Protocole d’analyse et de consolidation des sorties TrackMate pour la mesure de la motilité cellulaire bidimensionnelle à l’aide du suivi nucléaire

Résumé

Ce protocole de mesure à haut débit de la motilité cellulaire dans les kératinocytes HaCaT décrit les méthodes de collecte et de traitement des images des noyaux cellulaires et de suivi des particules à l’aide du plugin ImageJ TrackMate.

Résumé

La migration cellulaire collective joue un rôle clé dans de nombreux processus biologiques fondamentaux, notamment le développement, la cicatrisation des plaies et les métastases cancéreuses. Pour comprendre la régulation de la motilité cellulaire, nous devons être en mesure de la mesurer facilement et de manière cohérente dans différentes conditions. Nous décrivons ici une méthode de mesure et de quantification de la motilité unicellulaire et globale des kératinocytes HaCaT à l’aide d’une coloration nucléaire. Cette méthode inclut un script MATLAB pour analyser les fichiers de sortie TrackMate afin de calculer les déplacements, les taux de motilité et les angles de trajectoire dans des cellules uniques et en masse pour un site d’imagerie. Ce script d’analyse de motilité permet une analyse rapide, simple et évolutive des taux de motilité cellulaire à partir des données TrackMate et pourrait être largement utilisé pour identifier et étudier la régulation de la motilité dans les cellules épithéliales. Nous fournissons également un script MATLAB pour réorganiser les vidéos de microscopie collectées au microscope et les convertir en piles TIF, qui peuvent être analysées en masse à l’aide du plug-in ImageJ TrackMate. En utilisant cette méthodologie pour explorer les rôles des jonctions adhérentes et de la dynamique du cytosquelette d’actine dans la régulation de la motilité cellulaire dans les kératinocytes HaCaT, nous démontrons que l’activité Arp2/3 est nécessaire pour la motilité élevée observée après la déplétion en α-caténine dans les kératinocytes HaCaT.

Introduction

Une régulation précise et réactive de la motilité cellulaire dans les cellules épithéliales est cruciale pour la cicatrisation des plaies et pour le reconstituement de la couche épithéliale. L’incapacité à maintenir la motilité peut entraîner des problèmes de développement embryonnaire et de cicatrisation des plaies¹ et la signalisation de motilité hyperactive est un contributeur clé aux métastases cancéreuses².

La compréhension du contrôle cellulaire de la motilité dans les kératinocytes HaCaT offre des informations importantes sur ces processus. Les procédures décrites ici fournissent des mesures et des calculs cohérents de l’amplitude moyenne de la motilité cellulaire au niveau d’une cellule unique ou d’une population. Nous avons utilisé cette méthode pour mesurer la motilité dans les kératinocytes HaCaT après une perturbation génétique ou un traitement avec des inhibiteurs de petites molécules afin de comprendre la signalisation cellulaire qui contrôle les taux de motilité. Le script MATLAB fourni mesure à la fois la vitesse moyenne et la direction moyenne de la motilité de chaque cellule.

La motilité cellulaire collective est cruciale pour la transition épithéliale-mésenchymateuse à la fois dans le développement et dans les métastases cancéreuses³. Les cellules atteignent la motilité par la coordination de l’adhésion, de la polarisation, de la saillie et de la rétraction⁴. Ces processus reposent fortement sur la régulation coordonnée du cytosquelette d’actine dynamique. L’activation de la GTPase Rac1 en aval de PI3K ou de divers récepteurs tyrosine kinases polarise la cellule, entraînant une polymérisation de l’actine⁵. La dynamique du cytosquelette d’actine est régulée par cette dynamique et d’autres GTPases médiées par Rho, qui sont activées en aval de divers facteurs de croissance. Ces GTPases médiées par Rho activent alors le complexe Arp2/3 qui stimule la ramification de l’actine⁶. Cette dynamique du cytosquelette d’actine est étroitement liée à un autre régulateur clé de la motilité : les jonctions intercellulaires. Nous nous intéressons particulièrement à la façon dont les jonctions adhérentes, qui forment de fortes adhésions entre les cellules, se coordonnent avec le cytosquelette d’actine pour maintenir l’intégrité des tissus⁷.

