici che si verificano in risposta ai tre ormoni steroidei sessuali femminili oscillanti: estradiolo, ormone leuteinizzante (LH) e progesterone (Figura 1A, B). Le interazioni tra il sistema endocrino e il sistema nervoso centrale regolano il ciclo, che il più delle volte persiste per 4-5 giorni e si ripresenta dall'inizio della maturazione sessuale fino alla senescenza riproduttiva e/o alla cessazione. È diviso in categorie separate in base ai livelli ormonali, più comunemente nei 4 stadi di diestro (DIE), proestro (PRO), estro (EST) e metestro (MET), che progrediscono in modo circolare. Il numero di divisioni può variare da 3 fasi11 a 13 fasi12, a seconda della natura dello studio13. Il minor numero di divisioni spesso esclude il MET come fase e lo classifica come un periodo di transizione di breve durata. Il numero più alto include tipicamente sottosezioni che consentono un'ispezione più ravvicinata di fenomeni come lo sviluppo tumorale o la pseudogravidanza spontanea, lo stato fisiologico della gravidanza senza impianto embrionale 12,14,15.

In questo studio, le fasi sono state identificate attraverso componenti del canale vaginale, denominati i 3 determinanti di categorizzazione: tipo di cellula presente, disposizione cellulare e quantità cellulare (Figura 2A-D). Mentre la condizione del liquido vaginale non è stata monitorata in questo studio, si raccomanda di includerlo come quarto componente di categorizzazione. Ulteriori informazioni sull'esame del liquido vaginale possono essere trovate nell'elenco di riferimento16. I componenti di categorizzazione possono essere esaminati estraendo le cellule tramite lavanda vaginale, la tecnica principale raccomandata nel moderno monitoraggio del ciclo estrale. Mentre i processi fisiologici approfonditi all'interno di ogni fase sono al di fuori dello scopo di questo studio, ulteriori informazioni possono essere trovate nella letteratura17.

L'uso e lo sviluppo continuo di questa tecnica di monitoraggio del ciclo estrale è radicato nelle connessioni tra gli ormoni steroidei sessuali e la funzione dei sistemi corporei come il sistema cardiovascolare18, il sistema endocrino8 e il sistema nervoso centrale 19,20,21. Allo stesso tempo, il monitoraggio del ciclo estrale potrebbe non essere sempre necessario quando sono coinvolte roditori femmine 22,23,24,25. Piuttosto, è importante prima considerare se le differenze di sesso sono state riportate nella specifica area di studio, che può essere ulteriormente esplorata nelle recensioni pubblicate22,23. Sebbene il monitoraggio del ciclo estrale sia vitale in un ampio spettro di indagini di ricerca, non dovrebbe essere visto come un ostacolo all'inclusione di roditori di sesso femminile negli esperimenti. Mentre questa tecnica può sembrare complessa e dispendiosa in termini di tempo, la procedura stessa può richiedere meno di 15 minuti per essere completata, a seconda dello sperimentatore, ed è conveniente. Nel complesso, l'inclusione di roditori di sesso femminile negli studi scientifici è vantaggiosa per la comprensione dei sistemi corporei, di varie condizioni e patologie e del benessere generale, poiché questi sviluppi si sono basati principalmente sul modello del corpo maschile.

Parametri universali e variabilità naturali nel roditore
Stabilire intervalli per aspetti considerati "tipici" è necessario per definire modelli di ciclo standard, impostare parametri per scopi comparativi e analitici e rilevare anomalie e valori anomali. Allo stesso tempo, è anche importante riconoscere che il ciclo di ogni ratto è unico e sono previste deviazioni basate sul ceppo animale, sui processi fisiologici e sulle condizioni ambientali. In effetti, uno degli aspetti più "normali" del ciclo estrale è la variabilità. Questo si vede nella lunghezza totale del ciclo, con un intervallo di 3-38 giorni26,27; l'età della maturazione sessuale che può variare da 32-34 giorni a più settimane 28,29,30; ciò che è considerato aciclico11 e i modelli determinanti di categorizzazione11,13. Nel complesso, non esiste un modello universale per il ciclo estrale e tradurlo sia per la comunità scientifica che per il pubblico in generale è una parte importante del processo sperimentale.

