利用阴道灌洗的啮齿动物发情周期监测:没有正常周期这样的事情

摘要

本研究详细介绍了在涉及雌性大鼠的实验设计中需要考虑的关键因素。从更广泛的意义上说，这些数据有助于减少耻辱感，并有助于开发更具包容性的诊断和干预工具。

摘要

目前的方法建立了一种可重复的，标准化的，具有成本效益的方法来监测雌性斯普拉格·道利（SD）青少年大鼠的发情周期。这项研究证明了荷尔蒙周期的复杂性以及构建可靠和有效的监测技术所需的广泛理解。通过对主要实验设计和程序要素的深入研究，这种对循环及其基本原理的描述为进一步理解和解构误解提供了一个框架，供将来复制。

除了使用阴道灌洗的样本收集过程的概述外，该程序还描述了数据分类为发情，发情，发情和发情的四阶段模型的机制。这些阶段的特征是一种新的方法，利用收集时阴道液状况，细胞类型，细胞排列和细胞数量的4个分类决定因素。每个阶段的变化，有利和不利的样本，周期性和非周期性之间的区别以及收集的分类组件的图形描述与数据的有效解释和组织实践一起呈现。总体而言，这些工具首次允许发布可量化的数据范围，从而在复制时实现分类因素的标准化。

引言

新颖的贡献
啮齿动物发情周期已被确定为健康的重要指标。然而，研究人员的无意识偏见和对女性身体的不准确解释阻碍了科学界的发展。"发情"这个词的词源本身就意味着一种自卑感和消极感。欧里庇得斯用这个词来描述"疯狂"或疯狂，荷马用来描述恐慌，柏拉图用来描述一种非理性的驱动力。这项研究强调了这些原始观点如何影响当前的科学界，并通过一种新颖的马赛克范式来解决这些问题 - 以前研究的方法的更新组合，扩大了范围，以更全面的方法。

首先，研究和使用这种技术是必要的，因为没有标准化和全面的监测技术，数据解释实践可能不清楚。其次，尽管发情周期特征取决于正在研究的个体大鼠，但它们通常是普遍存在的。第三，虽然荷尔蒙周期是常规和有益的过程，但它们被"翻译成人类"一节中探讨的危险污名所包围。本研究旨在以三种方式解决这三个问题 - （A）通过描述深入的发情周期监测技术并阐明如何解释结果，（B）通过概述保持每个周期的完整性和个性的方法，以及（C）通过提请人们注意使未经证实的做法永久化的误解。

这项研究的独特之处在于它关注青春期大鼠，这一时期的特点是关键的发育变化，揭示了成年期的各种行为，解剖学和生理表现¹。建立一个标准化的实验设计来监测研究不足的人群中的荷尔蒙循环，同时解构常见的偏见，这将允许开发可靠和有效的荷尔蒙相关性^2，3，4 和确定条件依赖性循环中断^{5，6，7，8，9，10}.最终，这些新颖性有助于扩大各种健康问题的诊断标准，治疗方法和干预措施。

基本定义和用途
发情周期是响应于三种振荡的女性性类固醇激素而发生的动态生理过程的集合:雌二醇，致发光激素（LH）和黄体酮（图1A，B）。内分泌和中枢神经系统之间的相互作用调节周期，该周期通常持续4-5天，并从性成熟开始到生殖衰老和/或停止复发。它根据激素水平分为单独的类别 - 最常见的是发情期（DIE），发情期（PRO），发情期（EST）和发情期（MET）的4个阶段，它们以循环方式进行。分裂的数量可以从3阶段¹¹ 到13阶段¹²，具体取决于研究的性质¹³。较少的划分数量通常将MET排除为一个阶段，并将其归类为短期过渡期。较高的数字通常包括允许更仔细地检查诸如肿瘤发展或自发伪妊娠等现象的小节，即没有胚胎植入的怀孕的生理状态^12，14，15。

在这项研究中，通过阴道管的成分鉴定分期，命名为3个分类决定因素 - 存在的细胞类型，细胞排列和细胞数量（图2A-D）。虽然本研究没有监测阴道液的状况，但建议将其作为第四种分类成分。有关检查阴道液的更多信息，请参见参考列表¹⁶。分类成分可以通过阴道灌洗提取细胞来检查，阴道灌洗是现代发情周期监测中推荐的主要技术。虽然每个阶段的深入生理过程不在本研究的范围之内，但更多信息可以在文献中找到¹⁷.