Nous avons précédemment montré que les kératinocytes HaCaT exprimant une inhibition de la α-caténine médiée par shRNA présentent des taux de motilité plus élevés que ceux exprimant un contrôle shRNA non ciblé⁸. Nous souhaitons utiliser les outils d’analyse de motilité que nous avons développés pour mieux comprendre le mécanisme de cette motilité élevée lors de l’épuisement de la α-caténine. α-caténine est un composant cytosolique requis des jonctions adhérentes⁹. Il participe aux jonctions adhérentes par son interaction avec la ß-caténine, qu’il lie sous forme de monomère^10,11. Cependant, la α-caténine peut également se dissocier des jonctions adhérentes pour former un homodimère qui se lie et regroupe les filaments d’actine, ce qui inhibe l’activité Arp2/3^10,11. Bien que la α-caténine n’interagisse pas directement avec l’actine lorsqu’elle est liée à la ß-caténine, elle peut tout de même faciliter ou renforcer la coordination entre les jonctions adhérentes et le cytosquelette en se liant à la vinculine, qui stabilise les filaments d’actine¹².

Bien que le plug-in TrackMate pour ImageJ soit une méthode bien établie de suivi des particules qui peut être utilisée pour suivre les noyaux cellulaires, nous avons constaté que les outils disponibles pour analyser, analyser et consolider les sorties TrackMate afin de calculer la motilité cellulaire pour plusieurs sites d’imagerie n’étaient pas intégrés et étaient difficiles à utiliser pour ceux qui n’avaient pas d’expertise dans plusieurs langages de programmation. Tinevez et Herbert proposent une introduction à l’utilisation de TrackMate, mais la section d’analyse du déplacement carré moyen nécessite des compétences MATLAB^{considérables 13}. Les méthodes existantes d’extraction des taux de motilité à partir de vidéos de microscopie time-lapse offrent des analyses tridimensionnelles plus complexes, mais nécessitent une plus grande expertise en programmation^14,15. Pathfinder, un logiciel de suivi cellulaire et d’analyse de motilité précédemment développé dans notre laboratoire, mesure la vitesse et la direction de la migration cellulaire, mais n’est exécutable que sur les machines Windows et nécessite un environnement d’exécution Java¹⁶ limitatif. TrackMate étant un outil fiable et bien documenté, nous avons développé une méthode simple pour générer, analyser et organiser de grands ensembles de données TrackMate bidimensionnels à l’aide de MATLAB. Notre script supprime également les points de données entiers répétés qui se produisent parfois dans les sorties TrackMate après qu’une cellule suivie a quitté le site d’imagerie, ce qui permet d’inclure des cellules à forte motilité et/ou directionnalité dans l’analyse sans inclure ces points de données parasites. Nous fournissons également un script pour réorganiser les images collectées sur un ImageXpress Micro XL en piles TIFF qui peuvent être analysées en masse à l’aide de TrackMate.

Dans ce protocole, les cellules sont ensemenceuses dans une plaque d’imagerie à 96 puits. Après avoir laissé suffisamment de temps aux cellules pour adhérer au fond de la plaque, nous les traitons avec une coloration nucléaire de Hoechst et toutes les petites molécules dont les effets sur la motilité sont intéressants. Nous collectons des images des noyaux cellulaires pendant cinq heures ou plus, après quoi les séquences d’images sont transformées en piles TIFF soustraites en arrière-plan à l’aide de MATLAB. Ces piles TIFF sont analysées à l’aide du plug-in ImageJ TrackMate, qui enregistre et suit chaque cellule individuelle à travers des points temporels¹⁷. Une fois que nous avons généré des traces de cellules pour tous les sites d’imagerie, nous utilisons un script MATLAB personnalisé pour supprimer les points de données parasites qui se produisent après que les cellules ont quitté le champ d’imagerie et calculer les taux de motilité moyens pour chaque site d’imagerie. Le script analyse uniquement les cellules qui sont suivies pour un nombre minimum de points temporels spécifié par l’utilisateur et permet à l’utilisateur de filtrer les cellules en fonction de la distance globale et/ou de la direction parcourue. Le résultat est le déplacement moyen, la direction de déplacement moyenne, le déplacement global et la direction de déplacement globale de chaque cellule, qui sont utilisés pour calculer les moyennes globales de ces valeurs pour toutes les cellules d’un site d’imagerie. Ce protocole peut être réalisé en masse sur de grandes expériences d’imagerie, ce qui se prête à une analyse de motilité à débit relativement élevé (Figure 1).

