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要約

この研究は、雌ラットを含む実験計画において考慮すべき重要な要因を詳述している。より大きな意味では、これらのデータはスティグマを軽減し、より包括的な診断および介入ツールの開発を支援するのに役立ちます。

要約

現在の方法論は、雌のスプレイグ・ドーリー(SD)思春期ラットの発情周期を監視するための再現性があり、標準化され、費用対効果の高いアプローチを確立している。この研究は、ホルモンサイクルの複雑さと、信頼性が高く有効なモニタリング技術を構築するために必要な幅広い理解を示しています。主要な実験計画と手続き的要素の詳細な検討を通じて、サイクルとその基本原則のこの記述は、さらなる理解のための枠組みを提供し、将来の複製のための誤解を解体する。

この手順では、膣洗浄を用いたサンプル採取プロセスの概要とともに、発情前期、発情期、小胞体、およびジストラスの4段階モデルへのデータ分類のメカニズムについて説明します。これらの段階は、膣液の状態、存在する細胞型、細胞配置、および収集時の細胞量の4つの分類決定因子を利用する、新しい提案されたアプローチによって特徴付けられる。各段階のバリエーション、好ましいサンプルと好ましくないサンプル、周期性と非循環性の区別、および収集された分類コンポーネントのグラフィック描写は、データの効果的な解釈的および組織的実践とともに提示されます。全体として、これらのツールは定量化可能なデータ範囲を初めて公開することを可能にし、レプリケーション時の分類係数の標準化につながります。

概要

斬新な貢献
げっ歯類の発情周期は、健康の重要な指標として同定されています。しかし、研究者の無意識の偏見や女性の体に関する不正確な解釈は、科学界を妨げています。「発情」という言葉の語源そのものが、劣等感と否定性を意味します。エウリピデスはこの用語を「狂乱」または狂気、ホメロスはパニック、プラトンは不合理な衝動を表すために使用しました。この研究は、これらの原始的な視点が現在の科学界にどのように影響するかを強調し、新しいモザイクパラダイム(以前に研究された方法の更新された組み合わせ、より包括的なアプローチの範囲を拡大した)を通じてこれらの懸念に対処します。

標準化された包括的なモニタリング手法はなく、データ解釈の実践が不明瞭な可能性があるため、この手法の研究と使用はまず必要です。第二に、発情周期特性は研究されている個々のラットに依存するが、それらはしばしば普遍化される。第三に、ホルモンサイクルは日常的で有益なプロセスですが、「人間への翻訳」セクションで探求されている危険なスティグマに囲まれています。本研究は、(A)発情周期モニタリング手法を詳細に記述し、その結果がどのように解釈できるかを明らかにすること、(B)各周期の完全性と個性を維持する方法を概説すること、(C)根拠のない慣行を永続させる誤解に注意を喚起すること、の3つの方法でこれら3つの問題に取り組むことを目的とする。

この研究はまた、成人期のさまざまな行動的、解剖学的、生理学的症状に光を当てる重要な発達変化によって特徴付けられる思春期のラットに焦点を当てているという点でもユニークです1。共通のバイアスを解体しながら、研究不足の集団におけるホルモン周期を監視する標準化された実験計画を構築することは、信頼性が高く有効なホルモン相関2,3,4の発達と、状態依存性周期の中断の決定を可能にする5,6,7,8,9,10 .最終的に、これらの新規性は、さまざまなウェルネスの懸念の診断基準、治療、および介入を拡大するのに役立ちます。

