Nükleer İzleme Kullanarak İki Boyutlu Hücre Hareketliliğini Ölçmek için TrackMate Çıktılarının Analizi ve Konsolidasyonu Protokolü

Özet

HaCaT keratinositlerinde hücre motilitesinin yüksek verimli ölçümü için bu protokol, hücre çekirdeğinin görüntülerini toplama ve işleme ve ImageJ eklentisi TrackMate kullanarak parçacık izleme gerçekleştirme yöntemlerini açıklar.

Özet

Kolektif hücresel göç, gelişim, yara iyileşmesi ve kanser metastazı dahil olmak üzere birçok temel biyolojik süreçte kilit bir rol oynar. Hücre hareketliliğinin düzenlenmesini anlamak için, onu farklı koşullar altında kolay ve tutarlı bir şekilde ölçebilmeliyiz. Burada, bir nükleer boyama kullanarak HaCaT keratinositlerinin tek hücreli ve toplu motilitesini ölçmek ve ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, bir görüntüleme sitesi için tek hücrelerde ve toplu olarak yer değiştirmeleri, hareketlilik oranlarını ve yörünge açılarını hesaplamak için TrackMate çıktı dosyalarını analiz etmek için bir MATLAB komut dosyası içerir. Bu motilite analizi komut dosyası, TrackMate verilerinden hücre motilite oranlarının hızlı, basit ve ölçeklenebilir analizine olanak tanır ve epitel hücrelerindeki motilitenin düzenlenmesini tanımlamak ve incelemek için geniş çapta kullanılabilir. Ayrıca, mikroskopta toplanan mikroskopi videolarını yeniden düzenlemek ve bunları toplu olarak ImageJ TrackMate eklentisi kullanılarak analiz edilebilen TIF yığınlarına dönüştürmek için bir MATLAB komut dosyası sağlıyoruz. HaCaT keratinositlerinde hücre motilitesini düzenlemede adherens bağlantılarının ve aktin hücre iskeleti dinamiklerinin rollerini araştırmak için bu metodolojiyi kullanarak, HaCaT keratinositlerinde α-katenin tükenmesinden sonra görülen yüksek motilite için Arp2/3 aktivitesinin gerekli olduğuna dair kanıtlar gösteriyoruz.

Giriş

Epitel hücrelerindeki hücresel motilitenin kesin ve duyarlı bir şekilde düzenlenmesi, yara iyileşmesi ve epitel tabakasının yenilenmesi için çok önemlidir. Motilitenin sürdürülememesi, embriyonik gelişim ve yara iyileşmesi ile ilgili sorunlara^{yol açabilir 1} ve aşırı aktif motilite sinyali, kanser metastazı^2'ye önemli bir katkıda bulunur.

HaCaT keratinositlerinde motilitenin hücresel kontrolünü anlamak, bu süreçler hakkında önemli bilgiler sunar. Burada özetlenen prosedürler, tek hücre veya popülasyon düzeyinde hücresel hareketliliğin ortalama büyüklüğünün tutarlı ölçümlerini ve hesaplamalarını sağlar. Bu yöntemi, motilite oranlarını kontrol eden hücre sinyallemesini anlamak için genetik bozulma veya küçük molekül inhibitörleri ile tedaviden sonra HaCaT keratinositlerindeki motiliteyi ölçmek için kullandık. Sağlanan MATLAB komut dosyası, her hücre için hem ortalama hızı hem de ortalama hareketlilik yönünü ölçer.