这种发情周期监测技术的使用和持续发展植根于性类固醇激素与身体系统功能之间的联系，例如心血管系统¹⁸，内分泌系统⁸和中枢神经系统^19，20，21。同时，当涉及雌性啮齿动物^{22，23，24，25}时^，发情周期监测可能并不总是必要的。相反，重要的是首先考虑在特定研究领域是否报告了性别差异，这可以在已发表的评论^22，23中进一步探讨。虽然发情周期监测在广泛的研究调查中至关重要，但它不应被视为将雌性啮齿动物纳入实验的障碍。虽然这种技术可能看起来很复杂且耗时，但根据研究者的不同，该过程本身可能需要不到15分钟的时间才能完成，并且具有成本效益。总体而言，将雌性啮齿动物纳入科学研究有利于了解身体系统，各种病症和病理以及一般健康，因为这些发展主要基于雄性身体模板。

啮齿动物的通用参数和自然变异性
为被视为"典型"的方面建立范围对于定义标准周期模式，设置用于比较和分析目的的参数以及检测异常和异常值是必要的。同时，同样重要的是要认识到每只大鼠的周期都是独一无二的，并且预计会根据动物品系，生理过程和环境条件出现偏差。事实上，发情周期最"正常"的方面之一是可变性。这在整个周期长度中可见，范围为3-38天^26，27;性成熟年龄，范围从32-34天到多周^28，29，30;什么被认为是非周期性的¹¹，和分类行列式模式^11，13。总体而言，发情周期没有通用的模板，将其转化为科学界和公众是实验过程的重要组成部分。

实验时间点和发育年龄
认识到这种可变性原则有助于建立可靠和有效的实验设计。例如，发情周期监测的开始依赖于大鼠的解剖学和生理学发育，这取决于环境和生理因素。在阴道开口（VO）的发展之前，监测无法开始，该阴道口是阴道外孔被通向阴道管内侧的外阴包围（图3A-D）。虽然VO通常在32至34天之间完全发展，但它仍然对每个受试者都是个体化的，并且关于该过程的许多内容仍然未知。这个开口已被用于识别性成熟的开始，这与雌二醇³¹的增加，下丘脑 - 垂体 - 卵巢轴³²的成熟以及大鼠的第一次排卵¹⁷，^33，34，35有关。然而，最近的出版物发现，它只是生殖发育的间接标志，因为它可以与不利环境中的荷尔蒙和发育事件脱钩³¹，并且可能代表雌二醇水平的变化而不是性成熟³³。因此，建议不要仅仅依靠VO来确定发育年龄并作为发情周期监测³⁶的限定符，而是利用第一EST阶段的外观和上皮细胞³⁰的角化来标记性成熟的开始。

在^30，37 的啮齿动物中，体重与青春期的发育年龄显着相关，因此也可以帮助确定该时期的发育年龄。与这种现象相关的拟议机制包括刺激生殖发育所必需的激素，例如生长激素，以及通过食欲调节器瘦素³⁰抑制下丘脑 - 垂体肾上腺（HPA）轴。然而，不建议将这一措施作为发育年龄的唯一指标，因为不同物种和供应商之间的大鼠之间存在巨大差异³⁸。在VO和体重的发展中看到的可变性说明了该概念在整个实验过程中的重要性。