Timepoint sperimentali ed età evolutiva
Riconoscere questo principio di variabilità aiuta a costruire un progetto sperimentale affidabile e valido. Ad esempio, l'inizio del monitoraggio del ciclo estrale si basa sullo sviluppo anatomico e fisiologico dei ratti, che varia in base a fattori ambientali e fisiologici. Il monitoraggio non può iniziare fino allo sviluppo dell'apertura vaginale (VO), che è l'orifizio vaginale esterno circondato dalla vulva che porta alla porzione interna del canale vaginale (Figura 3A-D). Mentre il VO spesso si sviluppa completamente tra i 32 ei 34 giorni di età, rimane individualizzato per ciascun soggetto e molto del processo rimane sconosciuto. Questa apertura è stata utilizzata per identificare l'inizio della maturazione sessuale, che è stata collegata all'aumento dell'estradiolo31, alla maturazione dell'asse ipotalamo-ipofisi-ovaio32 e alla prima ovulazione nei ratti 17,33,34,35. Tuttavia, recenti pubblicazioni hanno scoperto che è solo un marcatore indiretto dello sviluppo riproduttivo, in quanto può essere disaccoppiato da eventi ormonali e di sviluppo in ambienti sfavorevoli31 e può rappresentare cambiamenti nei livelli di estradiolo piuttosto che la maturazione sessuale33. Pertanto, si raccomanda di non fare affidamento esclusivamente sul VO per determinare l'età evolutiva e come qualificatore per il monitoraggio del ciclo estrale36, ma di utilizzare anche l'aspetto del primo stadio EST e la cornificazione delle cellule epiteliali30 per segnare l'inizio della maturazione sessuale.

Il peso corporeo è notevolmente correlato all'età evolutiva durante il periodo adolescenziale nei roditori30,37 e può quindi anche aiutare a determinare l'età evolutiva in questo periodo. I meccanismi proposti relativi a questo fenomeno includono la stimolazione degli ormoni necessari per lo sviluppo riproduttivo, come l'ormone della crescita, e l'inibizione dell'asse ipotalamo-ipofisi surrenale (HPA) da parte del regolatore dell'appetito, la leptina30. Tuttavia, non è consigliabile utilizzare questa misura come unico indicatore dell'età evolutiva a causa della grande varianza osservata tra i ratti tra le specie e i fornitori38. La variabilità osservata nello sviluppo del VO e del peso corporeo esemplifica l'importanza del concetto nel processo sperimentale complessivo.

Traduzione per l'uomo: contesti culturali e scientifici
La relazione traslazionale degli studi riproduttivi tra animali e umani è bidirezionale. I risultati di studi su animali influenzano il modo in cui i processi umani vengono valutati, avvicinati e analizzati39. La percezione del sistema riproduttivo umano e dei suoi processi correlati influenza il modo in cui gli animali vengono studiati. In effetti, una delle indicazioni più forti per ulteriori ricerche in questo settore deriva da credenze socioculturali distorte relative ai cicli ormonali che influenzano il processo scientifico. Molte di queste convenzioni derivano da una generale avversione culturale a discutere delle mestruazioni, che ha portato a una lacuna di dati nella conoscenza ben documentata40,41. Questo ha uno spettro di conseguenze che vanno da minori a letali: dall'altezza delle scaffalature e dalle dimensioni dello smartphone al montaggio dell'armatura del corpo di polizia e alle mancate diagnosi di cancro42.

La descrizione delle mestruazioni come insalubri, distruttive e tossiche – viste in testi venerati, media, dizionari e insegnamenti medici – è conservata da pubblicazioni scientifiche. Ciò avviene attraverso descrizioni imprecise e distorte dei cicli ormonali, l'isolamento del sistema riproduttivo dalle sue controparti neuroendocrine e dalle influenze ambientali, e la prospettiva riduzionista del completamento di un ciclo come un "fallimento nel concepire"43,44. Ciò porta alla creazione di pratiche sperimentali non sane, come l'omissione di variabili esterne che influenzano i cicli ormonali, la determinazione di inizio e fine basati esclusivamente su sviluppi anatomici e la misurazione dell'avanzamento del ciclo in modo lineare piuttosto che circolare. Nonostante la correlazione diretta tra fattori socioculturali e conseguenze biologiche, non è spesso considerato nella letteratura scientifica. Attraverso l'ispezione di pubblicazioni più olistiche 43,44,45, i ricercatori possono decostruire questi stigmi e creare progetti sperimentali più affidabili e validi.