基本的な定義と用途
発情周期は、エストラジオール、白水素化ホルモン(LH)、およびプロゲステロンの3つの振動する女性性ステロイドホルモンに応答して起こる動的生理学的プロセスの集まりである(図1A、B)。内分泌系と中枢神経系との間の相互作用は、サイクルを調節し、これは最も頻繁に4〜5日間持続し、性的成熟の開始から生殖老化および/または停止まで再発する。それはホルモンレベルに基づいて別々のカテゴリーに分けられます - 最も一般的には、円形に進行するダイストラス(DIE)、発情前勃起(PRO)、発情(EST)、およびメテストルス(MET)の4段階に分かれています。分割の数は、研究13の性質に応じて、3段階11から13段階12までの範囲であり得る。部門数が少ないほど、METをステージとして除外し、短期間の移行期間として分類することがよくあります。より多い数は、典型的には、腫瘍発生または自発的偽妊娠などの現象のより詳細な検査を可能にするサブセクションを含み、胚性着床を伴わない妊娠の生理学的状態12、14、15。

この研究では、膣管の構成要素を通して段階が同定され、存在する細胞型、細胞配置、および細胞量の3つの分類決定因子が命名された(図2A-D)。この研究では膣液の状態はモニターされなかったが、第4の分類成分としてそれを含めることが推奨される。膣液の検査に関するさらなる情報は、参照リスト16に見出すことができる。分類成分は、現代の発情サイクルモニタリングで推奨される主要な技術である膣洗浄を介して細胞を抽出することによって調べることができます。各段階内の詳細な生理学的プロセスはこの研究の範囲外であるが、より多くの情報は文献17で見つけることができる。

この発情周期モニタリング技術の使用および継続的な開発は、性ステロイドホルモンと心血管系18、内分泌系8、および中枢神経系19、20、21などの身体系の機能との間の接続に根ざしている。同時に、雌のげっ歯類が関与している場合、発情サイクルモニタリングは必ずしも必要ではないかもしれません22,23,24,25。むしろ、性差が特定の研究分野で報告されているかどうかを最初に検討することが重要ですが、これは公開されたレビュー22,23でさらに調査することができます。発情サイクルモニタリングは、幅広い研究調査において不可欠ですが、雌のげっ歯類を実験に含めることの障害と見なされるべきではありません。この手法は複雑で時間がかかるように見えるかもしれませんが、治験責任医師によっては、手順自体の完了に15分もかからず、費用対効果が高い場合があります。全体として、科学的研究に女性のげっ歯類を含めることは、これらの開発が主に男性の身体テンプレートに基づいているため、身体系、様々な状態および病理、および一般的な健康の理解に有利である。

げっ歯類の普遍的なパラメータと自然変動
標準サイクルパターンの定義、比較・分析のためのパラメータ設定、異常や外れ値の検出には、「典型的」と見られる側面の範囲を設定する必要があります。同時に、各ラットのサイクルは一意であり、動物の系統、生理学的プロセス、および環境条件に基づく逸脱が予想されることを認識することも重要です。実際、発情周期の最も「正常な」側面の1つは変動性です。これは、3-38日26,27の範囲で、全サイクル長で見られます。32-34日から数週間28,29,30までの範囲の性的成熟の年齢;非循環的と考えられるもの11、及び分類行列式パターン11、13とする。全体として、発情サイクルの普遍的なテンプレートはなく、それを科学界と一般市民の両方に翻訳することは、実験プロセスの重要な部分です。

実験の時期と発達年齢
この変動性の原理を認識することは、信頼性が高く有効な実験計画の構築に役立ちます。例えば、発情性サイクリングモニタリングの開始は、ラットの解剖学的および生理学的発達に依存しており、これは環境的および生理学的要因に基づいて変化する。モニタリングは、膣管の内部部分につながる外陰部に囲まれた外部膣オリフィスである膣開口部(VO)の発達まで開始できない(図3A-D)。VOはしばしば32歳から34日の間に完全に発達するが、それは各被験者に個別化されたままであり、その過程について多くは不明のままである。この開口部は、エストラジオール31の増加、視床下部-下垂体-卵巣軸32の成熟、およびラットにおける最初の排卵17、33、34、35に関連している性的成熟の開始を特定するために使用されてきた。しかしながら、最近の刊行物は、それが不利な環境におけるホルモンおよび発達的発生から切り離される可能性があり31、性的成熟33ではなくエストラジオールレベルの変化を表す可能性があるため、生殖発達の間接的なマーカーにすぎないことを見出した33。したがって、VOのみに頼って発育年齢を決定し、発情周期モニタリング36の修飾子としてではなく、第1EST段階の出現および上皮細胞30の角化を利用して性的成熟の開始をマークすることが推奨される。