Protocole

1. Préparation de plaques de culture cellulaire et d’imagerie

1. Cultiver des cellules HaCaT dans un milieu de culture cellulaire (milieu d’Eagle modifié de Dulbecco complété par 2 mM de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine et 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin) à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié.
2. Amorcez le nombre souhaité de cellules par puits (nous utilisons 5000 à 20 000 cellules/puits) dans une plaque d’imagerie à 96 puits, telle qu’une microplaque de polystyrène noir à 96 puits. Dans trois puits, ajoutez uniquement du milieu (pas de cellules).
3. Posez la plaque sur une surface complètement plane pendant 20 à 30 minutes afin que les cellules puissent se fixer au bas de la plaque avec une répartition spatiale uniforme.
4. Transférer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire humidifié (37 °C, 5 % de dioxyde de carbone) pendant 4 à 6 h pour permettre aux cellules d’adhérer complètement au fond de la plaque.
5. Retirer le milieu de la plaque et le remplacer par un milieu de culture cellulaire avec un colorant Hoechst de 2 μg/mL (dilution de 1:5000 d’une solution mère de 1 mg/mL).
6. Remettre la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire humidifié (37 °C, 5 % de dioxyde de carbone) pendant 2 h.
7. Laver délicatement la plaque trois fois avec 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate par puits avant d’ajouter 90 μL de milieu d’imagerie (milieu d’aigle modifié Dulbecco’s sans rouge de phénol complété par 2 mM de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine et 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin) dans chaque puits.
8. Si vous mesurez les effets d’inhibiteurs de petites molécules ou d’autres effecteurs, traitez les cellules immédiatement avant l’imagerie.

2. Imagerie

1. Imagez la plaque (y compris les puits de support uniquement) à un grossissement de 10x dans un microscope avec une chambre environnementale humidifiée à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone.
   REMARQUE : Les scripts d’analyse de ce protocole sont écrits pour les données collectées sur un microscope à grand champ ImageXpress Micro XL de Molecular Devices.
2. Collectez des images en fonction de la résolution temporelle requise par l’expérience. Pour de meilleurs résultats, enregistrez au moins 4 points de temps par heure pendant au moins 5 h. Si vous mesurez les effets d’inhibiteurs de petites molécules ou d’autres perturbations sur les cellules, imagez pendant au moins 5 heures après le temps prévu pour voir un effet. Pour nos besoins, nous imaginons 100 points de temps de 8 minutes pour un temps d’imagerie total de 13 h 20 min.

3. Traitement d’image

1. Utilisez le script MATLAB personnalisé fourni « ImageReorganizer.m » pour supprimer les images miniatures et réorganiser les fichiers image par puits plutôt que par point temporel. L’ImageXpress génère des fichiers dans cette organisation de dossiers : « [Nom de l’expérience] > [AAAA-MM-JJ] > [Numéro d’exécution] > Timepoint_[Timepoint] > [Fichiers image] ». Une fois les images réorganisées, ce script effectue une soustraction d’arrière-plan sur les images de chaque point temporel à l’aide des images floues moyennées et gaussiennes des puits multimédias uniquement à partir de ce point temporel. Ce script organise ensuite les images soustraites en arrière-plan dans une pile TIFF pour chaque site d’imagerie. Chaque pile TIFF est nommée « [Well]_[Site].tif. »
   1. Si l’expérience s’est étendue sur plus d’une journée, combinez le contenu des dossiers [Numéro d’exécution] pour tous les jours afin que tous les sous-dossiers « Timepoint_[Timepoint] » se trouvent dans le même dossier « [Numéro d’exécution] ».
   2. Notez que ce script nécessite la fonction MATLAB int2strz¹⁸. Entrez le chemin local de cette fonction après « addpath » à la ligne 2.
   3. Entrez les lignes pour les puits multimédias uniquement en tant que « emptyrows » à la ligne 9 et les colonnes en tant que « emptycolumns » à la ligne 10.
   4. Entrez les rangées des puits expérimentaux sous forme de « rangées » à la ligne 15 et les colonnes sous forme de « colonnes » à la ligne 16. Entrez le nombre de sites d’imagerie par et « sites » à la ligne 17.
   5. Saisissez le chemin d’accès du dossier « [Numéro d’exécution] » dans la barre de chemin d’accès dans MATLAB et exécutez le script.

4. Suivi cellulaire

REMARQUE : TrackMate peut être exécuté sur toutes les piles TIFF d’un répertoire désigné à l’aide d’une version légèrement modifiée du script Run_TrackMate_Headless.groovy de Tinevez et ^al.17 ou peut être exécuté manuellement pour chaque pile TIFF individuelle. Nous exécutons FIJI manuellement sur quelques exemples de piles TIFF pour nous assurer que nous utilisons les bons paramètres avant d’exécuter le script Groovy sur toutes les piles TIFF utilisant ces paramètres.