对人类的翻译:文化和科学背景
动物与人类生殖研究的转化关系是双向的。基于动物的研究结果会影响如何评估，接近和分析人类过程³⁹.对人类生殖系统及其相关过程的感知会影响动物的研究方式。事实上，该领域进一步研究的最响亮迹象之一源于与影响科学过程的荷尔蒙周期相关的偏见社会文化信仰。其中许多惯例源于对讨论月经的普遍文化厌恶，这导致了在充分证实的知识方面存在数据差距^40，41。这会产生一系列后果，从轻微到致命 - 从货架高度和智能手机尺寸到警察防弹衣的安装和错过的癌症诊断⁴²。

将月经描述为不卫生，破坏性和有毒 - 在受人尊敬的文本，媒体，字典和医学教义中看到 - 被科学出版物所保留。这是通过对荷尔蒙周期的不准确和有偏见的描述，生殖系统与神经内分泌对应物和环境影响的隔离，以及将周期完成视为"未能受孕"的还原论观点^43，44。这导致产生不健全的实验实践，例如省略影响荷尔蒙周期的外部变量，仅根据解剖学发展确定开始和终点，以及以线性而不是循环方式测量周期进展。尽管社会文化因素与生物学后果之间存在直接相关性，但在科学文献中并不经常考虑这一点。通过检查更全面的出版物^43，44，45，研究人员可以解构这些耻辱感，并创建更可靠和有效的实验设计。

研究方案

本协议中概述的所有处理和程序方法均符合美国国立卫生研究院（NIH）动物护理和使用指南，并已获得佩珀代因大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）和加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会（ARC）的批准。

1. 动物护理和使用

1. 获取雌性大鼠，根据功率分析以数量计，雄性大鼠促进惠顿效应或更一致的循环⁴⁶。根据已知数据库中的研究目标确定菌株⁴⁷.
   注意:目前的数据反映了女性青少年SD国际遗传标准化计划（IGS）的数据，作为合作研究的一部分，位于佩珀代因大学和加州大学洛杉矶分校实验室的男性SD大鼠的存在。这些大鼠在28天大时分组到达，并监测发情周期进展10或20天，以显示急性和慢性水平的差异，从34天龄开始（在7天适应期之后）。
2. 在处理之前，留出一个隔离期和/或适应期，以便在运输和适应新环境后进行生理稳定。
   注:引用了3天的最短期限，建议7天的期限为^{48，49，50，51，52}。总体而言，这取决于运输条件，动物品系和研究目标。
3. 确保使用适应期来减少压力，因为压力会破坏正常的生殖系统功能⁵³。但是，不要通过尝试消除它来过度补偿，因为适量的压力对动物的健康有益⁵¹。
4. 宿主大鼠在温度-（68-79°F，即20-26°C）和湿度控制（30-70%）的环境中，通过联系动物饲养场或实验室管理人员并确保这些特征。随意 分发带有公司 网站上列出的营养成分的水和食物，每周清洁一次笼子。
   注意:在这项研究中，大鼠被安置在2组，按性别分开，在19"x 10"x 8"的透明可重复使用的塑料笼子里，并可以使用每周更换一次的玉米棒床上用品。温度保持在70°F，湿度保持在35-79%，平均为62%。
5. 检查尾巴和脚趾的环尾或缺血性坏死的发展，以寻找相对湿度水平低和极端温度的证据，这可能导致生物反应的交替。
   注意:温度和湿度对生殖系统，性成熟和发情周期^{54，55，56，57，58}很重要。
6. 通过在整个实验室空间中沉积等量的光源，确保整个外壳空间的适当和平衡照明，这些光源作用于时间控制的light:黑暗系统。
   注意:在这里，12:12小时亮:暗循环，06:00-18:00小时亮起，由2，550流明线性LED灯泡控制。
7. 根据动物色素沉着、年龄、菌株、性别和荷尔蒙状态的变化，遵循⁵² 规定的 lux 要求。
   注意:当研究人员对收集的细胞样本进行分类时，一致的照明将允许正确的视觉检测和可靠的分期⁵⁹。光的持续时间和强度与生殖系统、性成熟和发情循环^{54、55、56、57、60、61}直接相关。