体重は、げっ歯類30,37の青年期の発達年齢と著しく相関しており、したがって、この期間の発達年齢の決定にも役立つ可能性がある。この現象に関連する提案されたメカニズムには、成長ホルモンなどの生殖発達に必要なホルモンの刺激、および食欲調節因子であるレプチンによる視床下部 - 下垂体副腎(HPA)軸の阻害が含まれる30。しかし、種間およびベンダー提供者間でラット間に見られる大きな差異のために、この尺度を発達年齢の唯一の指標として使用することは推奨されない38。VOおよび体重の発達に見られる変動性は、全体的な実験プロセスにおける概念の重要性を例示する。

人間への翻訳:文化的および科学的背景
動物とヒトの生殖研究の翻訳関係は双方向である。動物ベースの研究の結果は、ヒトのプロセスがどのように評価され、アプローチされ、分析されるかに影響を与える39。人間の生殖器系とそれに関連するプロセスの認識は、動物がどのように研究されるかに影響を与えます。実際、この分野におけるさらなる研究のための最も大きな兆候の1つは、科学的プロセスに影響を与えるホルモンサイクルに関連する偏った社会文化的信念に由来しています。これらの慣習の多くは、月経を議論することに対する一般的な文化的嫌悪感から派生しており、それは十分に実証された知識のデータギャップをもたらしました40,41。これには、棚の高さやスマートフォンのサイズから、警察のボディアーマーのフィッティングや見逃したがん診断42まで、軽微なものから致命的なものまで、さまざまな結果があります。

月経が非衛生的で破壊的で有毒であるという記述は、尊敬されるテキスト、メディア、辞書、医学の教えに見られるが、科学出版物によって保存されている。これは、ホルモン周期の不正確で偏った記述、生殖器系を神経内分泌の対応物および環境の影響から隔離すること、および「妊娠の失敗」としての周期の完了の還元主義的視点によって起こる43,44。これは、ホルモンサイクルに影響を与える外部変数の省略、解剖学的発達のみに基づいて開始とエンドポイントの決定、循環的ではなく線形のサイクル進行の測定など、不健全な実験的実践の作成につながります。社会文化的要因と生物学的結果との間には直接的な相関関係があるにもかかわらず、科学文献ではあまり考慮されていません。より包括的な出版物43,44,45の検査を通じて、研究者はこれらのスティグマを解体し、より信頼性が高く有効な実験計画を作成することができます。

プロトコル

このプロトコルで概説されているすべての取り扱いおよび手順方法は、国立衛生研究所(NIH)の動物の世話と使用のガイドラインと一致しており、ペパーダイン大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)とUCLA学長の動物研究委員会(ARC)によって承認されています。

