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Resumo

Este protocolo para medição de alto rendimento da motilidade celular em queratinócitos HaCaT descreve métodos para coletar e processar imagens de núcleos celulares e realizar rastreamento de partículas usando o plug-in TrackMate do ImageJ.

Resumo

A migração celular coletiva desempenha um papel fundamental em muitos processos biológicos fundamentais, incluindo desenvolvimento, cicatrização de feridas e metástase do câncer. Para entender a regulação da motilidade celular, devemos ser capazes de medi-la de forma fácil e consistente em diferentes condições. Aqui descrevemos um método para medir e quantificar a motilidade unicelular e em massa de queratinócitos HaCaT usando uma coloração nuclear. Este método inclui um script MATLAB para analisar arquivos de saída do TrackMate para calcular deslocamentos, taxas de motilidade e ângulos de trajetória em células únicas e em massa para um local de imagem. Este script de análise de motilidade permite uma análise rápida, direta e escalável das taxas de motilidade celular a partir de dados do TrackMate e pode ser amplamente usado para identificar e estudar a regulação da motilidade em células epiteliais. Também fornecemos um script MATLAB para reorganizar vídeos de microscopia coletados em um microscópio e convertê-los em pilhas TIF, que podem ser analisadas usando o plug-in ImageJ TrackMate em massa. Usando esta metodologia para explorar os papéis das junções aderentes e da dinâmica do citoesqueleto de actina na regulação da motilidade celular em queratinócitos HaCaT, demonstramos evidências de que a atividade de Arp2/3 é necessária para a motilidade elevada observada após a depleção de α-catenina em queratinócitos HaCaT.

Introdução

A regulação precisa e responsiva da motilidade celular nas células epiteliais é crucial para a cicatrização de feridas e para o reabastecimento da camada epitelial. A falha em manter a motilidade pode levar a problemas com o desenvolvimento embrionário e a cicatrização de feridas1 e a sinalização de motilidade hiperativa é um dos principais contribuintes para a metástase do câncer2.

Compreender o controle celular da motilidade em queratinócitos HaCaT oferece informações importantes sobre esses processos. Os procedimentos descritos aqui fornecem medições e cálculos consistentes da magnitude média da motilidade celular em um único nível de célula ou população. Usamos este método para medir a motilidade em queratinócitos HaCaT após perturbação genética ou tratamento com inibidores de pequenas moléculas para entender a sinalização celular que controla as taxas de motilidade. O script MATLAB fornecido mede a velocidade média e a direção média da motilidade de cada célula.

A motilidade celular coletiva é crucial para a transição epitelial-mesenquimal tanto no desenvolvimento quanto na metástase do câncer3. As células atingem a motilidade por meio da coordenação de adesão, polarização, protrusão e retração4. Esses processos dependem fortemente da regulação coordenada do citoesqueleto dinâmico de actina. A ativação da Rac1 GTPase a jusante de PI3K ou de vários receptores tirosina quinases polariza a célula, resultando na polimerização da actina5. A dinâmica do citoesqueleto da actina é regulada por esta e outras GTPases mediadas por Rho, que são ativadas a jusante de vários fatores de crescimento. Essas GTPases mediadas por Rho ativam o complexo Arp2 / 3 que estimula a ramificação da actina6. Essa dinâmica do citoesqueleto de actina está intimamente relacionada a outro regulador chave da motilidade: as junções intercelulares. Estamos particularmente interessados em como as junções aderentes, que formam fortes aderências entre as células, se coordenam com o citoesqueleto de actina para manter a integridade do tecido7.

Mostramos anteriormente que os queratinócitos HaCaT que expressam um knockdown de α-catenina mediado por shRNA demonstram taxas de motilidade mais altas do que aqueles que expressam um controle de shRNA não direcionado8. Desejamos usar as ferramentas de análise de motilidade que desenvolvemos para entender melhor o mecanismo dessa motilidade elevada após a depleção de α-catenina. α-Catenina é um componente citosólico necessário das junções aderentes9. Participa das junções aderentes por meio de sua interação com a ß-catenina, à qual se liga como monômero10,11. No entanto, a α-catenina também pode se dissociar das junções aderentes para formar um homodímero que se liga e agrupa os filamentos de actina, o que inibe a atividade de Arp2/310,11. Embora a α-catenina não interaja diretamente com a actina enquanto está ligada à ß-catenina, ela ainda pode facilitar ou fortalecer a coordenação entre as junções aderentes e o citoesqueleto por meio da ligação à vinculina, que estabiliza os filamentos de actina12.

