JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول الخاص بالقياس عالي الإنتاجية لحركة الخلية في الخلايا الكيراتينية HaCaT طرقا لجمع ومعالجة صور نوى الخلية وإجراء تتبع الجسيمات باستخدام المكون الإضافي ImageJ TrackMate.

Abstract

تلعب الهجرة الخلوية الجماعية دورا رئيسيا في العديد من العمليات البيولوجية الأساسية بما في ذلك التطور والتئام الجروح ورم خبيث السرطان. لفهم تنظيم حركة الخلية ، يجب أن نكون قادرين على قياسها بسهولة وثبات في ظل ظروف مختلفة. نصف هنا طريقة لقياس وقياس الحركة أحادية الخلية والسائبة للخلايا الكيراتينية HaCaT باستخدام صبغة نووية. تتضمن هذه الطريقة نصا برمجيا MATLAB لتحليل ملفات إخراج TrackMate لحساب الإزاحة ومعدلات الحركة وزوايا المسار في الخلايا المفردة وبكميات كبيرة لموقع التصوير. يسمح البرنامج النصي لتحليل الحركة هذا بتحليل سريع ومباشر وقابل للتطوير لمعدلات حركة الخلايا من بيانات TrackMate ويمكن استخدامه على نطاق واسع لتحديد ودراسة تنظيم الحركة في الخلايا الظهارية. نقدم أيضا نصا برمجيا ل MATLAB لإعادة تنظيم مقاطع فيديو الفحص المجهري التي تم جمعها على المجهر وتحويلها إلى مكدسات TIF ، والتي يمكن تحليلها باستخدام المكون الإضافي ImageJ TrackMate بكميات كبيرة. باستخدام هذه المنهجية لاستكشاف أدوار تقاطعات الملتصقات وديناميكيات الهيكل الخلوي الأكتين في تنظيم حركة الخلايا في الخلايا الكيراتينية HaCaT ، نوضح دليلا على أن نشاط Arp2 / 3 مطلوب للحركة المرتفعة التي شوهدت بعد استنفاد α-catenin في الخلايا الكيراتينية HaCaT.

Introduction

يعد التنظيم الدقيق والمتجاوب لحركة الخلايا في الخلايا الظهارية أمرا بالغ الأهمية لالتئام الجروح وتجديد الطبقة الظهارية. يمكن أن يؤدي الفشل في الحفاظ على الحركة إلى مشاكل في النمو الجنيني والتئام الجروح1 وتعد إشارات الحركة المفرطة مساهما رئيسيا في ورم خبيث للسرطان2.

يوفر فهم التحكم الخلوي في الحركة في الخلايا الكيراتينية HaCaT رؤى مهمة حول هذه العمليات. توفر الإجراءات الموضحة هنا قياسات وحسابات متسقة لمتوسط حجم الحركة الخلوية على مستوى الخلية المفردة أو السكانية. لقد استخدمنا هذه الطريقة لقياس الحركة في الخلايا الكيراتينية HaCaT بعد الاضطراب الجيني أو العلاج بمثبطات الجزيئات الصغيرة لفهم إشارات الخلية التي تتحكم في معدلات الحركة. يقيس البرنامج النصي MATLAB المقدم كلا من متوسط السرعة ومتوسط اتجاه الحركة لكل خلية.

تعد حركة الخلايا الجماعية أمرا بالغ الأهمية للانتقال الظهاري الوسيط في كل من التطور وفي ورم خبيثالسرطاني 3. تحقق الخلايا الحركة من خلال تنسيق الالتصاق والاستقطاب والنتوء والتراجع4. تعتمد هذه العمليات بشكل كبير على التنظيم المنسق للهيكل الخلوي الديناميكي للأكتين. يؤدي تنشيط Rac1 GTPase في اتجاه مجرى PI3K أو مستقبلات التيروزين كينازات المختلفة إلى استقطاب الخلية ، مما يؤدي إلى بلمرة الأكتين5. يتم تنظيم ديناميكيات الهيكل الخلوي للأكتين بواسطة هذا المحرك وغيره من GTPases بوساطة Rho ، والتي يتم تنشيطها بواسطة عوامل النمو المختلفة. ثم تقوم GTPases بوساطة Rho بتنشيط مركب Arp2 / 3 الذي يحفز تفرع الأكتين6. ترتبط ديناميكيات الهيكل الخلوي للأكتين ارتباطا وثيقا بمنظم رئيسي آخر للحركة: الوصلات بين الخلايا. نحن مهتمون بشكل خاص بكيفية تنسيق تقاطعات الالتصاقات ، التي تشكل التصاقات قوية بين الخلايا ، مع الهيكل الخلوي للأكتين للحفاظ على سلامةالأنسجة 7.