1. 動物の世話と使用

  1. 雌ラットを、検出力分析による数で、および雄ラットがホイッテン効果またはより一貫したサイクリングを促進するように取得する46。既知のデータベース47における研究の目的に基づいてひずみを決定する。
    注:現在のデータは、共同研究の一環として、ペパーダイン大学とUCLAの両方の研究所にある雄SDラットの存在下での女性の思春期のSD国際遺伝子標準化プログラム(IGS)のデータを反映しています。これらのラットは28日齢で別々の群に到着し、発情周期の進行を10日または20日間モニターして、34日齢(7日間の馴化期間の後)から急性および慢性レベルの差を実証した。
  2. 取り扱い前に、輸送後の生理学的安定化のための検疫および/または順応期間を設け、新しい環境に適応させてください。
    注:3日間の最小期間が引用されており、7日間の期間が推奨されています48,49,50,51,52.全体として、これは輸送条件、動物の系統、および研究目的に依存します。
  3. ストレスが適切な生殖器系の機能を混乱させる可能性があるため、順応期間を使用してストレスが軽減されるようにする53。しかし、適度な量のストレスが動物の幸福に有益であるため、それを排除しようとすることによって過剰に補償しないでください51。
  4. 温度(68〜79°F、すなわち、20〜26°C)および湿度制御(30〜70%)の環境において、ビバリウムまたは実験室管理者に連絡し、これらの特徴を確保することによって、宿主ラットを宿主ラットとする。当社ホームページに掲載されている栄養成分を含む水と固形飼料を 自由自在 に配布し、週に1回ケージクリーニングを行います。
    注:この研究では、ラットは19インチ x 10インチ x 8インチの透明な再利用可能なプラスチックケージで性別で区切られた2人のグループに収容され、週に1回交換されたコーンコブ寝具にアクセスできました。温度は70°F、湿度は35〜79%に維持され、平均62%であった。
  5. 生物学的応答の交替を引き起こす可能性のある低い相対湿度レベルおよび極端な温度の証拠について、尾およびつま先のリングテールまたは虚血性壊死の発症をチェックする。
    注:温度と湿度は、生殖器系、性的成熟、および発情周期性54,55,56,57,58にとって重要です。
  6. 時間制御された明暗システムに作用する実験室空間全体に等量の光源を堆積させることによって、ハウジング空間全体で適切でバランスの取れた照明を確保します。
    注:ここでは、06:00-18:00 hからライトが点灯した12:12-hの明暗サイクルは、2,550ルーメンのリニアLED電球によって制御されていました。
  7. 動物の色素沈着、年齢、ひずみ、性別、ホルモン状態の変化に基づいて52のルクス要件に従ってください。
    注:研究者が収集された細胞サンプルを分類すると、一貫した照明により、適切な視覚的検出と信頼性の高いステージングが可能になります59。光の持続時間と強度は、生殖器系、性的成熟、および発情サイクリングに直接関係しています54,55,56,57,60,61。

2. 装置・実験準備

  1. 分類決定要因( 図2Aを参照)を確認します:発情周期の各段階を識別する方法と、顕微鏡とカメラ機器を操作する方法。
  2. 監視対象の各被験者が性的成熟に達し、VO、体重、年齢などの発達の適切な指標を示していることを確認してください。ラットの体重を量り、正確な比較のために毎日同じ時間にVOについて調べ、承認された取り扱い方法でそれらを転送します。動物が以前の体重の20%以上を失った場合は、大学付属の獣医師に相談してください。
    注:VOは、 図3に示すように、尿道開口部に尾側、肛門に頭蓋骨のままであり、両者の間に位置する。
  3. これらの要因はひずみに依存するため、サプライヤーに仕様を確認し、ラボ62に固有の環境要因を考慮してください。
    注:一般に、これは生後32〜34日とSDラットの平均体重75〜150グラム63 の範囲の間に起こり、以前は膜状の鞘で覆われていた円形の開口部によって示される。
  4. 監視対象のラットのグループに適したサンプル収集期間を選択して、過渡的なサンプルの収集を防止します。まず、1日を通して2つまたは3つの異なる時点で数匹の動物をサンプリングして、ほとんどのサイクルステージが存在する時間を決定します(例えば、異なる動物については12:00時間、13:00時間、および14:00時間でサンプリングします)。一貫性のある信頼性の高いステージングのために、毎日同時に膣洗浄を完了します。
    注:12:00から14:00までの時間がすべてのステージをキャプチャするのに最適なと報告されています。この研究では、発情周期モニタリングは12:00〜14:00時間の間に行われ、圧縮スタイルのホールドで処理されました(ステップ3.4を参照)。他の実験的介入(例えば、行動条件付け、投薬)に対する発情周期モニタリングタイミングの重要性は、研究の発展分野であり、さらに探求することができる11。発情周期モニタリングの持続時間を決定することは研究に依存しており、公表された研究11,33でさらに探求することができる。
  5. 顕微鏡から保護カバーを取り外し、保護カメラのレンズカバーを取り外し、顕微鏡の接眼レンズの上にレンズを置いて、カメラをコンピュータに取り付けます。
  6. 次に、コンピューターで事前に選択したソフトウェアを開きます。このスタディで選択したソフトウェアを使用するには、画面の左側にあるUSBに接続されているカメラを[カメラリスト]というラベルの付いたタブで選択します。USBカメラがコンピュータに正しく接続されていることを確認します。正しく接続されていない場合は、[カメラリスト]というラベルの付いたタブの下に[デバイスなし]と表示されます。
  7. タブの下でUSBカメラを選択したら、ベースにある顕微鏡ライトスイッチをオンにします。
  8. セルサンプル写真用に指定されたフォルダをコンピュータ上に作成します。データが収集される個別の日ごとに、イメージが取得される前に事前に準備されたファイルフォルダを作成します。
  9. 機器を準備したら、被験者のケージを保管場所から取り出し、サンプル採取ステーションに持ち込みます。