Embora o plug-in TrackMate para ImageJ seja um método bem estabelecido para rastreamento de partículas que pode ser usado para rastrear núcleos celulares, descobrimos que as ferramentas disponíveis para analisar, analisar e consolidar as saídas do TrackMate para calcular a motilidade celular para vários locais de imagem não eram integradas e eram difíceis de usar para aqueles sem experiência em várias linguagens de programação. Tinevez e Herbert oferecem uma cartilha sobre o uso do TrackMate, mas a seção de análise de deslocamento quadrado médio requer considerável habilidade MATLAB13. Os métodos existentes para extrair taxas de motilidade de vídeos de microscopia de lapso de tempo oferecem análises tridimensionais mais complexas, mas requerem mais experiência em programação14,15. O Pathfinder, um software de rastreamento de células e análise de motilidade desenvolvido anteriormente em nosso laboratório, mede a velocidade e a direção da migração de células, mas só pode ser executado em máquinas Windows e requer um ambiente Java Runtime limitador16. Como o TrackMate é uma ferramenta tão confiável e bem documentada, desenvolvemos um método simples para gerar, analisar e organizar grandes conjuntos de dados bidimensionais do TrackMate usando o MATLAB. Nosso script também remove os pontos de dados inteiros repetidos que às vezes ocorrem nas saídas do TrackMate depois que uma célula rastreada sai do local da imagem, permitindo a inclusão de células com alta motilidade e/ou direcionalidade na análise sem a inclusão desses pontos de dados espúrios. Também fornecemos um script para reorganizar imagens coletadas em um ImageXpress Micro XL em pilhas TIFF que podem ser analisadas em massa usando o TrackMate.

Neste protocolo, as células são semeadas em uma placa de imagem de 96 poços. Depois de dar tempo suficiente para que as células adiram ao fundo da placa, nós as tratamos com coloração nuclear de Hoechst e quaisquer pequenas moléculas cujos efeitos na motilidade sejam de interesse. Coletamos imagens dos núcleos das células ao longo de cinco ou mais horas, após as quais as sequências de imagens são processadas em pilhas TIFF subtraídas em segundo plano usando MATLAB. Essas pilhas TIFF são analisadas usando o plug-in ImageJ TrackMate, que registra e rastreia cada célula individual nos pontos de tempo17. Depois de gerarmos rastros de células para todos os locais de imagem, usamos um script MATLAB personalizado para remover pontos de dados espúrios que ocorrem depois que as células saem do campo de imagem e calcular as taxas médias de motilidade para cada local de imagem. O script analisa apenas as células que são rastreadas para um número mínimo de pontos de tempo especificado pelo usuário e permite que o usuário filtre as células por distância geral e/ou direção percorrida. O resultado é o deslocamento médio, a direção média de deslocamento, o deslocamento geral e a direção geral de deslocamento de cada célula, que são usados para calcular as médias em massa desses valores para todas as células em um local de imagem. Este protocolo pode ser realizado em massa em grandes experimentos de imagem, o que se presta a uma análise de motilidade de rendimento relativamente alto (Figura 1).

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Protocolo

1. Cultura celular e preparação da placa de imagem

  1. Cultura de células HaCaT em meio de cultura celular (Dulbecco's Modified Eagle's Medium suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina e 10% (v/v) de soro fetal bovino) a 37 °C e 5% de dióxido de carbono em uma incubadora umidificada.
  2. Semeie o número desejado de células por poço (usamos 5000 - 20.000 células/poço) em uma placa de imagem de 96 poços, como uma microplaca de poliestireno preto de 96 poços. Para três poços, adicione apenas meio (sem células).
  3. Descanse a placa em uma superfície completamente plana por 20 a 30 minutos para que as células possam se prender ao fundo da placa com distribuição espacial uniforme.
  4. Transfira a placa para uma incubadora de cultura de células umidificada (37 °C, 5% de dióxido de carbono) por 4-6 h para permitir que as células adiram completamente ao fundo da placa.
  5. Remover o meio da placa e substituir por meio de cultura celular com 2 μg/ml de corante Hoechst (uma diluição de 1:5000 de 1 mg/ml de solução-mãe).
  6. Retorne a placa para a incubadora de cultura de células umidificada (37 °C, 5% de dióxido de carbono) por 2 h.
  7. Lave suavemente a placa três vezes com 100 μL de solução salina tamponada com fosfato por poço antes de adicionar 90 μL de meio de imagem (meio de Eagle modificado de Dulbecco sem vermelho de fenol suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 U / mL de penicilina / estreptomicina e 10% (v / v) de soro fetal bovino) a cada poço.
  8. Se medir os efeitos de inibidores de moléculas pequenas ou outros efetores, trate as células imediatamente antes de fazer a imagem.