لقد أظهرنا سابقا أن الخلايا الكيراتينية HaCaT التي تعبر عن ضربة قاضية بوساطة α-catenin بوساطة shRNA تظهر معدلات حركة أعلى من تلك التي تعبر عن تحكم shRNA غيرالمستهدف 8. نرغب في استخدام أدوات تحليل الحركة التي طورناها لفهم آلية هذه الحركة المرتفعة عند استنفاد α-catenin. α-Catenin هو مكون العصاري الخلوي المطلوب لتقاطعات الالتصاق9. يشارك في تقاطعات الالتصاق من خلال تفاعله مع ß-catenin ، الذي يربطه كمونومر10،11. ومع ذلك ، يمكن أن ينفصل α-catenin أيضا عن تقاطعات الالتصاق لتشكيل متجانس يربط ويحزم خيوط الأكتين ، مما يمنع نشاط Arp2 / 310،11. في حين أن α-catenin لا يتفاعل بشكل مباشر مع الأكتين بينما يرتبط ب ß-catenin ، إلا أنه قد يسر أو يعزز التنسيق بين تقاطعات الملتصقات والهيكل الخلوي من خلال الارتباط بالفينكولين ، الذي يعمل على استقرار خيوط الأكتين12.

في حين أن المكون الإضافي TrackMate ل ImageJ هو طريقة راسخة لتتبع الجسيمات التي يمكن استخدامها لتتبع نوى الخلايا ، وجدنا أن الأدوات المتاحة لتحليل وتحليل وتوحيد مخرجات TrackMate لحساب حركة الخلية لمواقع تصوير متعددة لم تكن متكاملة وكان من الصعب استخدامها لأولئك الذين ليس لديهم خبرة في لغات برمجة متعددة. يقدم Tinevez و Herbert كتابا تمهيديا حول استخدام TrackMate ، لكن قسم تحليل الإزاحة المتوسطة المربعة يتطلب مهارة MATLABكبيرة 13. تقدم الطرق الحالية لاستخراج معدلات الحركة من مقاطع فيديو الفحص المجهري بفاصل زمني تحليلات ثلاثية الأبعاد أكثر تعقيدا ولكنها تتطلب المزيد من الخبرة في البرمجة14،15. يقيس Pathfinder ، وهو برنامج تتبع الخلايا وتحليل الحركة تم تطويره سابقا في مختبرنا ، سرعة ترحيل الخلايا واتجاهها ولكنه قابل للتنفيذ فقط على أجهزة Windows ويتطلب بيئة Java Runtime16 محدودة. نظرا لأن TrackMate هي أداة موثوقة وموثقة جيدا ، فقد طورنا طريقة مباشرة لإنشاء مجموعات بيانات TrackMate كبيرة ثنائية الأبعاد وتحليلها وتنظيمها باستخدام MATLAB. يزيل البرنامج النصي الخاص بنا أيضا نقاط البيانات الصحيحة المتكررة التي تحدث أحيانا في مخرجات TrackMate بعد عبور خلية متعقبة من موقع التصوير ، مما يسمح بإدراج الخلايا ذات الحركة العالية و / أو الاتجاه في التحليل دون تضمين نقاط البيانات الزائفة هذه. نقدم أيضا برنامجا نصيا لإعادة تنظيم الصور التي تم جمعها على ImageXpress Micro XL في مكدسات TIFF التي يمكن تحليلها بشكل مجمع باستخدام TrackMate.