3. 膣細胞の採取

  1. 使い捨てシリンジを取り出し、各シリンジに0.2mLの滅菌0.9%NaClを充填します。気泡が存在する場合は、すべての気泡がシリンジの開いた先端に達するまでバレルシリンジを静かにフリックし、空気を排出します。気泡がまだ存在する場合は、溶液をNaClレセプタクルに戻し、何もなくなるまで補充します。
    メモ: フリックしすぎると、より多くの気泡が形成されることがあります。
  2. 各シリンジをプラスチックラッピングに戻して、シリンジの先端をラッピングの密封部分の内側にして、滅菌フィールドを維持します。
  3. ケージを開き、尾の付け根または体の幹のいずれかで被験者を静かに持ち上げ、他の人が出ないようにケージの蓋を閉めます。個人の嗜好や動物の反応などから、以下のものから開催方法を選択してください。
  4. 思春期のラットには、被験者の鼻を地面に向け、被験者を胸の上部領域に当てて、圧縮スタイルのホールドを使用します。綿棒を開始する前に、被写体が動きを妨げるのに十分な圧縮状態になっているが、貨物室で快適で安全であることを確認してください。シリンジを挿入する前に尾を静かに曲げることによって、被験者の膣管を露出させる。
  5. 成体ラットには、動物の前足をケージの上部または側面のいずれかに置き、尾と後肢を第1指と第2指の間に緩やかに保持して拘束し、親指を自由にしてシリンジ64を操作できるようにして、成体ラットには後肢リフトを使用する。
  6. 動物が取り扱いと監視に順応するのを待ちます。動物を優しく、しかもしっかりと扱って、過剰なストレスを軽減し、噛むなどの攻撃性から研究者を保護します。
    注:モニタリングの最初の数日間は、動物がそれぞれの状態に順応するにつれて、望ましい結果をもたらさない場合があります。馴化期間中に体重を収集するために動物を取り扱うことは、この移行33を助けることができる。
  7. 人差し指と中指でシリンジをしっかりと保持しながら、シリンジの先端(2mm以下)を膣管に平行な角度で挿入します。プランジャーを内側に押し込んで、NaCl をゆっくりと運河に排出します。シリンジを運河にさらに挿入しないでください, そうすることは発情サイクルを混乱させる可能性があるため、.
  8. シリンジのプランジャーを上皮ライニングから引き離す(上向きに)ことによって、膣管からNaClを抽出する。このプロセス中に被験者をホールドに保持することが困難な場合は、NaCl抽出を試みる前に、短い休息期間の間、それらをケージに戻してください。
  9. 細胞サンプルが収集されたら、被験者をケージに戻して、すべてのサンプルが顕微鏡下で評価される前に、各動物についてこの手順を繰り返します。
    注:あるいは、次の動物に移る前に、各サンプルを収集して評価することもできます。動物は、サンプルを分類できない場合、2回目の洗浄が必要な場合があります。最初のコレクションからの同じ注射器は、容器内の生理食塩水に直接接触せず、同じ動物に対してのみ再利用することができます。