Protocollo

Tutti i metodi di manipolazione e procedura delineati in questo protocollo sono in linea con le linee guida per la cura e l'uso degli animali del National Institutes of Health (NIH) e sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Pepperdine University e dal Comitato per la ricerca sugli animali del Cancelliere dell'UCLA (ARC).

1. Cura e uso degli animali

  1. Acquisire ratti femmina, in numero secondo l'analisi di potenza, e ratti maschi per promuovere l'effetto Whitten o più coerente ciclismo46. Determinare il ceppo in base all'obiettivo dello studio in banche dati note47.
    NOTA: I dati attuali riflettono quelli delle adolescenti SD International Genetic Standardization Program (IGS) in presenza di ratti SD maschi situati presso i laboratori della Pepperdine University e dell'UCLA come parte di uno studio collaborativo. Questi ratti sono arrivati in gruppi separati a 28 giorni di età e la progressione del ciclo estrale è stata monitorata per 10 o 20 giorni per dimostrare differenze sui livelli acuti e cronici, a partire dai 34 giorni di età (dopo un periodo di acclimatazione di 7 giorni).
  2. Prima della manipolazione, prevedere una quarantena e/o un periodo di acclimatazione per la stabilizzazione fisiologica dopo il trasporto e l'adattamento al nuovo ambiente.
    NOTA: è stato citato un periodo minimo di 3 giorni, con un periodo di 7 giorni raccomandato 48,49,50,51,52. Nel complesso, questo dipende dalle condizioni di trasporto, dal ceppo animale e dagli obiettivi di studio.
  3. Assicurarsi che lo stress sia ridotto con l'uso di un periodo di acclimatazione, poiché lo stress può interrompere il corretto funzionamento del sistemariproduttivo 53. Tuttavia, non sovracompensare tentando di eliminarlo, poiché una moderata quantità di stress è benefica per il benessere degli animali51.
  4. I ratti ospitano in un ambiente a temperatura (68-79 ° F, cioè 20-26 ° C) e umidità controllata (30-70%) contattando il vivaio o i responsabili di laboratorio e garantendo queste caratteristiche. Distribuire acqua e chow ad libitum con i componenti nutritivi elencati sul sito web dell'azienda e la pulizia della gabbia una volta alla settimana.
    NOTA: In questo studio, i ratti sono stati alloggiati in gruppi di 2 separati per sesso in gabbie di plastica riutilizzabili trasparenti da 19 "x 10" x 8" e hanno avuto accesso a letti di pannocchia di mais che venivano cambiati una volta alla settimana. La temperatura è stata mantenuta a 70 ° F e l'umidità al 35-79%, con una media del 62%.
  5. Verificare lo sviluppo di coda ad anello o necrosi ischemica della coda e delle dita dei piedi per l'evidenza di bassi livelli di umidità relativa e temperature estreme, che possono causare l'alternanza di risposte biologiche.
    NOTA: La temperatura e l'umidità sono importanti per il sistema riproduttivo, la maturazione sessuale e la ciclicità estrale 54,55,56,57,58.
  6. Garantire un'illuminazione adeguata ed equilibrata in tutto lo spazio abitativo depositando uguali quantità di sorgenti luminose in tutto lo spazio di laboratorio che agiscono su un sistema di luce:buio controllato nel tempo.
    NOTA: Qui, un ciclo di luce:buio di 12:12 ore, con luci accese dalle 06:00 alle 18:00, è stato controllato da lampadine a LED lineari da 2.550 lumen.
  7. Seguire i requisiti di lusso forniti52 in base alle variazioni della pigmentazione, dell'età, del ceppo, del sesso e dello stato ormonale degli animali.
    NOTA: quando i ricercatori classificano i campioni di cellule raccolti, un'illuminazione coerente consentirà un corretto rilevamento visivo e una messa in scena affidabile59. La durata e l'intensità della luce sono direttamente correlate al sistema riproduttivo, alla maturazione sessuale e al ciclo estrale 54,55,56,57,60,61.