في هذا البروتوكول ، يتم زرع الخلايا في لوحة تصوير مكونة من 96 بئرا. بعد إتاحة الوقت الكافي للخلايا للالتصاق بالجزء السفلي من اللوحة ، نعالجها بصبغة Hoechst النووية وأي جزيئات صغيرة تكون آثارها على الحركة ذات أهمية. نقوم بجمع صور نوى الخلية على مدار خمس ساعات أو أكثر ، وبعد ذلك تتم معالجة تسلسلات الصور في مكدسات TIFF مطروحة في الخلفية باستخدام MATLAB. يتم تحليل مكدسات TIFF هذه باستخدام المكون الإضافي ImageJ TrackMate ، الذي يسجل ويتتبع كل خلية فردية عبر النقاط الزمنية17. بعد أن نقوم بإنشاء مسارات الخلايا لجميع مواقع التصوير ، نستخدم نصا برمجيا مخصصا ل MATLAB لإزالة نقاط البيانات الزائفة التي تحدث بعد مغادرة الخلايا لحقل التصوير وحساب متوسط معدلات الحركة لكل موقع تصوير. يحلل البرنامج النصي فقط الخلايا التي يتم تعقبها للحد الأدنى لعدد النقاط الزمنية المحدد من قبل المستخدم ويسمح للمستخدم بتصفية الخلايا حسب المسافة الإجمالية و/أو الاتجاه الذي تم قطعه. والنتيجة هي متوسط الإزاحة ، ومتوسط اتجاه السفر ، والإزاحة الكلية ، والاتجاه العام للسفر لكل خلية ، والتي تستخدم لحساب المتوسطات المجمعة لتلك القيم لجميع الخلايا في موقع التصوير. يمكن تنفيذ هذا البروتوكول بكميات كبيرة في تجارب التصوير الكبيرة ، مما يفسح المجال لتحليل الحركة عالي الإنتاجية نسبيا (الشكل 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. زراعة الخلايا وإعداد لوحة التصوير

  1. زراعة خلايا HaCaT في وسط زراعة الخلايا (وسط النسر المعدل من Dulbecco مكمل ب 2 ملي مولار L-glutamine ، و 100 U / مل بنسلين / ستربتومايسين ، و 10٪ (v / v) مصل بقري للجنين) عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة مرطبة.
  2. البذور العدد المطلوب من الخلايا لكل بئر (نستخدم 5000 - 20,000 خلية / بئر) في لوحة تصوير 96 بئرا ، مثل صفيحة البوليسترين السوداء المكونة من 96 بئرا. إلى ثلاثة آبار ، أضف متوسطا فقط (بدون خلايا).
  3. ضع اللوحة على سطح مستو تماما لمدة 20-30 دقيقة حتى تتمكن الخلايا من التصاق بقاع اللوحة مع توزيع مكاني متساو.
  4. نقل اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا المرطبة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون) لمدة 4-6 ساعات للسماح للخلايا بالالتصاق تماما بقاع اللوحة.
  5. قم بإزالة الوسط من اللوحة واستبدله بوسط زراعة الخلايا بصبغة Hoechst 2 ميكروغرام / مل (تخفيف 1: 5000 من محلول مخزون 1 مجم / مل).
  6. إعادة اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا المرطبة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون) لمدة 2 ساعة.
  7. اغسل الطبق برفق ثلاث مرات ب 100 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات لكل بئر قبل إضافة 90 ميكرولتر من وسط التصوير (وسط النسر المعدل من Dulbecco الخالي من الفينول مع 2 ملي مولار من الجلوتامين ، و 100 U / مل بنسلين / ستربتومايسين ، و 10٪ (v / v) مصل بقري جنيني) لكل بئر.
  8. في حالة قياس تأثيرات مثبطات الجزيئات الصغيرة أو غيرها من المؤثرات ، عالج الخلايا مباشرة قبل التصوير.

2. التصوير

  1. قم بتصوير اللوحة (بما في ذلك الآبار المخصصة للوسائط فقط) بتكبير 10 أضعاف في مجهر مع غرفة بيئية مرطبة عند 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون 5٪.
    ملاحظة: تتم كتابة البرامج النصية للتحليل في هذا البروتوكول للبيانات التي تم جمعها على مجهر واسع المجال ImageXpress Micro XL للأجهزة الجزيئية.
  2. اجمع الصور وفقا للدقة الزمنية التي تتطلبها التجربة. للحصول على أفضل النتائج ، سجل 4 نقاط زمنية على الأقل في الساعة لمدة 5 ساعات على الأقل. في حالة قياس تأثيرات مثبطات الجزيئات الصغيرة أو الاضطرابات الأخرى على الخلايا ، قم بالتصوير لمدة 5 ساعات على الأقل بعد الوقت المتوقع لرؤية التأثير. لأغراضنا ، نقوم بالتصوير لمدة 100 نقطة زمنية مدتها 8 دقائق لوقت تصوير إجمالي يبلغ 13 ساعة و 20 دقيقة.