2. 设备和实验准备

1. 回顾分类行列式（如图 2A所示）:如何识别发情周期的每个阶段以及如何操作显微镜和相机设备。
2. 确保每个被监测的受试者都已达到性成熟，并显示适当的发育指标 - VO，体重和年龄。称量大鼠并在每天的同一时间检查它们的VO以进行准确的比较，并使用批准的处理方法转移它们。如果动物失去超过其先前体重的20%，请咨询大学附属兽医。
   注意:VO仍然在尿道开口的尾部和肛门的颅骨，位于两者之间，如图 3所示。
3. 由于这些因素与菌株有关，因此请与供应商核实规格，并考虑特定于实验室⁶²的环境因素。
   注意:一般来说，这将发生在32-34天之间，对于SD大鼠来说，平均体重在75-150克⁶³ 之间，并且由先前被膜状鞘覆盖的圆形开口表示。
4. 选择适合被监测大鼠组的样本收集期，以防止收集过渡样本。首先，在一天中的2或3个不同时间点对一些动物进行采样，以确定大多数周期阶段存在的时间（例如，不同动物在12:00小时，13:00小时和14:00小时采样）。每天在同一时间完成阴道灌洗，以获得一致和可靠的分期。
   注意:据报道，12:00至14:00之间的小时最适合捕获所有阶段。在这项研究中，发情周期监测发生在12:00和14:00小时之间，用压缩式保持处理（见步骤3.4）。与其他实验干预（例如，行为调节，药物治疗）相比，发情周期监测时间的重要性是一个发展中的研究领域，可以进一步探索¹¹。确定发情周期监测的持续时间取决于研究，可以在已发表的研究^11，33中进一步探讨。
5. 取下显微镜的保护盖，然后取下相机保护镜盖并将镜头放在显微镜的目镜上，将相机连接到计算机。
6. 然后，在计算机上打开预选软件。要使用本研究中选择的软件，请在标有"相机列表"的选项卡下，选择连接到屏幕左侧 USB 的相机。确保 USB 相机已正确连接到计算机，如果没有，计算机将在标有"相机列表"的选项卡下显示"无设备"。
7. 在选项卡下选择USB相机后，打开位于底座上的显微镜灯开关。
8. 在指定用于细胞样本照片的计算机上创建一个文件夹。为收集数据的每一天创建一个文件夹，在拍摄图像之前预先准备。
9. 准备好设备后，从其存放处取出受试者的笼子并将其带到样品收集站。