4. サンプル評価

  1. 抽出した膣液サンプルを調べることによって分類を開始します。粘度を粘性または非粘性のいずれかとして記録し、着色を不透明または透明として説明文書または他の記録システムに記録する。
    メモ: プロトコルのこのセクションは、サンプル収集時以降に実行できます。
  2. 2〜3滴の液体を顕微鏡スライド上に排出し、スライドの上に顕微鏡カバーガラスを置きます。気泡の形成を防ぐために、スライドの上部から下部へ、またはスライドの一方の側から他方の側へ、顕微鏡スライド上のカバーガラスを置きます。可能であれば、さらなる検査が必要な場合は、回収したサンプルの約半分をシリンジに残し、過剰な量の流体がスライド上に置かれるのを防ぎます。
  3. 顕微鏡スライドをステージ上で動かして、収集された細胞を見つけます。細胞が少なすぎる場合や破片の量が多い場合は、残りの液体を新しいスライドに排出して再検査してください。シリンジに残っているサンプルの量が不足している場合、または2滴目が同様の問題を示している場合は、発情サイクル段階の特定を試みる前に、被験者から別のサンプルを収集してください。
  4. セルの位置が決まったら、コンピュータまたはコンピュータのキーボードに触れる前に、キーボードを汚さないように手袋を 1 つ取り外します。
  5. ソフトウェアパネルの左側にある 「スナップ 」というラベルの付いた機能をクリックして、セルサンプルの画像を取得します。
  6. 次に、ページの左上隅にある[ファイル]アイコンの下にある[ 名前を付けて保存 ]をクリックして ファイル を保存します。コンピューター上のラベルの付いたフォルダーの下に写真を保存します。
    メモ: ラベルテンプレートの例: 使用#subjectnumber_date collected_estrous stage_objectiveレンズ。
  7. 各フレーム内に多くのセルがない場合は、各対物レンズで複数の写真を撮ります。
    メモ: 複数の画像のラベルの例: #1_01/09/2021_EST_4x1 および #1_01/09/2021_EST_4x2。
  8. 複数の対物レンズの下で収集したサンプルごとに手順を繰り返します。少なくとも 1 つの小さな客観化 (4x など) と、少なくとも 1 つの大きな客観化 (20x など) を含めます。
  9. 画像を共有ドライブ/フォルダまたは外付けハードドライブにアップロードして、関係するすべての研究者がファイルにアクセスでき、バックアップコピーが利用可能になるようにします。