3. معالجة الصور

  1. استخدم البرنامج النصي المخصص ل MATLAB "ImageReorganizer.m" لإزالة الصور المصغرة وإعادة تنظيم ملفات الصور بشكل جيد بدلا من النقطة الزمنية. يقوم ImageXpress بإخراج الملفات في تنظيم المجلدات هذا: "[اسم التجربة] > [YYYY-MM-DD] > [رقم التشغيل] > Timepoint_[Timepoint] > [ملفات الصور]." بمجرد إعادة تنظيم الصور ، يقوم هذا البرنامج النصي بطرح الخلفية على الصور من كل نقطة زمنية باستخدام الصور المتوسطة والضبابية الغوسية لآبار الوسائط فقط من تلك النقطة الزمنية. يقوم هذا البرنامج النصي بعد ذلك بتنظيم الصور المطروحة من الخلفية في مكدس TIFF لكل موقع تصوير. يتم تسمية كل مكدس TIFF باسم "[Well]_[Site].tif".
    1. إذا امتدت التجربة لأكثر من يوم واحد، فقم بدمج محتويات مجلدات [تشغيل الرقم] لجميع الأيام بحيث تكون جميع المجلدات الفرعية "Timepoint_[النقطة الزمنية]" في نفس المجلد "[تشغيل الرقم]".
    2. لاحظ أن هذا البرنامج النصي يتطلب الدالة MATLAB int2strz18. أدخل المسار المحلي إلى هذه الدالة بعد "addpath" في السطر 2.
    3. أدخل صفوف الآبار المخصصة للوسائط فقط ك "فارغة" في السطر 9 والأعمدة ك "أعمدة فارغة" في السطر 10.
    4. أدخل صفوف الآبار التجريبية ك "صفوف" على السطر 15 والأعمدة ك "أعمدة" في السطر 16. أدخل عدد مواقع التصوير لكل بئر بالإضافة إلى "المواقع" في السطر 17.
    5. أدخل اسم المسار للمجلد "[تشغيل الرقم]" في شريط المسار في MATLAB وقم بتشغيل البرنامج النصي.

4. تتبع الخلية

ملاحظة: يمكن تشغيل TrackMate على جميع مكدسات TIFF في دليل معين باستخدام إصدار معدل قليلا من البرنامج النصي Run_TrackMate_Headless.groovy من Tinevez et al.17 أو يمكن تنفيذه يدويا لكل مكدس TIFF فردي. نقوم بتشغيل FIJI يدويا على عدد قليل من مجموعات TIFF النموذجية للتأكد من أننا نستخدم المعلمات الصحيحة قبل تشغيل البرنامج النصي Groovy على جميع مكدسات TIFF باستخدام هذه المعلمات.