Kolektif hücre motilitesi hem gelişimde hem de kanser metastazında epitelyal-mezenkimal geçiş için çok önemlidir³. Hücreler, yapışma, polarizasyon, çıkıntı ve geri çekilme^{koordinasyonu} yoluyla motilite elde eder 4. Bu süreçler büyük ölçüde dinamik aktin hücre iskeletinin koordineli düzenlenmesine dayanır. PI3K veya çeşitli reseptör tirozin kinazların aşağı akışında Rac1 GTPaz'ın aktivasyonu, hücreyi polarize eder ve aktin polimerizasyonuna^{neden olur 5}. Aktin hücre iskeleti dinamikleri, çeşitli büyüme faktörlerinin aşağı akışı ile aktive edilen bu ve diğer Rho aracılı GTPazlar tarafından düzenlenir. Bu Rho aracılı GTPazlar daha sonra aktin^{dallanmasını} 6 uyaran Arp2/3 kompleksini aktive eder. Bu aktin hücre iskeleti dinamikleri, motilitenin başka bir önemli düzenleyicisi ile yakından ilişkilidir: hücreler arası bağlantılar. Özellikle, hücreler arasında güçlü yapışıklıklar oluşturan adherens bağlantılarının,^{doku bütünlüğünü korumak} için aktin hücre iskeleti ile nasıl koordine olduğu ile ilgileniyoruz7.

Daha önce, shRNA aracılı bir α-katenin yıkımını ifade eden HaCaT keratinositlerinin, hedeflemeyen bir shRNA kontrolünü ifade edenlerden daha yüksek motilite oranları gösterdiğini göstermiştik⁸. α-kateninin tükenmesi üzerine bu yüksek motilitenin mekanizmasını daha iyi anlamak için geliştirdiğimiz motilite analiz araçlarını kullanmak istiyoruz. α-Katenin, adherens bağlantılarının⁹ gerekli bir sitozolik bileşenidir. Bir monomer^10,11 olarak bağladığı ß-katenin ile etkileşimi yoluyla adherens bağlantılarına katılır. Bununla birlikte, α-katenin, aktin filamentlerini bağlayan ve demetleyen bir homodimer oluşturmak için adherens bağlantılarından da ayrışabilir, bu da Arp2/3 aktivitesini^{inhibe eder 10,11}. α-katenin, ß-katenine bağlıyken aktin ile doğrudan etkileşime girmese de, aktin filamentlerini¹² stabilize eden vinküline bağlanarak adherens bağlantıları ile hücre iskeleti arasındaki koordinasyonu kolaylaştırabilir veya güçlendirebilir.

ImageJ için TrackMate eklentisi, hücre çekirdeklerini izlemek için kullanılabilecek parçacık izleme için iyi bilinen bir yöntem olsa da, birden fazla görüntüleme bölgesi için hücre hareketliliğini hesaplamak üzere TrackMate çıktılarını ayrıştırmak, analiz etmek ve birleştirmek için mevcut araçların entegre olmadığını ve birden fazla programlama dilinde uzmanlığı olmayanlar için kullanımının zor olduğunu gördük. Tinevez ve Herbert, TrackMate kullanımı hakkında bir başlangıç sunuyor, ancak ortalama kare yer değiştirme analizi bölümü önemli ölçüde MATLAB becerisi^{gerektiriyor 13}. Hızlandırılmış mikroskopi videolarından motilite oranlarını çıkarmak için mevcut yöntemler daha karmaşık üç boyutlu analizler sunar ancak daha fazla programlama uzmanlığı gerektirir^14,15. Daha önce laboratuvarımızda geliştirilen bir hücre izleme ve hareketlilik analizi yazılımı olan Pathfinder, hücre göç hızını ve yönünü ölçer ancak yalnızca Windows makinelerinde çalıştırılabilir ve sınırlayıcı bir Java Runtime ortamı^{gerektirir 16}. TrackMate çok güvenilir ve iyi belgelenmiş bir araç olduğundan, MATLAB kullanarak büyük iki boyutlu TrackMate veri kümelerini oluşturmak, analiz etmek ve düzenlemek için basit bir yöntem geliştirdik. Komut dosyamız ayrıca, izlenen bir hücre görüntüleme alanından çıktıktan sonra bazen TrackMate çıktılarında meydana gelen tekrarlanan tamsayı veri noktalarını da kaldırır ve bu sahte veri noktaları dahil edilmeden analize yüksek hareketlilik ve/veya yönlülüğe sahip hücrelerin dahil edilmesine izin verir. Ayrıca, bir ImageXpress Micro XL'de toplanan görüntüleri, TrackMate kullanılarak toplu olarak analiz edilebilen TIFF yığınları halinde yeniden düzenlemek için bir komut dosyası da sağlıyoruz.