3. 阴道细胞的收集

1. 取出一次性注射器，并用0.2 mL无菌0.9%NaCl填充每个注射器。如果存在气泡，请轻轻轻拂枪管注射器，直到所有气泡都到达注射器的开口尖端并排出空气。如果仍然存在气泡，请将溶液排出到NaCl容器中并重新填充，直到没有气泡。
   注:过度轻拂可能会导致形成更多气泡。
2. 将每个注射器返回到塑料包装以保持无菌区域，注射器的尖端位于包装的密封部分内。
3. 打开笼子，轻轻地抬起主体的尾巴底部或身体的躯干，关闭笼子的盖子以防止其他人离开。根据个人喜好和动物反应，从下面列出的方法中选择一种保持方法。
4. 对青少年大鼠使用压缩式保持，将受试者放在上胸部区域，受试者的鼻子向下指向地面。在开始拭子之前，请确保受试者被压缩到足以防止移动，但在保持中舒适和安全。在插入注射器之前，通过轻轻弯曲尾巴来暴露受试者的阴道管。
5. 将动物的前爪放在笼子的顶部或侧面，对成年老鼠使用后腿提升术，而尾巴和后肢则被第一和第二指之间轻轻握住，让拇指自由操作注射器⁶⁴。
6. 让动物适应处理和监测。轻柔而安全地处理动物，以减少多余的压力，并保护研究人员免受咬伤等攻击。
   注意:监测的头几天可能不会产生预期的结果，因为动物会适应自己的病情。在适应期间处理动物收集体重可以帮助这种过渡³³。
7. 在用食指和中指稳定握住注射器的同时，以平行于阴道管的角度插入注射器的尖端（不超过2毫米）。通过将柱塞向内推来缓慢地将NaCl排出到运河中。不要将注射器进一步插入运河，因为这样做可能会破坏发情周期。
8. 通过将注射器的柱塞从上皮衬里拉开（向上）从阴道管中提取NaCl。如果在此过程中难以将受试者保持在保持状态，请将其放回笼中短暂休息，然后再尝试提取NaCl。
9. 收集细胞样品后，将受试者放回笼中，并在显微镜下评估所有样品之前对每只动物重复此过程。
   注意:或者，可以在转移到下一只动物之前收集和评估每个样本。如果样本无法分类，动物可能需要第二次灌洗。如果初始收集的相同注射器不直接接触容器中的盐水并且仅适用于同一动物，则可以重复使用。

4. 样品评估

1. 通过检查提取的阴道液样本开始分类。在描述文档或其他记录系统上将粘度记录为粘性或非粘性，并将着色记录为不透明或透明。
   注意:实验方案的这一部分可以在收集样品时或以后执行。
2. 将2-3滴液体排出到显微镜载玻片上，并将显微镜盖板玻璃放在载玻片顶部。将盖玻片从载玻片的顶部到底部或从载玻片的一侧到另一侧，将盖玻片玻璃放在显微镜载玻片上，以防止形成气泡。如果可能，如果需要进一步检查，请将收集的样品的大约一半留在注射器中，以防止将过量的液体放在载玻片上。
3. 通过移动显微镜载玻片在载物台上找到收集的细胞。如果细胞太少或碎片量太大，请将剩余的液体排出到新的载玻片上并重新检查。如果注射器中剩余的样品量不足，或者第二滴液存在类似问题，则在尝试确定发情周期阶段之前，请从受试者那里收集另一个样品。
4. 找到细胞后，在触摸计算机或计算机键盘之前，请取下一只手套以防止弄脏键盘。
5. 通过单击软件面板左侧标记为 Snap 的功能来获取细胞样品的图像。
6. 然后，通过单击页面左上角"文件"图标下的"另存为"来保存文件。将照片保存在计算机上预先标记的文件夹下。
   注:标签模板示例: #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective镜头。
7. 如果每个帧中没有很多细胞，请在每个物镜上拍摄多张照片。
   注意:多个图像的示例标签: #1_01/09/2021_EST_4x1 和 #1_01/09/2021_EST_4x2。
8. 在多个物镜下对每个收集的样品重复该过程。包括至少一个较小的对象化（如 4x）和至少一个较大的对象化（如 20x）。
9. 将图像上传到共享驱动器/文件夹或外部硬盘驱动器，以便所有涉及的研究人员都可以访问文件并有可用的备份副本。