  1. لتشغيل المكون الإضافي TrackMate في FIJI لجميع مكدسات TIFF في مجلد ، قم بتنزيل واستخدام البرنامج النصي Run_TrackMate_Headless.groovy من Tinevez et al.17 وفقا للبروتوكول المقدم الخاص بهم. نستخدم نسخة معدلة قليلا من هذا البرنامج النصي ، والتي تسمح لنا بسهولة بتجميع كل من ملفات الإدخال وأسماء ملفات الإخراج وإدخال جميع المعلمات باستخدام واجهة مستخدم رسومية واحدة للإدخال. فيما يلي إرشادات مفصلة لاستخدام هذا البرنامج النصي المعدل ، والذي يتم توفيره هنا باسم TrackMate_Headless_Mod.groovy.
    1. افتح البرنامج النصي في FIJI عن طريق تحديد File>Open ثم الانتقال إلى موقع البرنامج النصي TrackMate_Headless_Mod.groovy.
    2. حدد تشغيل.
    3. أدخل الدليل الذي توجد فيه مكدسات TIFF (يجب أن يكون الإخراج الافتراضي من "StackGenerator.m" هو "[اسم التجربة] > [YYYY-MM-DD] >> مكدسات") ك "دليل الإدخال".
    4. قم بإنشاء دليل إخراج وأدخل اسم مساره ك "دليل الإخراج". الإعداد الافتراضي ل "يجب أن يكون امتداد الملف" .tif ؛ إذا لم يكن كذلك ، أدخل ".tif" ك "امتداد الملف".
    5. لتشغيل TrackMate فقط على مجموعة فرعية من الملفات في الدليل ، استخدم مساحة الإدخال بعد "يحتوي اسم الملف" لتضمينها. خلاف ذلك ، اترك هذه المساحة فارغة.
    6. حدد "الاحتفاظ ببنية الدليل عند الحفظ".
    7. أدخل "نصف قطر البقعة" و "حد الجودة" و "الحد الأقصى لفجوة الإطار" و "ربط المسافة القصوى" و "المسافة القصوى لإغلاق الفجوة" بالبكسل وفقا للإعدادات التي تريدها. نستخدم عادة 3.5 و 18 و 2 و 15 و 40 ، على التوالي ، لنوى HaCaT بتكبير 10x.
    8. حدد موافق. يجب أن يقوم هذا البرنامج النصي بإخراج ملف XML لكل مكدس TIFF في دليل الإخراج المعين.
  2. بدلا من ذلك ، قم بتشغيل المكون الإضافي TrackMate في FIJI يدويا لكل مكدس TIFF وفقا للبروتوكول الموضح في Tinevez et al.13
    1. افتح مكدس TIFF في FIJI وافتح المكون الإضافي TrackMate عن طريق تحديد المكونات الإضافية >Tracking > TrackMate في شريط القائمة.
    2. إذا عرضت نافذة منبثقة المطالبة "يبدو أن هذه الصورة تحتوي على 1 نقطة زمنية ولكن [عدد النقاط الزمنية] شرائح. هل تريد تبديل Z وT؟" حدد نعم.
    3. في TrackMate v4.0.1 ، استخدم الإعدادات الافتراضية باستثناء "قطر النقطة المقدر" (نستخدم 7.000 بكسل لنوى HaCaT عند تكبير 10x) والعتبة (نستخدم 18.000 ، ولكن هذا سيختلف بناء على المجهر المستخدم وشدة صبغة Hoechst).
    4. استخدم وظيفة المعاينة لضمان الكشف المحسن عن الجسيمات وضبط قطر الكائن الثنائي كبير الحجم وإعدادات العتبة حسب الضرورة.
    5. بالنسبة إلى "المسافة القصوى لإغلاق الفجوة" ، غالبا ما تعمل الإعدادات الافتراضية لحركة HaCaT القاعدية ، ولكن قد يلزم زيادة المسافة القصوى لإغلاق الفجوة إلى ما يصل إلى 40.0 بكسل في ظل الظروف التي تعزز الحركة.
    6. تأكد بصريا من أن التتبع محسن مع الحد الأدنى من الفجوات في آثار الخلايا.
    7. ضمن تحديد إجراء [كذا]، اختر تصدير المسارات إلى ملف XML وتنفيذه.
    8. كرر ذلك مع جميع حزم TIFF.

5. القياس الكمي لمعدلات الحركة

ملاحظة: استخدم البرنامج النصي المخصص ل MATLAB "TrackMateAnalysis.m" المقدم لإزالة التتبعات الفاشلة وتحديد الحركة لجميع ملفات إخراج TrackMate. يزيل البرنامج النصي المسارات التي تتحرك خارج الإطار (التي يتتبع موقعها افتراضيا إلى الأعداد الصحيحة) والمسارات التي يتم تعقبها لأقل من عدد محدد من النقاط الزمنية. يزيل البرنامج النصي المسارات التي تتحرك خارج الإطار (التي يتتبع موقعها افتراضيا إلى الأعداد الصحيحة) والمسارات التي يتم تعقبها لأقل من عدد قابل للتصميم من النقاط الزمنية. الناتج هو متوسط الإزاحة لكل نقطة زمنية للخلايا الفردية وجميع الخلايا في موقع التصوير. (مثال على الإخراج: "Output.mat")