2. Attrezzatura e preparazione degli esperimenti

  1. Rivedere i determinanti di categorizzazione (visti nella Figura 2A): come identificare ogni fase del ciclo estrale e come utilizzare il microscopio e l'apparecchiatura fotografica.
  2. Assicurarsi che ogni soggetto da monitorare abbia raggiunto la maturazione sessuale e mostri indicatori appropriati di sviluppo: VO, peso corporeo ed età. Pesare i ratti ed esaminarli per IL VO tra alla stessa ora ogni giorno per confronti accurati e trasferirli con un metodo di manipolazione approvato. Consultare il veterinario affiliato all'università se un animale perde più del 20% del suo precedente peso corporeo.
    NOTA: Il VO rimane caudale all'apertura uretrale e cranico all'ano, situato tra i due, come illustrato nella Figura 3.
  3. Poiché questi fattori dipendono dalla deformazione, verificare con il fornitore le specifiche e considerare i fattori ambientali specifici del laboratorio62.
    NOTA: In generale, ciò avverrà tra i 32-34 giorni di età e un peso corporeo medio che va dai 75-150 grammi63 per i ratti SD ed è indicato da un'apertura di forma circolare precedentemente coperta da una guaina membranosa.
  4. Selezionare un periodo di raccolta dei campioni appropriato per il gruppo di ratti monitorati per evitare la raccolta di campioni di transizione. In primo luogo, campionare alcuni animali in 2 o 3 diversi punti temporali durante il giorno per determinare l'ora in cui sono presenti la maggior parte delle fasi del ciclo (ad esempio, campionamento alle 12:00, alle 13:00 e alle 14:00 per animali diversi). Completare la lavanda vaginale alla stessa ora ogni giorno per una messa in scena coerente e affidabile.
    NOTA: È stato riferito che le ore tra le 12:00 e le 14:00 h sono le migliori per catturare tutte le fasi. In questo studio, il monitoraggio del ciclo estrale si è verificato tra le 12:00 e le 14:00 h, gestito con la sospensione in stile compressione (vedere il punto 3.4). L'importanza dei tempi di monitoraggio del ciclo estrale rispetto ad altri interventi sperimentali (ad esempio, condizionamento comportamentale, farmaci) è un'area di ricerca in via di sviluppo e può essere ulteriormente esplorata11. Determinare la durata del monitoraggio del ciclo estrale dipende dallo studio e può essere ulteriormente esplorato negli studi pubblicati11,33.
  5. Rimuovere il coperchio protettivo dal microscopio e collegare la fotocamera al computer rimuovendo il coperchio protettivo dell'obiettivo della fotocamera e posizionando l'obiettivo sopra l'oculare del microscopio.
  6. Quindi, aprire il software preselezionato sul computer. Per utilizzare il software selezionato in questo studio, selezionare la fotocamera collegata all'USB situata sul lato sinistro dello schermo, sotto la scheda denominata Elenco fotocamere. Assicurarsi che la fotocamera USB sia collegata correttamente al computer, che leggerà Nessun dispositivo nella scheda Elenco fotocamere, in caso contrario.
  7. Una volta selezionata la fotocamera USB sotto la scheda, accendere l'interruttore della luce del microscopio situato sulla base.
  8. Creare una cartella sul computer designato per le foto di esempio di cella. Crea una cartella di file per ogni giorno separato in cui i dati vengono raccolti, preparati prima che le immagini vengano scattate.
  9. Con l'attrezzatura preparata, recuperare la gabbia del soggetto dal suo luogo di detenzione e portarla alla stazione di raccolta dei campioni.