Bu protokolde, hücreler 96 oyuklu bir görüntüleme plakasına ekilir. Hücrelerin plakanın dibine yapışması için yeterli zaman tanıdıktan sonra, onları Hoechst nükleer boyası ve motilite üzerindeki etkileri ilgi çekici olan küçük moleküllerle tedavi ediyoruz. Beş veya daha fazla saat boyunca hücre çekirdeklerinin görüntülerini topluyoruz, ardından görüntü dizileri MATLAB kullanılarak arka plan çıkarılmış TIFF yığınlarına işleniyor. Bu TIFF yığınları, her bir hücreyi¹⁷ zaman noktasında kaydeden ve izleyen ImageJ TrackMate eklentisi kullanılarak analiz edilir. Tüm görüntüleme siteleri için hücre izleri oluşturduktan sonra, hücreler görüntüleme alanından ayrıldıktan sonra ortaya çıkan sahte veri noktalarını kaldırmak ve her görüntüleme sitesi için ortalama motilite oranlarını hesaplamak için özel bir MATLAB komut dosyası kullanırız. Komut dosyası yalnızca kullanıcı tarafından belirlenen minimum zaman noktası sayısı için izlenen hücreleri analiz eder ve kullanıcının hücreleri toplam mesafeye ve/veya kat edilen yöne göre filtrelemesine olanak tanır. Sonuç, bir görüntüleme bölgesindeki tüm hücreler için bu değerlerin toplu ortalamalarını hesaplamak için kullanılan, her hücre için ortalama yer değiştirme, ortalama hareket yönü, genel yer değiştirme ve toplam hareket yönüdür. Bu protokol, nispeten yüksek verimli motilite analizine katkıda bulunan büyük görüntüleme deneylerinde toplu olarak gerçekleştirilebilir (Şekil 1).

Protokol

1. Hücre kültürü ve görüntüleme plakası hazırlama

1. Nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C ve% 5 karbondioksit ile hücre kültürü ortamında (2 mM L-glutamin, 100 U / mL penisilin / streptomisin ve% 10 (h / h) fetal sığır serumu ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium) kültür HaCaT hücreleri.
2. 96 oyuklu siyah polistiren mikroplaka gibi 96 oyuklu bir görüntüleme plakasında oyuk başına istenen sayıda hücreyi (5000 - 20.000 hücre / kuyu kullanıyoruz) tohumlayın. Üç kuyucuğa sadece orta ekleyin (hücre yok).
3. Plakayı 20 - 30 dakika boyunca tamamen düz bir yüzeyde dinlendirin, böylece hücreler plakanın dibine eşit uzamsal dağılımla yapışabilir.
4. Hücrelerin plakanın dibine tamamen yapışmasını sağlamak için plakayı 4-6 saat boyunca nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatörüne (37 °C,% 5 karbondioksit) aktarın.
5. Ortamı plakadan çıkarın ve 2 μg / mL Hoechst boyası (1 mg / mL stok çözeltisinin 1:5000 seyreltmesi) ile hücre kültürü ortamı ile değiştirin.
6. Plakayı 2 saat boyunca nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatörüne (37 °C, %5 karbondioksit) geri koyun.
7. 90 μL görüntüleme ortamı (fenol kırmızısı içermeyen Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'u, 2 mM L-glutamin, 100 U / mL penisilin / streptomisin ve %10 (h/h) fetal sığır serumu) eklemeden önce plakayı üç kez çukur başına 100 μL fosfat tamponlu salin ile nazikçe yıkayın.
8. Küçük molekül inhibitörlerinin veya diğer efektörlerin etkilerini ölçüyorsanız, görüntülemeden hemen önce hücreleri tedavi edin.