5. 阶段分类

1. 设置计算机屏幕以同时查看拍摄的照片和记录表（图4A-C）。
   注意:这将允许在查看收集的示例时进行文档记录。实验方案的这一部分可以在收集样品时或以后完成。
2. 确定样品中存在哪些细胞类型。使用条件从步骤 5.2.1-5.2.4 中列出的四个选项中进行选择并记录结果。
   1. 无核角质化上皮 （AKE）/角质化上皮细胞
      1. 如图 2B 和 图5C所示，寻找锯齿状或有棱角分明的细胞，尽管没有细胞核，但它们可能在细胞内显示光圆形区域（核幽灵），代表细胞核曾经存在的位置。使用更高的放大倍率，如20x及以上，来区分这种有核细胞和无核细胞。
      2. 如果需要，使用更高的放大倍率来区分细胞的角化或角化部分 - 一层缺乏细胞核并充满角蛋白的薄细胞层。
         注意:除了锯齿状的外观外，它们还可以通过折叠或拆卸的方式来区分，从而形成锯齿状和细长的结构，称为角蛋白条。
   2. 大有核上皮 （LNE） 细胞
      1. 寻找这些通常由不规则、锯齿状或棱角分明的边框包裹的圆形到多边形单元格。
      2. 观察它们的细胞核如何以各种形式出现，从完整到退化或皮孔，与染色质在经历死亡或恶化的细胞核中的不可逆凝聚有关，如图 2B 和 图5D1，2所示。注意这些细胞核如何比细胞内的细胞质占用更少的空间，其核与细胞质（N:C）的比率低于小上皮细胞。注意在较高放大倍率下可以看到的细胞质颗粒¹³。
   3. 白细胞/中性粒细胞/多形核细胞
      1. 寻找这些具有多叶核的紧凑球形细胞（因此称为多形核细胞），它们随着细胞的成熟而消失（图2B 和 图5A）。更高的放大倍率（例如，40x）可用于观察多叶细胞核。
         注意:在收集和制备时，这些细胞可能会凝结，折叠或破裂。
   4. 小有核上皮 （SNE） 细胞
      1. 注意这些圆形到椭圆形的细胞，它们比上面描述的嗜中性粒细胞大。
      2. 观察这些非角化上皮细胞的圆形细胞核（图2B），其占用的空间比细胞内的细胞质更大，相对于大上皮细胞产生更高的N:C比。
         注意:在收集和准备时，这些单元格可能会折叠或重叠以创建类似于字符串或条形的形状，如图 5B1 所示。
3. 检查样本中存在的细胞如何针对每个对象化进行组织。使用较低的对象化（如 4x）查看整个单元排列的代表性视图。记录细胞是否聚集在一起（C），均匀分散（ED）或随机分散（RD）（见 图4C），并注意每种细胞类型的特定组织（例如，小有核上皮细胞聚集，嗜中性粒细胞均匀分布）。
4. 接下来，直观地估计并记录总细胞数量（少量，中等，数量）和单个细胞数量（每种细胞类型的百分比）。
   注意:smidge表示可用于确定样品分类的最小数量的细胞，数量表示存在无数数量的细胞，这些细胞要么占载玻片上的大部分（如果不是全部）空间，要么彼此堆叠，中等数量的细胞表示相对平均数量的细胞（例如如图5A-D和图6A-D所示）。
5. 注意"异常"类别中特定主题是否与列出的标准或典型方面有任何偏差，并在需要时咨询兽医。
6. 利用分类组件和以下描述，确定样品中呈现的发情周期阶段。
   1. 死
      1. 寻找LEU作为主要或唯一存在的细胞类型，在DIE开始时以团块方式排列，但在后期阶段更分散。
         注意:在过渡到DIE时，随着上皮细胞开始分解，细胞的数量可能会减少，如图6 D1所示。同时，LEI的数量开始增加，它们最初倾向于以聚集的方式排列，并随着时间的推移而分散。
      2. 请注意，细胞的总量可能相对较低，最常见于DIE期的后期阶段，即第二天或第三天。
      3. 观察该阶段可能存在的大量粘液，其表现为浓缩的LEU链（图5A1）。在向PRO过渡的后期阶段，注意伴随LEU的小团块或SNE细胞链（图5A1，2）。
      4. 观察阴道液在过渡到、完全过渡到和过渡出 DIE 时的粘稠和不透明外观。
         注意:该阶段的平均持续时间在4天周期内为48小时，在5天周期内可能为72小时。
   2. 亲
      1. 寻找SNE细胞作为显性细胞，以及可以以低数量看到的LEU，LNE和/或AKE细胞。使用高物化来观察SNE细胞的颗粒状外观，这些细胞通常在此阶段以簇，片状或链状排列（图5B1，2）。
      2. 观察从DIE进入PRO时阴道液的粘性和不透明外观，以及一旦完全过渡到PRO阶段（大鼠平均持续时间为14小时）它如何变得非粘稠和透明。
   3. 最
      1. 寻找AKE细胞的主导地位，EST中SNE细胞的减少，以及随着EST继续^11，13，细胞数量和大小的增加。
      2. 注意AKE细胞通常以角蛋白条或含有鬼核的形式聚集在一起的排列的显着特征，其在从PRO（图6B）到MET（图6C）的过渡中可以变得更加随机地分散。
      3. 观察特征性的非粘性和透明的阴道液，当大鼠正在过渡到，完全过渡到并过渡出EST时，可以预期。
         注:EST的进展包括许多多样化（图5C 和 图6B，C）。该阶段通常在4天周期内平均发生24小时，或在5天周期内可能发生48小时。
   4. 遇到
      1. 当大鼠过渡到MET时，寻找更多数量的SNE和LNE细胞，要么在管内细胞比例方面占主导地位，要么与LEU^11，13的比例接近相等。此外，请注意MET中的碎片数量和其他阶段的更多碎片，这是由于EST之后的上皮细胞衰变并进入DIE而引起的。
      2. 观察缺乏一致的排列，因为可以看到所有细胞类型和不同的数量（图5D1-3）。然而，寻找在开始阶段靠近上皮细胞的堆积或聚集的LEU，这些LEU在过渡到DIE时可能会返回到聚集排列。
      3. 观察该阶段阴道液的非粘性和透明外观，以及在进入DIE时向更粘稠和不透明的外观的变化。
         注意:此阶段的平均持续时间为6-8小时。
7. 用受试者正在走向的阶段标记过渡中的样本，在括号中标记过渡以跟踪何时收集这些样本。有关如何区分这4个阶段及其过渡的更多信息，请参阅 代表性结果。
   注意:由于收集的样品是静态的，循环是动态的，幻灯片可能会描述阶段之间的过渡（如图6A-D所示）。
8. 对每只动物完成此过程，直到监测阶段完成。
9. 在第11天（45天）或21天（55天龄）上，在断头台斩首前用5%异氟醚和2%氧气对大鼠实施安乐死。这些时间点可能因研究的性质而异。