3. Raccolta di cellule vaginali

  1. Recuperare una siringa monouso e riempire ciascuna delle siringhe con 0,2 mL di NaCl sterile allo 0,9%. Se sono presenti bolle d'aria, azionare delicatamente la siringa a botte fino a quando tutte le bolle d'aria hanno raggiunto la punta aperta della siringa ed espellere l'aria. Se sono ancora presenti bolle d'aria, espellere nuovamente la soluzione nel recipiente NaCl e ricaricare fino a quando non ce ne sono.
    NOTA: un eccessivo scorrimento può causare la formazione di più bolle d'aria.
  2. Riportare ogni siringa nell'involucro di plastica per mantenere un campo sterile, con la punta della siringa all'interno della parte sigillata dell'involucro.
  3. Aprire la gabbia e sollevare delicatamente il soggetto dalla base della coda o dal tronco del corpo, chiudendo il coperchio della gabbia per impedire ad altri di uscire. Seleziona un metodo di detenzione tra quelli elencati di seguito in base alle preferenze personali e alla risposta degli animali.
  4. Usa la presa in stile compressione per i ratti adolescenti posizionando il soggetto contro la regione superiore del torace, con il naso del soggetto rivolto verso il basso a terra. Prima di iniziare il tampone, assicurarsi che il soggetto sia compresso abbastanza da impedire il movimento ma sia comodo e sicuro nella stiva. Esporre il canale vaginale del soggetto flettendo delicatamente la coda prima di inserire la siringa.
  5. Utilizzare il Hind Leg Lift per ratti adulti posizionando le zampe anteriori dell'animale sulla parte superiore o laterale della gabbia, mentre la coda e gli arti posteriori sono trattenuti con una leggera presa tra il primo e il secondo dito, lasciando il pollice libero per azionare la siringa64.
  6. Consentire agli animali di acclimatarsi alla manipolazione e al monitoraggio. Maneggiare gli animali delicatamente ma in modo sicuro per ridurre lo stress in eccesso e proteggere il ricercatore da aggressioni come mordere.
    NOTA: I primi giorni di monitoraggio potrebbero non produrre i risultati desiderati poiché gli animali si acclimatano alle loro condizioni. Maneggiare gli animali per raccogliere pesi corporei durante il periodo di acclimatazione può aiutare questa transizione33.
  7. Tenendo ferma la siringa con l'indice e il dito medio, inserire la punta della siringa (non più di 2 mm) con un angolo parallelo al canale vaginale. Espellere lentamente il NaCl nel canale spingendo lo stantuffo verso l'interno. Non inserisca ulteriormente la siringa nel canale, poiché ciò potrebbe interrompere il ciclo estrale.
  8. Estrarre il NaCl dal canale vaginale tirando lo stantuffo della siringa lontano dal rivestimento epiteliale (verso l'alto). Se c'è difficoltà a tenere il soggetto in stiva durante questo processo, rimetterlo nella gabbia per un breve periodo di riposo prima di tentare l'estrazione di NaCl.
  9. Una volta che il campione cellulare è stato raccolto, rimettere il soggetto nella gabbia e ripetere questa procedura per ogni animale prima che tutti i campioni vengano valutati al microscopio.
    NOTA: In alternativa, ogni campione può essere raccolto e valutato prima di passare all'animale successivo. Un animale può richiedere una seconda lavanda se il campione non può essere classificato. La stessa siringa della raccolta iniziale può essere riutilizzata se non contatta la soluzione salina direttamente nel contenitore e solo per lo stesso animale.