  1. لاحظ أن هذا البرنامج النصي يتطلب دالة MATLAB المتوفرة "import_trackmate_xml.m." أدخل المسار المحلي لهذه الوظيفة بعد "addpath" في السطر 4.
  2. في السطر 7 ، حدد الحد الأدنى لعدد النقاط الزمنية التي يجب تتبع الجسيم ليتم تضمينها في الإخراج الموحد.
  3. في السطرين 12 و 13 ، حدد نطاق المسافات المقطوعة (بالبكسل) التي يجب تضمينها في التحليل الذي تمت تصفيته. لتضمين جميع المسافات الممكنة المقطوعة، أدخل نطاقا من 0 إلى عرض مجال التصوير.
  4. في الخطين 14 و 15 ، حدد نطاق المسارات (بالدرجات) التي يجب تضمينها في التحليل المصفى. لتضمين جميع المسارات الممكنة ، أدخل نطاقا من 0 إلى 360.
  5. قم بتشغيل البرنامج النصي في المجلد الذي يحتوي على جميع ملفات XML لإخراج TrackMate.
    ملاحظة: يقوم البرنامج النصي بإنشاء بنية خلية MATLAB وحفظها تحتوي على جميع البيانات التي تم إنشاؤها في هذا التحليل. تسرد الجداول{1,:} أسماء ملفات XML لإخراج Trackmate لكل موقع تصوير تم تحليله بواسطة هذا البرنامج النصي. الجداول {2،:} عبارة عن بنية تحتية تحتوي على المواضع (البكسل) والإزاحة (البكسل) وزوايا السفر (الدرجات ، مع 0 درجة تشير إلى اتجاه الانتقال إلى اليمين داخل موقع التصوير) لجميع الخلايا المفردة في كل نقطة زمنية. كما يحتوي على إجمالي المسافة المقطوعة (بكسل) ، ومتوسط الحركة (بكسل / نقطة زمنية) ، ومتوسط زاوية السفر (درجات) لكل خلية عبر جميع النقاط الزمنية ، بالإضافة إلى زاوية السفر الإجمالية بين النقطة الزمنية الأولى والأخيرة لكل خلية. يحتوي الصفان3 و 4 من الجداول على التوالي على قيم متوسط وانحراف معياري (بكسل / نقطة زمنية) لجميع الخلايا عبر جميع النقاط الزمنية في كل موقع تصوير. يحتويالصفان 5 و 6 على التوالي على قيم المتوسط والانحراف المعياري لإجمالي المسافة المقطوعة (البكسل) بواسطة جميع الخلايا عبر جميع النقاط الزمنية في كل موقع تصوير. يحتويالصفان 7 و 8 على قيم المتوسط والانحراف المعياري لزاوية السفر الإجمالية (الدرجات) بين النقطتين الزمنية الأولى والأخيرة لجميع الخلايا في موقع التصوير. في حين أن الصفوف من 3 إلى 8 من الجداول تحتوي على هذه القيم لكافة الخلايا التي تفي بالحد الأدنى من معايير تعقب النقاط الزمنية، تحتوي الصفوف من 9 إلى 14 على نفس القيم ولكن فقط للخلايا التي تفي بمعايير التصفية التي أشار إليها المستخدم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

للتأكد من أن نص التحليل الخاص بنا كان موثوقا ومتسقا ، قمنا بقياس حركة الخلايا الكيراتينية HaCaT في ثلاث تجارب مستقلة. وجدنا أنه في حين أن الانحراف المعياري لحركة الخلية كان متغيرا بين التجارب (ربما بسبب حساسية خلايا HaCaT للالتقاء والمحفزات الميكانيكية) ، فقد تم تكرار متوسط ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

توفر المنهجية وأدوات التحليل الموضحة أعلاه وسيلة مباشرة وقابلة للتطوير لقياس وقياس حركة الخلايا الكيراتينية HaCaT التي تستخدم MATLAB وتتطلب الحد الأدنى من الخبرة في البرمجة. يدعو هذا البروتوكول إلى تلطيخ نوى الخلايا وتصويرها على مدار 5 ساعات على الأقل. بينما يمكن إجراء جمع ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

لدى XL وجامعة كولورادو بولدر مصلحة مالية في تطوير مثبطات HDAC للعلاجات والأسهم الخاصة في OnKure. XL هو مؤسس مشارك وعضو في مجلس إدارة OnKure ، التي رخصت مثبطات HDAC الخاصة من جامعة كولورادو بولدر. لا تشارك OnKure في التصميم التجريبي أو تمويل هذه الدراسة.