结果

目前的数据反映了女性青少年SD国际遗传标准化计划（IGS）在男性SD大鼠存在的情况下的数据。作为合作研究的一部分，这些动物位于佩珀代因大学和加州大学洛杉矶分校的实验室。 图5 显示了4个循环阶段的多种变化。 图5A1 被鉴定为存在几种细胞类型的双发性样品。该示例表明，具有大量上皮细胞的样品在满足其他分类组分资格（例如 LEI...

讨论

关键步骤和重要注意事项
所提供方案中的某些关键步骤需要强调，特别是在阴道细胞的收集中。在阴道液提取过程中，确保注射器插入的适当角度和深度是产生满意结果并最终防止对动物的刺激，伤害或宫颈刺激的关键。子宫颈的刺激可以是假性妊娠诱导的一个来源，表现为12-14天的白细胞纯阴道涂片¹¹。在显微镜评估阶段，关注显示收集的阴道细胞的视觉平面至...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9%	Live Action Safety	ABB079830939	https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip - 100 Syringes by BH Supplies	BH Supplies	ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821	https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7& keywords=1ml+sterile+syringe&qid= 1572478649&s=industrial &sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa= ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM 0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja 1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2 xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen	Allentown	LV40326013	https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad	Medline	EAN: 0480196288558  Global Trade Identification Number: 40080196288558	https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4