2. Exames de imagem

  1. Visualize a placa (incluindo poços somente de mídia) com ampliação de 10x em um microscópio com uma câmara ambiental umidificada a 37 °C e 5% de dióxido de carbono.
    NOTA: Os scripts de análise neste protocolo são escritos para dados coletados em um microscópio de campo amplo ImageXpress Micro XL da Molecular Devices.
  2. Colete imagens de acordo com a resolução temporal que o experimento requer. Para obter melhores resultados, registre pelo menos 4 pontos de tempo por hora por pelo menos 5 h. Se medir os efeitos de inibidores de pequenas moléculas ou outras perturbações nas células, obtenha imagens por pelo menos 5 h após o tempo esperado para ver um efeito. Para nossos propósitos, criamos imagens para 100 pontos de tempo de 8 minutos para um tempo total de imagem de 13 h 20 min.

3. Processamento de imagem

  1. Use o script MATLAB personalizado fornecido "ImageReorganizer.m" para remover imagens em miniatura e reorganizar os arquivos de imagem por poço em vez de ponto de tempo. O ImageXpress gera arquivos nesta organização de pastas: "[Nome do experimento] > [AAAA-MM-DD] > [Número da execução] > Timepoint_[Ponto de tempo] > [Arquivos de imagem]." Depois que as imagens forem reorganizadas, esse script executará a subtração do plano de fundo nas imagens de cada ponto de tempo usando as imagens desfocadas médias e gaussianas dos poços somente de mídia desse ponto de tempo. Esse script organiza as imagens subtraídas em segundo plano em uma pilha TIFF para cada local de imagem. Cada pilha TIFF é nomeada como "[Well]_[Site].tif".
    1. Se o experimento se estendeu por mais de um dia, combine o conteúdo das pastas [Número da execução] para todos os dias para que todas as subpastas "Timepoint_[Ponto de tempo]" estejam na mesma pasta "[Número da execução]".
    2. Observe que este script requer a função MATLAB int2strz18. Insira o caminho local para esta função após "addpath" na linha 2.
    3. Insira as linhas para poços somente de mídia como "linhas vazias" na linha 9 e as colunas como "colunas vazias" na linha 10.
    4. Insira as linhas para poços experimentais como "linhas" na linha 15 e as colunas como "colunas" na linha 16. Insira o número de locais de imagem por poço e "locais" na linha 17.
    5. Insira o nome do caminho para a pasta "[Run number]" na barra de caminho do MATLAB e execute o script.

4. Rastreamento de celular

NOTA: O TrackMate pode ser executado em todas as pilhas TIFF em um diretório designado usando uma versão ligeiramente modificada do script Run_TrackMate_Headless.groovy de Tinevez et al.17 ou pode ser executado manualmente para cada pilha TIFF individual. Executamos o FIJI manualmente em algumas pilhas TIFF de amostra para garantir que estamos usando os parâmetros corretos antes de executar o script Groovy em todas as pilhas TIFF usando esses parâmetros.