4. Valutazione del campione

  1. Inizia la categorizzazione esaminando il campione di liquido vaginale estratto. Registrare la viscosità come viscosa o non viscosa e la colorazione come opaca o trasparente sul documento descrittivo o su un altro sistema di registrazione.
    NOTA: questa sezione del protocollo può essere eseguita al momento della raccolta del campione o successivamente.
  2. Espellere 2-3 gocce del fluido su un vetrino per microscopio e posizionare un vetro di copertura del microscopio sopra il vetrino. Posizionare il vetro di copertura sul vetrino del microscopio dalla parte superiore del vetrino verso il basso o da un lato del vetrino all'altro per evitare la formazione di bolle d'aria. Se possibile, lasciare circa la metà del campione raccolto nella siringa se è necessario un ulteriore esame e per evitare che una quantità eccessiva di liquido venga posizionata sul vetrino.
  3. Individuare le cellule raccolte spostando il vetrino del microscopio attraverso il palco. Se ci sono troppo poche cellule o un'elevata quantità di detriti, espellere il fluido rimanente su un nuovo vetrino e riesaminare. Se la quantità di campione rimasta nella siringa è insufficiente, o se la seconda goccia presenta problemi simili, raccogliere un altro campione dal soggetto prima di tentare di identificare la fase del ciclo estrale.
  4. Una volta individuate le celle e prima di toccare il computer o la tastiera del computer, rimuovere l'unico guanto per evitare di sporcare la tastiera.
  5. Acquisisci le immagini dei campioni di cella facendo clic sulla funzione con l'etichetta Snap sul lato sinistro del pannello software.
  6. Quindi, salva il file facendo clic su Salva con nome sotto l'icona File nell'angolo in alto a sinistra della pagina. Salva la foto in una cartella preetichettata sul computer.
    NOTA: modello di etichetta di esempio: #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective obiettivo utilizzato.
  7. Scatta più di una foto su ogni obiettivo se non ci sono molte celle all'interno di ogni fotogramma.
    NOTA: etichette di esempio per più immagini: #1_01/09/2021_EST_4x1 e #1_01/09/2021_EST_4x2.
  8. Ripetere la procedura per ogni campione raccolto sotto più lenti obiettivo. Includi almeno un'oggettivazione più piccola, ad esempio 4x, e almeno un'oggettivazione più grande, ad esempio 20x.
  9. Carica le immagini su un drive / cartella condivisa o su un disco rigido esterno in modo che tutti i ricercatori coinvolti abbiano accesso ai file e siano disponibili copie di backup.