5. ステージの分類

  1. 撮影した写真と記録用紙を同時に表示するようにコンピュータ画面を設定します(図 4A-C)。
    メモ: これにより、収集されたサンプルの表示中にドキュメントを表示できます。プロトコルのこの部分は、サンプル収集時以降に完了することができる。
  2. サンプル中に存在する細胞型を特定します。ステップ 5.2.1 から 5.2.4 にリストされている 4 つのオプションから基準を使用して選択し、その結果を記録します。
    1. 無肛門切開角化上皮(AKE)/角化上皮細胞
      1. 図2Bと図5Cに見られるように、ギザギザまたは角張ったエッジの細胞を探します.これは、核がないにもかかわらず、核がかつて存在していた場所を表す細胞内の明るい丸い領域(核幽霊)を示す可能性があります。20倍以上の高倍率を使用して、有核細胞と無核細胞などを区別する。
      2. 必要に応じて、細胞の角化部分または角化部分(核を欠き、ケラチンで満たされた細胞の薄い層)を区別するために、より高い倍率を使用します。
        注:ギザギザの外観に加えて、これらはまた、ケラチンバーとして知られているギザギザの細長い構造を作成し、折り畳んだり分解したりする方法によって区別することができます。
    2. 大型有核上皮(LNE)細胞
      1. 不規則な境界線、ギザギザの境界線、または角度のある境界線で囲まれた、通常は丸い形から多角形のセルを探します。
      2. 図2Bおよび図5D1,2に見られるように、それらの核が死または劣化中の細胞の核におけるクロマチンの不可逆的凝縮に関連して、無傷から縮退またはピコンティックに至るまで、さまざまな形態をとる可能性があることを観察する。これらの核は、細胞内の細胞質よりも少ないスペースを占め、小さな上皮細胞よりも核対細胞質(N:C)比が低いことに注意してください。より高い倍率で見ることができる細胞質顆粒を探してください13。
    3. 白血球(LEU)/好中球/多形核細胞
      1. 細胞が成熟するにつれて消失する多葉核を持つこれらのコンパクトな球状細胞(したがって、多形核細胞として知られている)を探してください(図2B および 図5A)。より高い倍率(例えば、40倍)を使用して、多葉性核を観察することができる。
        注:収集および調製時に、これらの細胞は凝縮、折り畳み、または破裂することがあります。
    4. 小有核上皮(SNE)細胞
      1. 上記の好中球よりも大きいこれらの丸い楕円形の細胞を探してください。
      2. これらの非角化上皮細胞(図2B)の丸い核を観察し、細胞内の細胞質よりも大きな空間を占有し、大きな上皮細胞に対してより高いN:C比を作り出します。
        注: 収集および準備時に、これらのセルが折り畳まれたり重なったりして、 図 5B1 に示すように、ひもまたは棒に似た形状になることがあります。
  3. サンプル中に存在する細胞が、各客観化に対してどのように編成されているかを調べます。4x などの下部の客観化を使用して、セル配置全体の代表的なビューを表示します。細胞が凝集しているか(C)、均等に分散しているか(ED)、ランダムに分散しているか(RD)を記録し( 図4C参照)、各細胞タイプの特定の組織に注意してください(例えば、小さな有核上皮細胞が凝集し、好中球が均等に分布しています)。
  4. 次に、総細胞量(スミッジ、中程度、多数)と個々の細胞量(存在する各細胞タイプの割合)を視覚的に推定して記録します。
    注: スミッジは、サンプルの分類を決定するために使用できるセルの最小数を表し、多数は、スライド上のスペースのすべてではないにしても、ほとんどを占めるか、または互いに積み重ねられている無数のセルの存在を表し、適度な数のセルは比較的平均的なセル数を表します(図 5A-D および図 6A-D の例を参照)。
  5. 「異常」カテゴリの特定の被験者に典型的なリストされた基準または側面のいずれかからの逸脱があるかどうかに注意し、必要に応じて獣医師に相談してください。
  6. どの発情周期段階がサンプルに提示されているかを判断し、分類成分と以下の説明を使用します。
    1. 死ぬ
      1. LEUは、DIEの開始時に凝集した形で配置され、後期段階ではより分散した、優勢または唯一の細胞型として存在する。
        注: 図6D1に示すように、DIEに移行している間、上皮細胞が分解し始めると、細胞の量が減少することがあります。同時に、LEUの数は増加し始め、最初は凝集して配置され、時間の経過とともに分散する傾向があります。
      2. 細胞の総量は比較的少なく、ほとんどの場合、DIE期間の後期、2日目または3日目に行われる可能性があることに注意してください。