1. Pour exécuter le plug-in TrackMate dans FIJI pour toutes les piles TIFF d’un dossier, téléchargez et utilisez le script Run_TrackMate_Headless.groovy de Tinevez et ^al.17 selon leur protocole fourni. Nous utilisons une version légèrement modifiée de ce script, qui nous permet de regrouper facilement les fichiers d’entrée et les noms de fichiers de sortie et d’entrer tous les paramètres à l’aide d’une interface utilisateur graphique pour la saisie. Vous trouverez ci-dessous des instructions détaillées pour l’utilisation de ce script modifié, qui est fourni ici sous le nom de TrackMate_Headless_Mod.groovy.
   1. Ouvrez le script dans FIJI en sélectionnant Fichier>Ouvrir , puis en naviguant jusqu’à l’emplacement du script TrackMate_Headless_Mod.groovy.
   2. Sélectionnez Exécuter.
   3. Entrez le répertoire dans lequel se trouvent les piles TIFF (la sortie par défaut de « StackGenerator.m » doit être « [Nom de l’expérience] > [AAAA-MM-JJ] >> piles ») en tant que « Répertoire d’entrée ».
   4. Créez un répertoire de sortie et entrez son chemin d’accès en tant que « Répertoire de sortie ». La valeur par défaut pour « L’extension de fichier doit être « .tif ; » sinon, entrez « .tif » comme « Extension de fichier ».
   5. Pour n’exécuter TrackMate que sur un sous-ensemble de fichiers dans le répertoire, utilisez l’espace d’entrée après « Le nom du fichier contient » pour les inclure. Sinon, laissez cet espace vide.
   6. Sélectionnez « Conserver la structure des répertoires lors de l’enregistrement ».
   7. Saisissez « Rayon de repérage », « Seuil de qualité », « Écart d’image maximal », « Distance maximale de liaison » et « Distance maximale de fermeture d’écart » en pixels selon les paramètres souhaités. Nous utilisons généralement 3,5, 18, 2, 15 et 40, respectivement, pour les noyaux HaCaT à un grossissement de 10x.
   8. Sélectionnez OK. Ce script doit générer un fichier XML pour chaque pile TIFF dans le répertoire de sortie désigné.
2. Vous pouvez également exécuter manuellement le plug-in TrackMate dans FIJI pour chaque pile TIFF selon le protocole décrit dans Tinevez et ^al.13
   1. Ouvrez une pile TIFF dans FIJI et ouvrez le plug-in TrackMate en sélectionnant Plug-ins >Suivi > TrackMate dans la barre de menus.
   2. Si une fenêtre contextuelle affiche l’invite "Il semble que cette image ait 1 point de temps mais [nombre de points de temps] tranches. Voulez-vous échanger Z et T ? sélectionnez Oui.
   3. Dans TrackMate v4.0.1, utilisez les paramètres par défaut à l’exception du « Diamètre estimé des gouttes » (nous utilisons 7.000 pixels pour les noyaux HaCaT à un grossissement de 10x) et du seuil (nous utilisons 18.000, mais cela variera en fonction du microscope utilisé et de l’intensité du colorant Hoechst).
   4. Utilisez la fonction Aperçu pour garantir une détection optimisée des particules et ajustez les paramètres de diamètre et de seuil des gouttes si nécessaire.
   5. Pour la « distance maximale de fermeture de l’espace », les paramètres par défaut fonctionnent souvent pour la motilité HaCaT de base, mais il peut être nécessaire d’augmenter la distance maximale de fermeture de l’espace jusqu’à 40,0 pixels dans des conditions qui améliorent la motilité.
   6. Vérifiez visuellement que le suivi est optimisé avec un minimum d’espaces dans les traces de cellule.
   7. Sous Sélectionner une action [sic], choisissez Exporter les pistes dans un fichier XML et exécuter.
   8. Répétez l’opération pour toutes les piles TIFF.