5. Categorizzazione delle fasi

  1. Impostare lo schermo del computer per visualizzare contemporaneamente le foto scattate e il foglio di registrazione (Figura 4A-C).
    NOTA: in questo modo verrà visualizzata la documentazione durante la visualizzazione del campione raccolto. Questa parte del protocollo può essere completata al momento della raccolta del campione o successivamente.
  2. Determinare quali tipi di celle sono presenti nel campione. Selezionare una delle quattro opzioni elencate nei passaggi 5.2.1-5.2.4 utilizzando i criteri e registrare i risultati.
    1. Cellule epiteliali cheratinizzate anucleate (AKE)/cellule epiteliali cornificate
      1. Cerca le cellule frastagliate o a bordo angolare, come visto in Figura 2B e Figura 5C, che nonostante la mancanza di nuclei, possono mostrare aree rotonde chiare (fantasmi nucleari) all'interno della cellula che rappresentano dove un nucleo era una volta presente. Utilizzare un ingrandimento più elevato, come 20x e superiore, per distinguere tra tali cellule nucleate e anucleate.
      2. Usa un ingrandimento più elevato per distinguere la porzione cheratinizzata o cornificata della cellula, un sottile strato di cellule prive di nuclei e piene di cheratina, se lo desideri.
        NOTA: Oltre al loro aspetto frastagliato, questi possono anche essere distinti da come possono piegarsi o smontare, creando strutture frastagliate e allungate note come barre di cheratina.
    2. Grandi cellule epiteliali nucleate (LNE)
      1. Cerca queste celle tipicamente di forma da rotonda a poligonale racchiuse da bordi irregolari, frastagliati o angolari.
      2. Osservare come i loro nuclei possono assumere varie forme, che vanno dall'intatto al degenerato o pykontic, relative alla condensazione irreversibile della cromatina nel nucleo di una cellula in fase di morte o deterioramento, come si vede in Figura 2B e Figura 5D1,2. Prendi nota di come questi nuclei occupano meno spazio del citoplasma all'interno della cellula, con un rapporto nucleare- citoplasmatico (N: C) inferiore rispetto alle piccole cellule epiteliali. Cerca i granuli citoplasmatici che possono essere visti a ingrandimenti più elevati13.
    3. Leucociti (LEU)/neutrofili/cellule polimorfonucleate
      1. Cerca queste cellule sferiche compatte con nuclei multilobulati (quindi, noti come cellule polimorfonucleate), che svaniscono man mano che la cellula matura (Figura 2B e Figura 5A). Un ingrandimento più elevato (ad esempio, 40x) può essere utilizzato per osservare i nuclei multilobulati.
        NOTA: al momento della raccolta e della preparazione, queste cellule possono condensarsi, piegarsi o rompersi.
    4. Piccole cellule epiteliali nucleate (SNE)
      1. Cerca queste cellule di forma da rotonda a ovale che sono più grandi dei neutrofili sopra descritti.
      2. Osservare i nuclei rotondi di queste cellule epiteliali non detinatenziate (Figura 2B), che occupano una maggiore quantità di spazio rispetto al citoplasma all'interno della cellula, creando un rapporto N:C più elevato rispetto alle grandi cellule epiteliali.
        NOTA: al momento della raccolta e della preparazione, queste celle possono piegarsi o sovrapporsi per creare una forma simile a una stringa o a una barra, come illustrato nella Figura 5B1.
  3. Esaminare come sono organizzate le celle presenti nel campione per ogni oggettivazione. Utilizzare l'oggettivazione inferiore, ad esempio 4x, per visualizzare una vista rappresentativa della disposizione complessiva delle celle. Registrare se le cellule sono raggruppate insieme (C), uniformemente disperse (ED) o disperse casualmente (RD) (vedi Figura 4C) e notare l'organizzazione specifica di ciascun tipo di cellula (ad esempio, le piccole cellule epiteliali nucleate sono raggruppate e i neutrofili sono distribuiti uniformemente).
  4. Successivamente, stimare visivamente e registrare la quantità totale di cellule (un po ', moderata, numerosa) e le singole quantità di cellule (percentuale di ciascun tipo di cellula presente).
    NOTA: uno smidge rappresenta il minor numero di celle presenti che possono essere utilizzate per determinare la categorizzazione del campione, numerose rappresentano la presenza di un numero infinito di celle che rappresentano la maggior parte se non tutto lo spazio sulla diapositiva o sono impilate l'una sull'altra, e un numero moderato di celle rappresenta un numero relativamente medio di celle (esempi visti nella Figura 5A-D e nella Figura 6A-D).
  5. Notare se ci sono deviazioni dai criteri elencati o dagli aspetti tipici del soggetto specifico nella categoria "anomalie" e consultare un veterinario, se necessario.
  6. Determinare quale fase del ciclo estrale viene presentata nell'esempio utilizzando i componenti di categorizzazione e le descrizioni riportate di seguito.
    1. Morire
      1. Cerca le LEU come il tipo di cellula dominante o unico presente, disposte in modo raggruppato all'inizio del DIE ma più disperse nelle fasi avanzate.
        NOTA: durante la transizione in DIE, la quantità di cellule può diminuire quando le cellule epiteliali iniziano a rompersi, come si vede nella Figura 6D1. Allo stesso tempo, il numero di LEU inizia ad aumentare e tendono ad essere disposti in modo raggruppato inizialmente e si disperdono nel tempo.