  1. Para executar o plug-in TrackMate em FIJI para todas as pilhas TIFF em uma pasta, baixe e use o script Run_TrackMate_Headless.groovy de Tinevez et al.17 de acordo com o protocolo fornecido. Usamos uma versão ligeiramente modificada deste script, que nos permite agrupar facilmente os arquivos de entrada e os nomes dos arquivos de saída e inserir todos os parâmetros usando uma interface gráfica do usuário para entrada. Abaixo estão as instruções detalhadas para usar este script modificado, que é fornecido aqui como TrackMate_Headless_Mod.groovy.
    1. Abra o script em FIJI selecionando File>Open e navegando até o local do script TrackMate_Headless_Mod.groovy.
    2. Selecione Executar.
    3. Insira o diretório no qual as pilhas TIFF estão localizadas (a saída padrão de "StackGenerator.m" deve ser "[Nome do experimento] > [AAAA-MM-DD] >> pilhas") como "Diretório de entrada".
    4. Crie um diretório de saída e insira seu nome de caminho como "Diretório de saída". O padrão para "Extensão de arquivo deve ser ".tif;" caso contrário, insira ".tif" como "Extensão de arquivo".
    5. Para executar o TrackMate apenas em um subconjunto de arquivos no diretório, use o espaço de entrada após "O nome do arquivo contém" para incluí-los. Caso contrário, deixe esse espaço em branco.
    6. Selecione "Manter estrutura de diretórios ao salvar".
    7. Insira "Raio do ponto", "Limite de qualidade", "Espaço máximo do quadro", "Distância máxima de vinculação" e "Distância máxima de fechamento da lacuna" em pixels de acordo com as configurações desejadas. Normalmente usamos 3,5, 18, 2, 15 e 40, respectivamente, para núcleos HaCaT com ampliação de 10x.
    8. Selecione OK. Esse script deve gerar um arquivo XML para cada pilha TIFF no diretório de saída designado.
  2. Como alternativa, execute o plug-in TrackMate em FIJI manualmente para cada pilha TIFF de acordo com o protocolo descrito em Tinevez et al.13
    1. Abra uma pilha TIFF em FIJI e abra o plug-in TrackMate selecionando Plug-ins >Rastreamento > TrackMate na barra de menus.
    2. Se uma janela pop-up exibir o prompt "Parece que esta imagem tem 1 ponto de tempo, mas [número de pontos de tempo] fatias. Deseja trocar Z e T?" selecione Sim.
    3. No TrackMate v4.0.1, use as configurações padrão, exceto para "Diâmetro estimado da bolha" (usamos 7.000 pixels para núcleos HaCaT com ampliação de 10x) e limite (usamos 18.000, mas isso varia de acordo com o microscópio usado e a intensidade do corante Hoechst).
    4. Use a função Visualizar para garantir a detecção otimizada de partículas e ajustar o diâmetro da bolha e as configurações de limite conforme necessário.
    5. Para "Distância máxima de fechamento de lacunas", as configurações padrão geralmente funcionam para motilidade basal de HaCaT, mas a distância máxima de fechamento de lacunas pode precisar ser aumentada para até 40,0 pixels em condições que aumentam a motilidade.
    6. Confirme visualmente se o rastreamento é otimizado com lacunas mínimas nos traços de célula.
    7. Em Select a action [sic], escolha Export tracks to XML file and execute.
    8. Repita para todas as pilhas TIFF.

5. Quantificação das taxas de motilidade

NOTA: Use o script MATLAB personalizado fornecido "TrackMateAnalysis.m" para remover traços com falha e quantificar a motilidade de todos os arquivos de saída do TrackMate. O script remove as trilhas que saem do quadro (cujos rastreamentos de localização são números inteiros por padrão) e as trilhas que são rastreadas por menos do que um número designado de pontos de tempo. O script remove as trilhas que saem do quadro (cujos rastreamentos de localização são números inteiros por padrão) e as trilhas que são rastreadas por menos do que um número projetável de pontos de tempo. A saída é o deslocamento médio por ponto de tempo para células individuais e todas as células em um local de imagem. (Exemplo de saída: 'Output.mat')

  1. Observe que este script requer a função MATLAB fornecida "import_trackmate_xml.m." Insira o caminho local para esta função após "addpath" na linha 4.
  2. Na linha 7, indique o número mínimo de pontos de tempo que uma partícula deve ser rastreada para ser incluída em sua saída consolidada.
  3. Nas linhas 12 e 13, indique o intervalo de distâncias percorridas (em pixels) que deve ser incluído na análise filtrada. Para incluir todas as distâncias percorridas possíveis, insira um intervalo de 0 à largura do seu campo de imagem.
  4. Nas linhas 14 e 15, indique o intervalo de trajetórias (em graus) que deve ser incluído na análise filtrada. Para incluir todas as trajetórias possíveis, insira um intervalo de 0 a 360.
  5. Execute o script na pasta que contém todos os arquivos XML de saída do TrackMate.
    NOTA: O script gera e salva uma estrutura de célula MATLAB contendo todos os dados gerados nesta análise. Tables{1,:} lista os nomes dos arquivos XML de saída do Trackmate para cada local de geração de imagens analisado por este script. Tabelas{2,:} é uma subestrutura que contém as posições (pixels), deslocamentos (pixels) e ângulos de deslocamento (graus, com 0° indicando uma direção de deslocamento para a direita dentro do local de imagem) para todas as células individuais em cada ponto de tempo. Ele também contém a distância total percorrida (pixels), motilidade média (pixels/ponto de tempo), ângulo médio de deslocamento (graus) para cada célula em todos os pontos de tempo, bem como o ângulo total de deslocamento entre o primeiro e o último ponto de tempo para cada célula. A3ª e a4ª linhas das Tabelas, respectivamente, contêm os valores de motilidade média e desvio padrão (pixels/ponto de tempo) para todas as células em todos os pontos de tempo em cada local de imagem. A5ª e a6ª linhas, respectivamente, contêm os valores de média e desvio padrão para a distância total percorrida (pixels) por todas as células em todos os pontos de tempo em cada local de imagem. As7ª e8ª linhas contêm os valores de média e desvio padrão para o ângulo geral de deslocamento (graus) entre o primeiro e o último ponto de tempo para todas as células em um local de imagem. Enquanto as linhas 3 a 8 de Tabelas contêm esses valores para todas as células que atendem aos critérios mínimos de rastreamento de ponto de tempo, as linhas 9 a 14 contêm os mesmos valores, mas apenas para células que atendem aos critérios de filtro indicados pelo usuário.

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Resultados

Para garantir que nosso roteiro de análise fosse confiável e consistente, medimos a motilidade dos queratinócitos HaCaT em três experimentos independentes. Descobrimos que, embora o desvio padrão das motilidades celulares fosse variável entre os experimentos (possivelmente devido à sensibilidade das células HaCaT à confluência e estímulos mecânicos), a motilidade média foi consistentemente replicada em vários experimentos sem diferenças estatisticamente significativas entr...

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Discussão

A metodologia e as ferramentas de análise descritas acima fornecem um meio direto e escalável para medir e quantificar a motilidade dos queratinócitos HaCaT que usam MATLAB e requerem experiência mínima em programação. Este protocolo exige que os núcleos das células sejam corados e fotografados ao longo de pelo menos 5 h. Embora a coleta de dados possa ser realizada em qualquer microscópio adequado, este protocolo fornece um script para processar imagens coletadas em um microsc...

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Divulgações

X.L. e a Universidade do Colorado Boulder têm interesse financeiro no desenvolvimento de inibidores de HDAC para terapêutica e possuem participação na OnKure. X.L. é cofundador e membro do conselho de administração da OnKure, que licenciou inibidores de HDAC proprietários da Universidade do Colorado em Boulder. A OnKure não tem envolvimento no projeto experimental nem no financiamento deste estudo.

Agradecimentos

Agradecemos a Daniel Messenger, Lewis Baker, Douglas Chapnick, Adrian Ramirez, Quanbin Xu e outros membros dos laboratórios Liu e Bortz por sua visão e conselhos. Agradecemos a Jian Tay por compartilhar sua experiência em MATLAB e por escrever a função para importação de XML. Agradecemos a Joseph Dragavon, do Núcleo de Microscopia de Luz Avançada BioFrontiers, por seu suporte à microscopia e imagem. Agradecemos a Theresa Nahreini e Nicole Kethley, do Cell Culture Core Facility, por seu apoio à cultura de células. Este trabalho foi apoiado por doações do Instituto Nacional do Câncer e do Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele dos Institutos Nacionais de Saúde (R01AR068254) para XL e Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIGMS) R01GM126559 para DB e XL GEW e ENB foram apoiados por uma bolsa de treinamento pré-doutorado do NIGMS (T32GM08759). O ImageXpress Micro XL foi apoiado pelo Centro Nacional de Recursos de Pesquisa (S10 RR026680). A FACSAria foi apoiada pelo National Institutes of Health (S10OD021601).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat clear bottom black polystyrine TC-treated microplates, individually wrapped, with lid, sterileCorning3603
Dulbecco's modified eagle medium (high D-glucose)Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific12800-082
Fetal bovine serumSigma-Aldrich IncF0926
Fluorobrite Dulbecco's modified eagle medium (high D-glucose, 3.7 g/L sodium bicarbonate, no L-glutamine, no phenol red)Gibco/Thermo Fisher ScientificA18967-01
GlutaminePlusR&D Systems Inc.R90210
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrateInvitrogen/Thermo Fisher ScientificH21492
Penicillin streptomycinLife Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate buffered salineGibco/Thermo Fisher Scientific14190-144

Referências

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