5. Quantification des taux de motilité

REMARQUE : utilisez le script MATLAB personnalisé « TrackMateAnalysis.m » fourni pour supprimer les traces ayant échoué et quantifier la motilité de tous les fichiers de sortie TrackMate. Le script supprime les pistes qui se déplacent hors du cadre (dont les traces d’emplacement sont par défaut des entiers) et les pistes qui sont suivies pendant moins d’un certain nombre de points de temps. Le script supprime les pistes qui se déplacent hors du cadre (dont les traces d’emplacement sont par défaut des entiers) et les pistes qui sont suivies pendant moins d’un certain nombre de points de temps concevables. Le résultat est le déplacement moyen par point temporel pour les cellules individuelles et toutes les cellules d’un site d’imagerie. (Exemple de sortie : 'Output.mat')

1. Notez que ce script nécessite la fonction MATLAB « import_trackmate_xml.m. » fournie Entrez le chemin local de cette fonction après « addpath » à la ligne 4.
2. À la ligne 7, indiquez le nombre minimum de points temporels sur lesquels une particule doit être suivie pour être incluse dans votre sortie consolidée.
3. Aux lignes 12 et 13, indiquez la plage de distances parcourues (en pixels) qui doit être incluse dans l’analyse filtrée. Pour inclure toutes les distances parcourues possibles, entrez une plage comprise entre 0 et la largeur de votre champ d’imagerie.
4. Aux lignes 14 et 15, indiquez la plage de trajectoires (en degrés) qui doit être incluse dans l’analyse filtrée. Pour inclure toutes les trajectoires possibles, entrez une plage de 0 à 360.
5. Exécutez le script dans le dossier contenant tous les fichiers XML de sortie TrackMate.
   REMARQUE : le script génère et enregistre une structure de cellule MATLAB contenant toutes les données générées dans cette analyse. Tables{1, :} répertorie les noms des fichiers XML de sortie Trackmate pour chaque site d’imagerie analysé par ce script. Tables{2, :} est une sous-structure contenant les positions (pixels), les déplacements (pixels) et les angles de déplacement (degrés, 0° indiquant une direction de déplacement vers la droite à l’intérieur du site d’imagerie) pour toutes les cellules uniques à chaque point temporel. Il contient également la distance totale parcourue (pixels), la motilité moyenne (pixels/point temporel), l’angle de déplacement moyen (degrés) de chaque cellule à tous les points temporels, ainsi que l’angle de déplacement total entre le premier et le dernier point temporel de chaque cellule. Les 3^e et 4^e rangées des tableaux contiennent respectivement les valeurs de motilité moyenne et d’écart-type (pixels/point temporel) pour toutes les cellules à tous les points temporels de chaque site d’imagerie. Les 5^e et 6^e rangées contiennent respectivement les valeurs de moyenne et d’écart-type pour la distance totale parcourue (pixels) par toutes les cellules à tous les points temporels de chaque site d’imagerie. Les 7^e et 8^e rangées contiennent les valeurs de moyenne et d’écart-type de l’angle de déplacement global (degrés) entre le premier et le dernier point temporel pour toutes les cellules d’un site d’imagerie. Alors que les lignes 3 à 8 des tables contiennent ces valeurs pour toutes les cellules qui répondent aux critères de suivi de point temporel minimum, les lignes 9 à 14 contiennent les mêmes valeurs, mais uniquement pour les cellules qui répondent aux critères de filtre indiqués par l’utilisateur.

Résultats

Pour nous assurer que notre script d’analyse était fiable et cohérent, nous avons mesuré la motilité des kératinocytes HaCaT dans trois expériences indépendantes. Nous avons constaté que si l’écart-type des motilités cellulaires était variable d’une expérience à l’autre (peut-être en raison de la sensibilité des cellules HaCaT à la confluence et aux stimuli mécaniques), la motilité moyenne était systématiquement répliquée dans plusieurs expériences sans dif...

Discussion

La méthodologie et les outils d’analyse décrits ci-dessus fournissent un moyen simple et évolutif de mesurer et de quantifier la motilité des kératinocytes HaCaT qui utilise MATLAB et nécessite une expérience minimale en programmation. Ce protocole demande que les noyaux des cellules soient colorés et imagés pendant au moins 5 h. Bien que la collecte de données puisse être effectuée sur n’importe quel microscope approprié, ce protocole fournit un script pour le traitemen...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well flat clear bottom black polystyrine TC-treated microplates, individually wrapped, with lid, sterile	Corning	3603
Dulbecco's modified eagle medium (high D-glucose)	Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific	12800-082
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich Inc	F0926
Fluorobrite Dulbecco's modified eagle medium (high D-glucose, 3.7 g/L sodium bicarbonate, no L-glutamine, no phenol red)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	A18967-01
GlutaminePlus	R&D Systems Inc.	R90210
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate	Invitrogen/Thermo Fisher Scientific	H21492
Penicillin streptomycin	Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate buffered saline	Gibco/Thermo Fisher Scientific	14190-144