      2. Si noti che la quantità totale di cellule può essere relativamente bassa, il più delle volte nelle fasi successive del periodo DIE, il secondo o il terzo giorno.
      3. Osservare l'elevata quantità di muco che può essere presente in questa fase, che si presenta come filamenti concentrati di LEU (Figura 5A1). Cerca piccoli grumi o filamenti cellulari di cellule SNE che accompagnano le LEU durante le fasi tardive della transizione a PRO (Figura 5A1,2).
      4. Osservare l'aspetto viscoso e opaco del fluido vaginale durante la transizione in, completamente transizionato in e transizione fuori da DIE.
        NOTA: La durata media di questa fase è di 48 ore durante un ciclo di 4 giorni e possibilmente di 72 ore durante un ciclo di 5 giorni.
    2. Pro
      1. Cerca le cellule SNE come cellule dominanti e le leU, LNE e / o cellule AKE che possono essere viste in numero basso. Utilizzare un'elevata oggettivazione per osservare l'aspetto granulare delle celle SNE che sono tipicamente disposte in cluster, fogli o filamenti durante questa fase (Figura 5B1,2).
      2. Osservare l'aspetto viscoso e opaco del fluido vaginale quando si passa da DIE a PRO, e come diventa non viscoso e trasparente una volta completamente trasferito allo stadio PRO (durata media di 14 ore nei ratti).
    3. EST ·
      1. Cerca la dominanza delle cellule AKE, una diminuzione delle cellule SNE in EST e un aumento del numero e delle dimensioni delle cellule mentre EST continua11,13.
      2. Prendere nota della caratteristica distintiva della disposizione spesso raggruppata delle cellule AKE, sotto forma di barre di cheratina o contenenti nuclei fantasma, che possono diventare più casualmente dispersi nella transizione da PRO (Figura 6B) e a MET (Figura 6C).
      3. Osserva il caratteristico fluido vaginale non viscoso e trasparente, che può essere previsto mentre i ratti stanno passando, completamente transizionati e transizionati fuori dall'EST.
        NOTA: La progressione dell'EST include molta diversificazione (Figura 5C e Figura 6B, C). Lo stadio si verifica in genere per una media di 24 ore in un ciclo di 4 giorni o forse 48 ore in un ciclo di 5 giorni.
    4. Incontrato
      1. Cerca un numero maggiore di cellule SNE e LNE mentre il ratto sta passando a MET, dominante in termini di proporzione cellulare all'interno del canale o quasi uguale alla proporzione delle LEU11,13. Inoltre, prendere nota della maggiore quantità di detriti in MET e delle transizioni rispetto ad altre fasi dovute al decadimento cellulare epiteliale dopo EST e spostamento in DIE.
      2. Osservare la mancanza di una disposizione coerente poiché tutti i tipi di cellule sono visti e in varie quantità (Figura 5D1-3). Tuttavia, cerca le LEU che sono imballate o raggruppate in prossimità delle cellule epiteliali nelle fasi iniziali che possono tornare alla disposizione raggruppata durante la transizione in DIE.
      3. Osserva l'aspetto non viscoso e trasparente del fluido vaginale in questa fase e il passaggio a un aspetto più viscoso e opaco mentre ti sposti in DIE.
        NOTA: La durata media di questa fase è di 6-8 ore.
  7. Etichettare i campioni nelle transizioni con lo stadio verso cui il soggetto si sta muovendo, con la transizione tra parentesi per tracciare quando questi vengono raccolti. Ulteriori informazioni su come distinguere tra queste 4 fasi e le loro transizioni sono disponibili nei Risultati rappresentativi.
    NOTA: poiché i campioni raccolti sono statici e il ciclo è dinamico, le diapositive possono rappresentare transizioni tra le fasi (viste nella Figura 6A-D).
  8. Completare questo processo per ogni animale fino al completamento della fase di monitoraggio.
  9. In entrambi i giorni 11 (45 giorni di età) o 21 (55 giorni di età), eutanasia i ratti con il 5% di isoflurano e il 2% di ossigeno prima di una decapitazione a ghigliottina. Questi punti temporali possono variare a seconda della natura dello studio.

Risultati

I dati attuali riflettono quelli delle femmine adolescenti SD International Genetic Standardization Program (IGS) in presenza di ratti SD maschi. Questi animali sono stati localizzati presso i laboratori della Pepperdine University e dell'UCLA come parte di uno studio collaborativo. La Figura 5 presenta molteplici varianti delle 4 fasi del ciclo. Figura 5A1 è stato identificato come un campione di diestro con diversi tipi di cellule presenti. Q...

Discussione

Passaggi chiave e considerazioni importanti
Alcuni passaggi critici nel protocollo fornito richiedono enfasi, specialmente all'interno della raccolta di cellule vaginali. Durante l'estrazione del liquido vaginale, garantire il corretto angolo e profondità di inserimento della siringa è la chiave per produrre risultati soddisfacenti e, in definitiva, prevenire irritazioni, lesioni o stimolazione cervicale all'animale. La stimolazione della cervice può essere una fonte di induzione della pseudogravid...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Riconoscimenti

Questo studio è stato condotto attraverso una collaborazione finanziata dal NIH tra l'Università della California Los Angeles Brain Injury Research Center (BIRC).

Materiali

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