      3. この段階で存在する可能性のある大量の粘液を観察し、LEUの濃縮鎖として提示します(図5A1)。PROへの移行の後期段階でLEUに付随するSNE細胞の小さな凝集塊または細胞鎖を探してください(図5A1,2)。
      4. DIEに移行し、完全に移行し、DIEから移行するときの膣液の粘性および不透明な外観を観察します。
        注: この段階の平均所要時間は、4 日間のサイクルでは 48 時間、場合によっては 5 日間のサイクルでは 72 時間です。
    2. プロ
      1. 優勢な細胞としてSNE細胞を探し、LEU、LNE、および/またはAKE細胞は、少ない数で見ることができます。この段階では、通常、クラスター、シート、またはストランドに配置されたSNE細胞の粒状の外観を観察するために、高い客観化を使用します(図5B1,2)。
      2. DIEからPROに移行する際の膣液の粘性および不透明な外観、およびPRO段階に完全に移行すると、それが非粘性で透明になる様子を観察します(ラットの平均持続時間は14時間)。
    3. ティッカー
      1. AKE細胞の優位性、ESTにおけるSNE細胞の減少、およびESTが続くにつれて細胞の数とサイズの増加を探してください11,13。
      2. AKE細胞のしばしばクラスター化された配置の際立った特徴に注意してください、ケラチンバーの形で、またはゴースト核を含む、PROからMETへの移行(図6B)およびMETへの移行においてよりランダムに分散する可能性がある(図6C)。
      3. ラットがESTに移行し、完全に移行し、ESTから移行するにつれて期待できる特徴的な非粘性で透明な膣液を観察します。
        注: EST の進行には、多くの多様化が含まれます (図 5C および 図 6B、C)。この段階は、通常、4日間のサイクルで平均24時間、または5日間のサイクルでおそらく48時間発生します。
    4. 会った
      1. ラットがMETに移行しつつあるため、チャネル内の細胞比率の点で優勢であるか、LEUs11,13と同等の割合に近いSNEおよびLNE細胞の数が多いことを探します。さらに、MET内の破片の量と、ESTに続いて上皮細胞が崩壊してDIEに移動することによる他の段階よりも転移に注意してください。
      2. すべての細胞型が様々な量で見られるので、一貫した配置の欠如を観察してください(図5D1-3)。しかし、初期段階で上皮細胞の近くでパッキングまたは凝集しているLEUを探し、DIEに移行するときに凝集した配置に戻る可能性があります。
      3. この段階での膣液の非粘性で透明な外観と、DIEに移行しながらより粘性があり不透明な外観に変化するのを観察します。
        注:この段階の平均持続時間は6-8時間です。
  7. 被験者が移動しているステージの遷移中のサンプルにラベルを付け、遷移を括弧内にラベル付けして、これらがいつ収集されたかを追跡します。これらの4つの段階とその遷移を区別する方法の詳細については、 代表的な結果を参照してください。
    メモ: 収集されたサンプルは静的であり、サイクルは動的であるため、スライドはステージ間の遷移を示す場合があります(図 6A-D を参照)。
  8. モニタリングフェーズが完了するまで、各動物についてこのプロセスを完了します。
  9. 11日目(45日齢)または21日目(55日齢)のいずれかに、ギロチン断頭前にラットを5%イソフルランおよび2%酸素で安楽死させる。これらの時点は、研究の性質によって異なる場合があります。

結果

現在のデータは、雄SDラットの存在下での女性の思春期のSD国際遺伝子標準化プログラム(IGS)のデータを反映しています。これらの動物は、共同研究の一環としてペパーダイン大学とUCLAの両方の研究所にありました。図5は、4サイクル段階の複数のバリエーションを示しています。図5A1は、いくつかの細胞型が存在するダイストラスサ?...

ディスカッション

重要な手順と重要な考慮事項
提供されたプロトコルにおける特定の重要なステップは、特に膣細胞の集合内で、強調を必要とする。膣液抽出中、シリンジ挿入の適切な角度と深さを確保することは、満足のいく結果を生み出し、最終的に動物への刺激、傷害、または子宮頸部刺激を防止するための鍵です。子宮頸部の刺激は、白血球のみの膣塗抹標本11の12〜14日目によって示?...

開示事項

著者らは、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校脳損傷研究センター(BIRC)のNIH資金提供による共同研究を通じて実施されました。

資料

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