Acknowledgements

نشكر دانيال ماسنجر ولويس بيكر ودوغلاس تشابنيك وأدريان راميريز وكوانبين شو وأعضاء آخرين في مختبرات ليو وبورتز على رؤيتهم ونصائحهم. نشكر Jian Tay على مشاركة خبرته في MATLAB وعلى كتابة وظيفة استيراد XML. نشكر جوزيف دراجافون من BioFrontiers Advanced Light Microscopy Core على دعمه المجهري والتصوير. نشكر تيريزا ناهريني ونيكول كيثلي من مرفق زراعة الخلايا الأساسي على دعمهما لزراعة الخلايا. تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعهد الوطني للسرطان والمعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض العضلات والعظام والجلد التابع للمعاهد الوطنية للصحة (R01AR068254) إلى XL والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS) R01GM126559 إلى DB و X. L. G.E.W. و E.N.B. تم دعمها بمنحة تدريب ما قبل الدكتوراه من NIGMS (T32GM08759). تم دعم ImageXpress Micro XL من قبل المركز الوطني لموارد البحث (S10 RR026680). تم دعم FACSAria من قبل المعاهد الوطنية للصحة (S10OD021601).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat clear bottom black polystyrine TC-treated microplates, individually wrapped, with lid, sterileCorning3603
Dulbecco's modified eagle medium (high D-glucose)Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific12800-082
Fetal bovine serumSigma-Aldrich IncF0926
Fluorobrite Dulbecco's modified eagle medium (high D-glucose, 3.7 g/L sodium bicarbonate, no L-glutamine, no phenol red)Gibco/Thermo Fisher ScientificA18967-01
GlutaminePlusR&D Systems Inc.R90210
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrateInvitrogen/Thermo Fisher ScientificH21492
Penicillin streptomycinLife Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate buffered salineGibco/Thermo Fisher Scientific14190-144

References

  1. Li, L., He, Y., Zhao, M., Jiang, J. Collective cell migration: Implications for wound healing and cancer invasion. Burns & Trauma. 1 (1), 21-26 (2015).
  2. Stuelten, C. H., Parent, C. A., Montell, D. J. Cell motility in cancer invasion and metastasis: insights from simple model organisms. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 296-312 (2018).
  3. Campbell, K., et al. Collective cell migration and metastases induced by an epithelial-to-mesenchymal transition in Drosophilaintestinal tumors. Nature Communications. 10 (1), 1-10 (2019).
  4. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling networks that regulate cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  5. Parri, M., Chiarugi, P. Rac and Rho GTPases in cancer cell motility control. Cell Communication and Signaling. 8 (1), 23(2010).
  6. Sumida, G. M., Yamada, S. Rho GTPases and the downstream effectors actin- related protein 2/3 (Arp2/3) complex and myosin II induce membrane fusion at self-contacts. The Journal of Biological Chemistry. 290 (6), 3238-3247 (2015).
  7. Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell., 4th edition. , (2002).
  8. Bunker, E. N., Wheeler, G. E., Chapnick, D. A., Liu, X. Suppression of α-catenin and adherens junctions enhances epithelial cell proliferation and motility via TACE- mediated TGF-α autocrine/paracrine signaling. Molecular Biology of the Cell. 32 (4), 348-361 (2021).
  9. Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2525-2532 (2007).
  10. Drees, F., Pokutta, S., Yamada, S., Nelson, W. J., Weis, W. I. α-Catenin is a molecular switch that binds E-cadherin-β-catenin and regulates actin-filament assembly. Cell. 123 (5), 903-915 (2005).
  11. Yamada, S., Pokutta, S., Drees, F., Weis, W. I., Nelson, W. J. Deconstructing the cadherin-catenin-actin complex. Cell. 123 (5), 889-901 (2005).
  12. Rangarajan, E., Izard, T. The cytoskeletal protein α-catenin unfurls upon binding to vinculin. The Journal of Biological Chemistry. 287 (22), 18492-18499 (2012).
  13. Tinevez, J. -Y., Herbert, S. The NEMO dots assembly: single-particle tracking and analysis. Bioimage Data Analysis Workflows. , 67-97 (2020).
  14. Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
  15. Wu, P. -H., Giri, A., Wirtz, D. Statistical analysis of cell migration in 3D using the anisotropic persistent random walk model. Nature Protocols. 10, 517-527 (2015).
  16. Chapnick, D. A., Jacobsen, J., Liu, X. The development of a novel high throughput computational tool for studying individual and collective cellular migration. PloSOne. 8 (12), 82444(2013).
  17. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  18. Vargas Aguilera, C. A. int2strz.m. MATLAB Commons. , (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

TrackMate HaCaT MATLAB ImageJ TrackMate Actin Arp2 3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved