Protocolo para el análisis y la consolidación de las salidas de TrackMate para medir la motilidad bidimensional de las células mediante el seguimiento nuclear

Resumen

Este protocolo para la medición de alto rendimiento de la motilidad celular en queratinocitos HaCaT describe métodos para recopilar y procesar imágenes de núcleos celulares y realizar el seguimiento de partículas utilizando el complemento TrackMate de ImageJ.

Resumen

La migración celular colectiva desempeña un papel clave en muchos procesos biológicos fundamentales, como el desarrollo, la cicatrización de heridas y la metástasis del cáncer. Para comprender la regulación de la motilidad celular, debemos ser capaces de medirla de manera fácil y consistente en diferentes condiciones. Aquí describimos un método para medir y cuantificar la motilidad unicelular y masiva de los queratinocitos HaCaT utilizando una tinción nuclear. Este método incluye un script de MATLAB para analizar los archivos de salida de TrackMate con el fin de calcular los desplazamientos, las tasas de motilidad y los ángulos de trayectoria en celdas individuales y de forma masiva para un sitio de obtención de imágenes. Este script de análisis de motilidad permite un análisis rápido, sencillo y escalable de las tasas de motilidad celular a partir de los datos de TrackMate y podría usarse ampliamente para identificar y estudiar la regulación de la motilidad en las células epiteliales. También proporcionamos un script de MATLAB para reorganizar los vídeos de microscopía recopilados en un microscopio y convertirlos en pilas TIF, que se pueden analizar mediante el complemento ImageJ TrackMate de forma masiva. Utilizando esta metodología para explorar el papel de las uniones adherentes y la dinámica del citoesqueleto de actina en la regulación de la motilidad celular en los queratinocitos de HaCaT, demostramos evidencia de que la actividad de Arp2/3 es necesaria para la motilidad elevada observada después de la depleción de α-catenina en los queratinocitos de HaCaT.

Introducción

La regulación precisa y sensible de la motilidad celular en las células epiteliales es crucial para la cicatrización de heridas y para reponer la capa epitelial. La falta de mantenimiento de la motilidad puede provocar problemas con el desarrollo embrionario y la cicatrización de heridas¹ , y la señalización de motilidad hiperactiva es un contribuyente clave a la metástasis del cáncer².

La comprensión del control celular de la motilidad en los queratinocitos HaCaT ofrece información importante sobre estos procesos. Los procedimientos descritos aquí proporcionan mediciones y cálculos consistentes de la magnitud promedio de la motilidad celular a nivel de una sola célula o población. Hemos utilizado este método para medir la motilidad en los queratinocitos HaCaT después de una perturbación genética o un tratamiento con inhibidores de moléculas pequeñas para comprender la señalización celular que controla las tasas de motilidad. El script de MATLAB proporcionado mide tanto la velocidad media como la dirección media de la motilidad de cada célula.

La motilidad celular colectiva es crucial para la transición epitelio-mesenquimal tanto en el desarrollo como en la metástasis del cáncer³. Las células logran la motilidad a través de la coordinación de la adhesión, la polarización, la protrusión y la retracción⁴. Estos procesos dependen en gran medida de la regulación coordinada del citoesqueleto dinámico de actina. La activación de la GTPasa Rac1 aguas abajo de PI3K o de varios receptores tirosina quinasas polariza la célula, lo que da lugar a la polimerización de la actina⁵. La dinámica del citoesqueleto de actina está regulada por esta y otras GTPasas mediadas por Rho, que se activan aguas abajo de varios factores de crecimiento. Estas GTPasas mediadas por Rho activan el complejo Arp2/3 que estimula la ramificación de actina⁶. Esta dinámica del citoesqueleto de actina está estrechamente relacionada con otro regulador clave de la motilidad: las uniones intercelulares. Estamos particularmente interesados en cómo las uniones adherentes, que forman fuertes adherencias entre las células, se coordinan con el citoesqueleto de actina para mantener la integridad del tejido⁷.

Hemos demostrado previamente que los queratinocitos de HaCaT que expresan una reducción de α-catenina mediada por shRNA muestran tasas de motilidad más altas que aquellos que expresan un control de shRNA no dirigido⁸. Deseamos utilizar las herramientas de análisis de motilidad que desarrollamos para comprender mejor el mecanismo de esta motilidad elevada tras el agotamiento de la α-catenina. α-catenina es un componente citosólico necesario de las uniones adherentes⁹. Participa en las uniones adherentes a través de su interacción con la ß-catenina, a la que se une como monómero^10,11. Sin embargo, la α-catenina también puede disociarse de las uniones adherentes para formar un homodímero que se une y agrupa los filamentos de actina, lo que inhibe la actividad de Arp2/3^10,11. Si bien la α-catenina no interactúa directamente con la actina mientras está unida a la ß-catenina, aún puede facilitar o fortalecer la coordinación entre las uniones adherentes y el citoesqueleto a través de la unión a la vinculina, que estabiliza los filamentos de actina¹².

Si bien el complemento TrackMate para ImageJ es un método bien establecido para el seguimiento de partículas que se puede usar para rastrear núcleos celulares, descubrimos que las herramientas disponibles para analizar, analizar y consolidar las salidas de TrackMate para calcular la motilidad celular para múltiples sitios de imágenes no estaban integradas y eran difíciles de usar para aquellos sin experiencia en múltiples lenguajes de programación. Tinevez y Herbert ofrecen una introducción al uso de TrackMate, pero la sección de análisis de desplazamiento cuadrático medio requiere una considerable habilidad de MATLAB¹³. Los métodos existentes para extraer las tasas de motilidad de los videos de microscopía de lapso de tiempo ofrecen análisis tridimensionales más complejos, pero requieren más experiencia en programación^14,15. Pathfinder, un software de seguimiento de células y análisis de motilidad desarrollado previamente en nuestro laboratorio, mide la velocidad y la dirección de la migración de células, pero solo es ejecutable en máquinas Windows y requiere^{un entorno de} ejecución Java limitante. Debido a que TrackMate es una herramienta tan confiable y bien documentada, desarrollamos un método sencillo para generar, analizar y organizar grandes conjuntos de datos bidimensionales de TrackMate utilizando MATLAB. Nuestro script también elimina los puntos de datos enteros repetidos que a veces ocurren en las salidas de TrackMate después de que una celda rastreada se tacha del sitio de imagen, lo que permite la inclusión de celdas con alta motilidad y/o direccionalidad en el análisis sin la inclusión de estos puntos de datos falsos. También proporcionamos un script para reorganizar las imágenes recopiladas en un ImageXpress Micro XL en pilas TIFF que se pueden analizar de forma masiva utilizando TrackMate.

En este protocolo, las células se siembran en una placa de imágenes de 96 pocillos. Después de dejar tiempo suficiente para que las células se adhieran al fondo de la placa, las tratamos con tinción nuclear de Hoechst y cualquier molécula pequeña cuyos efectos sobre la motilidad sean de interés. Recopilamos imágenes de los núcleos celulares en el transcurso de cinco o más horas, después de lo cual las secuencias de imágenes se procesan en pilas TIFF sustraídas en fondo utilizando MATLAB. Estas pilas TIFF se analizan utilizando el complemento ImageJ TrackMate, que registra y rastrea cada celda individual a través de puntos de tiempo¹⁷. Una vez que hemos generado rastreos celulares para todos los sitios de imagen, utilizamos un script de MATLAB personalizado para eliminar los puntos de datos falsos que se producen después de que las células abandonan el campo de imágenes y calcular las tasas de motilidad promedio para cada sitio de imagen. El script solo analiza las celdas que se rastrean durante un número mínimo de puntos de tiempo especificados por el usuario y permite al usuario filtrar las celdas por distancia total y/o dirección recorrida. El resultado es el desplazamiento promedio, la dirección de viaje promedio, el desplazamiento general y la dirección general de viaje para cada celda, que se utilizan para calcular los promedios masivos de esos valores para todas las celdas en un sitio de imágenes. Este protocolo se puede realizar de forma masiva en grandes experimentos de imagen, lo que se presta a un análisis de motilidad de rendimiento relativamente alto (Figura 1).

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Protocolo

1. Preparación de placas de cultivo celular e imágenes

1. Cultivo de células HaCaT en medio de cultivo celular (Dulbecco's Modified Eagle Medium suplementado con 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina y 10% (v/v) de suero fetal bovino) a 37 °C y 5% de dióxido de carbono en una incubadora humidificada.
2. Siembre el número deseado de células por pocillo (utilizamos de 5000 a 20.000 células/pocillo) en una placa de imagen de 96 pocillos, como una microplaca de poliestireno negro de 96 pocillos. A tres pocillos, agregue solo medio (sin celdas).
3. Apoye la placa sobre una superficie completamente plana durante 20 a 30 minutos para que las células puedan adherirse a la parte inferior de la placa con una distribución espacial uniforme.
4. Transfiera la placa a una incubadora de cultivo celular humidificada (37 °C, 5% de dióxido de carbono) durante 4-6 h para permitir que las células se adhieran completamente al fondo de la placa.
5. Retire el medio de la placa y reemplácelo con medio de cultivo celular con 2 μg/mL de colorante Hoechst (una dilución 1:5000 de 1 mg/mL de solución madre).
6. Placa de retorno a la incubadora de cultivos celulares humidificada (37 °C, 5% de dióxido de carbono) durante 2 h.
7. Lave suavemente la placa tres veces con 100 μL de solución salina tamponada con fosfato por pocillo antes de agregar 90 μL de medio de imagen (medio de águila modificado de Dulbecco sin rojo de fenol suplementado con 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina y 10% (v/v) de suero fetal bovino) a cada pocillo.
8. Si mide los efectos de inhibidores de moléculas pequeñas u otros efectores, trate las células inmediatamente antes de tomar imágenes por imágenes.

2. Imágenes

1. Visualice la placa (incluidos los pocillos de solo medios) con un aumento de 10x en un microscopio con una cámara ambiental humidificada a 37 °C y 5% de dióxido de carbono.
   NOTA: Los scripts de análisis de este protocolo se escriben para los datos recopilados en un microscopio de campo amplio ImageXpress Micro XL de Molecular Devices.
2. Recopile imágenes de acuerdo con la resolución temporal que requiera el experimento. Para obtener los mejores resultados, registre al menos 4 puntos de tiempo por hora durante al menos 5 h. Si mide los efectos de los inhibidores de moléculas pequeñas u otras perturbaciones en las células, tome imágenes durante al menos 5 horas después del tiempo esperado para ver un efecto. Para nuestros propósitos, tomamos imágenes de 100 puntos de tiempo de 8 minutos para un tiempo total de imagen de 13 h 20 min.

3. Procesamiento de imágenes

1. Utilice el script personalizado de MATLAB "ImageReorganizer.m" proporcionado para eliminar imágenes en miniatura y reorganizar los archivos de imagen por pozo en lugar de por punto de tiempo. ImageXpress genera archivos en esta organización de carpetas: "[Nombre del experimento] > [AAAA-MM-DD] > [Número de ejecución] > Timepoint_ [Punto de tiempo] > [Archivos de imagen]". Una vez que se han reorganizado las imágenes, este script realiza la sustracción de fondo en las imágenes de cada punto de tiempo utilizando las imágenes borrosas promediadas y gaussianas de los pozos de solo medios de ese punto de tiempo. A continuación, este script organiza las imágenes sustraídas en segundo plano en una pila TIFF para cada sitio de imágenes. Cada pila de TIFF se denomina "[Well]_[Site].tif".
   1. Si el experimento se extendió durante más de un día, combine el contenido de las carpetas [Número de ejecución] de todos los días para que todas las subcarpetas "Timepoint_[Punto de tiempo]" estén en la misma carpeta "[Número de ejecución]".
   2. Tenga en cuenta que este script requiere la función int2strz¹⁸ de MATLAB. Introduzca la ruta local a esta función después de "addpath" en la línea 2.
   3. Introduzca las filas de los pozos de solo medios como "emptyrows" en la línea 9 y las columnas como "emptycolumns" en la línea 10.
   4. Ingrese las filas de los pozos experimentales como "filas" en la línea 15 y las columnas como "columnas" en la línea 16. Ingrese el número de sitios de imágenes por pozo y "sitios" en la línea 17.
   5. Introduzca el nombre de la ruta de la carpeta "[Número de ejecución]" en la barra de rutas de MATLAB y ejecute el script.

4. Seguimiento celular

NOTA: TrackMate se puede ejecutar en todas las pilas TIFF en un directorio designado utilizando una versión ligeramente modificada del script Run_TrackMate_Headless.groovy de Tinevez et ^al.17 o se puede realizar manualmente para cada pila TIFF individual. Ejecutamos FIJI manualmente en algunas pilas TIFF de muestra para asegurarnos de que estamos usando los parámetros correctos antes de ejecutar el script Groovy en todas las pilas TIFF que usan esos parámetros.

1. Para ejecutar el complemento TrackMate en FIJI para todas las pilas TIFF en una carpeta, descargue y use el script Run_TrackMate_Headless.groovy de Tinevez et ^al.17 de acuerdo con el protocolo proporcionado. Utilizamos una versión ligeramente modificada de este script, que nos permite agrupar fácilmente tanto los archivos de entrada como los nombres de los archivos de salida e ingresar todos los parámetros utilizando una interfaz gráfica de usuario para la entrada. A continuación se muestran instrucciones detalladas para usar este script modificado, que se proporciona aquí como TrackMate_Headless_Mod.groovy.
   1. Para abrir el script en FIJI , seleccione Archivo>Abrir y, a continuación, navegue hasta la ubicación del script TrackMate_Headless_Mod.groovy.
   2. Seleccione Ejecutar.
   3. Introduzca el directorio en el que se encuentran las pilas TIFF (la salida predeterminada de "StackGenerator.m" debe ser "[Nombre del experimento] > [AAAA-MM-DD] >> pilas") como "Directorio de entrada".
   4. Cree un directorio de salida e introduzca su nombre de ruta como "Directorio de salida". El valor predeterminado de "Extensión de archivo" debe ser ".tif"; si no es así, escriba ".tif" como "Extensión de archivo".
   5. Para ejecutar TrackMate solo en un subconjunto de archivos en el directorio, use el espacio de entrada después de "El nombre del archivo contiene" para incluirlos. De lo contrario, deje ese espacio en blanco.
   6. Seleccione "Mantener la estructura del directorio al guardar".
   7. Ingrese "Radio de punto", "Umbral de calidad", "Espacio máximo de fotogramas", "Distancia máxima de enlace" y "Distancia máxima de cierre de espacio" en píxeles de acuerdo con la configuración deseada. Por lo general, usamos 3.5, 18, 2, 15 y 40, respectivamente, para núcleos de HaCaT con un aumento de 10x.
   8. Seleccione Aceptar. Este script debe generar un archivo XML para cada pila TIFF en el directorio de salida designado.
2. Alternativamente, ejecute el complemento TrackMate en FIJI manualmente para cada pila TIFF de acuerdo con el protocolo descrito en Tinevez et ^al.13
   1. Abra una pila TIFF en FIJI y abra el complemento TrackMate seleccionando Complementos >Seguimiento > TrackMate en la barra de menú.
   2. Si aparece una ventana emergente, aparece el mensaje "Parece que esta imagen tiene 1 punto de tiempo, pero [número de puntos de tiempo] se divide. ¿Desea intercambiar Z y T?", seleccione Sí.
   3. En TrackMate v4.0.1, use la configuración predeterminada excepto para "Diámetro estimado de la mancha" (usamos 7.000 píxeles para núcleos de HaCaT con un aumento de 10x) y umbral (usamos 18.000, pero esto variará según el microscopio utilizado y la intensidad del tinte de Hoechst).
   4. Utilice la función de vista previa para garantizar una detección optimizada de partículas y ajustar la configuración del diámetro y el umbral de la mancha según sea necesario.
   5. Para la "Distancia máxima de cierre de espacios", la configuración predeterminada a menudo funciona para la motilidad basal de HaCaT, pero es posible que sea necesario aumentar la distancia máxima de cierre de espacios hasta 40,0 píxeles en condiciones que mejoren la motilidad.
   6. Confirme visualmente que el seguimiento está optimizado con espacios mínimos en los seguimientos de celdas.
   7. En Seleccionar una acción [sic], elija Exportar pistas a archivo XML y ejecutar.
   8. Repita el procedimiento para todas las pilas de TIFF.

5. Cuantificación de las tasas de motilidad

NOTA: Utilice el script de MATLAB personalizado "TrackMateAnalysis.m" proporcionado para eliminar los seguimientos fallidos y cuantificar la motilidad de todos los archivos de salida de TrackMate. El script elimina las pistas que se mueven fuera del fotograma (cuyos seguimientos de ubicación se establecen de forma predeterminada en números enteros) y las pistas de las que se realiza un seguimiento durante menos de un número designado de puntos de tiempo. El script elimina las pistas que se mueven fuera del fotograma (cuyos seguimientos de ubicación se establecen de forma predeterminada en números enteros) y las pistas de las que se realiza un seguimiento durante menos de un número de puntos de tiempo designable. El resultado es el desplazamiento medio por punto de tiempo para las células individuales y todas las células de un sitio de obtención de imágenes. (Ejemplo de salida: 'Output.mat')

1. Tenga en cuenta que este script requiere la función de MATLAB proporcionada "import_trackmate_xml.m." Introduzca la ruta local a esta función después de "addpath" en la línea 4.
2. En la línea 7, indique el número mínimo de puntos de tiempo que se deben rastrear una partícula para incluirla en la salida consolidada.
3. En las líneas 12 y 13, indique el rango de distancias recorridas (en píxeles) que debe incluirse en el análisis filtrado. Para incluir todas las distancias recorridas posibles, introduzca un rango desde 0 hasta el ancho del campo de imagen.
4. En las líneas 14 y 15, indique el rango de trayectorias (en grados) que deben incluirse en el análisis filtrado. Para incluir todas las trayectorias posibles, introduzca un rango de 0 a 360.
5. Ejecute el script en la carpeta que contiene todos los archivos XML de salida de TrackMate.
   NOTA: El script genera y guarda una estructura de celda de MATLAB que contiene todos los datos generados en este análisis. Tables{1,:} enumera los nombres de los archivos XML de salida de Trackmate para cada sitio de imágenes analizado por este script. Tables{2,:} es una subestructura que contiene las posiciones (píxeles), desplazamientos (píxeles) y ángulos de viaje (grados, donde 0° indica una dirección de viaje hacia la derecha dentro del sitio de la imagen) para todas las celdas individuales en cada punto de tiempo. También contiene la distancia total recorrida (píxeles), la motilidad media (píxeles/punto de tiempo), el ángulo medio de viaje (grados) de cada celda en todos los puntos de tiempo, así como el ángulo total de viaje entre el primer y el último punto de tiempo de cada celda. Las^{filas 3 y 4} de las tablas, respectivamente, contienen los valores de motilidad promedio y de desviación estándar (píxeles/punto de tiempo) para todas las celdas en todos los puntos de tiempo de cada sitio de imagen. Las filas^5ª y^6ª contienen respectivamente los valores promedio y de desviación estándar para la distancia total recorrida (píxeles) por todas las celdas en todos los puntos de tiempo de cada sitio de imagen. Las filas^7ª y^8ª contienen los valores promedio y de desviación estándar para el ángulo de viaje general (grados) entre el primer y el último punto de tiempo para todas las celdas de un sitio de imagen. Mientras que las filas 3 a 8 de Tablas contienen estos valores para todas las celdas que cumplen los criterios mínimos de seguimiento de puntos temporales, las filas 9 a 14 contienen los mismos valores, pero solo para las celdas que cumplen los criterios de filtro indicados por el usuario.

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Resultados

Para asegurarnos de que nuestro script de análisis fuera fiable y consistente, medimos la motilidad de los queratinocitos HaCaT en tres experimentos independientes. Encontramos que, si bien la desviación estándar de las motilidades celulares fue variable entre experimentos (posiblemente debido a la sensibilidad de las células HaCaT a la confluencia y los estímulos mecánicos), la motilidad promedio se replicó consistentemente en múltiples experimentos sin diferencias estadísticam...

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Discusión

La metodología y las herramientas de análisis descritas anteriormente proporcionan un medio sencillo y escalable para medir y cuantificar la motilidad de los queratinocitos de HaCaT que utiliza MATLAB y requiere una experiencia mínima en programación. Este protocolo requiere que los núcleos de las células se tiñan y se obtengan imágenes en el transcurso de al menos 5 h. Si bien la recopilación de datos se puede realizar en cualquier microscopio adecuado, este protocolo proporcio...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well flat clear bottom black polystyrine TC-treated microplates, individually wrapped, with lid, sterile	Corning	3603
Dulbecco's modified eagle medium (high D-glucose)	Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific	12800-082
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich Inc	F0926
Fluorobrite Dulbecco's modified eagle medium (high D-glucose, 3.7 g/L sodium bicarbonate, no L-glutamine, no phenol red)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	A18967-01
GlutaminePlus	R&D Systems Inc.	R90210
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate	Invitrogen/Thermo Fisher Scientific	H21492
Penicillin streptomycin	Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate buffered saline	Gibco/Thermo Fisher Scientific	14190-144