2. Görüntüleme

1. Plakayı (yalnızca ortam kuyuları dahil) 37 ° C'de nemlendirilmiş bir çevre odası ve% 5 karbondioksit ile bir mikroskopta 10x büyütmede görüntüleyin.
   NOT: Bu protokoldeki analiz komut dosyaları, Molecular Devices ImageXpress Micro XL geniş alan mikroskobunda toplanan veriler için yazılmıştır.
2. Deney için gereken zamansal çözünürlüğe göre görüntüleri toplayın. En iyi sonuçlar için, en az 5 saat boyunca saatte en az 4 zaman noktası kaydedin. Küçük molekül inhibitörlerinin veya diğer ilgili maddelerin hücreler üzerindeki etkilerini ölçüyorsanız, bir etki görmesi beklenen süreden sonra en az 5 saat boyunca görüntü oluşturun. Amaçlarımız için, toplam 13 saat 20 dakikalık görüntüleme süresi için 100 adet 8 dakikalık zaman noktası için görüntü oluşturuyoruz.

3. Görüntü İşleme

1. Küçük resim görüntülerini kaldırmak ve görüntü dosyalarını zaman noktası yerine iyi bir şekilde yeniden düzenlemek için sağlanan özel MATLAB komut dosyası "ImageReorganizer.m" kullanın. ImageXpress, bu klasör organizasyonundaki dosyaları çıkarır: "[Deney Adı] > [YYYY-AA-GG] > [Çalışma numarası] > Timepoint_[Zaman noktası] > [Görüntü dosyaları]." Görüntüler yeniden düzenlendikten sonra, bu komut dosyası, o zaman noktasından yalnızca medya kuyularının ortalaması alınmış ve gauss bulanık görüntülerini kullanarak her zaman noktasındaki görüntüler üzerinde arka plan çıkarma işlemi gerçekleştirir. Bu komut dosyası daha sonra arka plandan çıkarılan görüntüleri her görüntüleme sitesi için bir TIFF yığını halinde düzenler. Her TIFF yığını "[Well]_[Site].tif" olarak adlandırılır.
   1. Deneme bir günden daha uzun sürdüyse, tüm "Timepoint_[Zaman Noktası]" alt klasörleri aynı "[Çalışma numarası]" klasöründe olacak şekilde tüm günler için [Çalışma numarası] klasörlerinin içeriğini birleştirin.
   2. Bu komut dosyasının int2strz¹⁸ MATLAB işlevini gerektirdiğini unutmayın. 2. satırdaki "addpath" işleminden sonra bu işlevin yerel yolunu girin.
   3. Yalnızca medya kutucukları için satırları 9. satırda "emptyrows" ve sütunları 10. satırda "emptycolumns" olarak girin.
   4. Deneysel kuyucuklar için satırları 15. satırda "satırlar" ve sütunları 16. satırda "sütunlar" olarak girin. 17. satırda "siteler" başına görüntüleme sitelerinin sayısını girin.
   5. "[Run number]" klasörünün yol adını MATLAB'daki yol çubuğuna girin ve komut dosyasını çalıştırın.

4. Hücre takibi

NOT: TrackMate, Tinevez et ^al.17'den Run_TrackMate_Headless.groovy komut dosyasının biraz değiştirilmiş bir sürümü kullanılarak belirlenmiş bir dizindeki tüm TIFF yığınlarında çalıştırılabilir veya her bir TIFF yığını için manuel olarak gerçekleştirilebilir. Bu parametreleri kullanarak tüm TIFF yığınlarında Groovy komut dosyasını çalıştırmadan önce doğru parametreleri kullandığımızdan emin olmak için FIJI'yi birkaç örnek TIFF yığınında manuel olarak çalıştırıyoruz.

1. Bir klasördeki tüm TIFF yığınları için FIJI'de TrackMate eklentisini çalıştırmak için, sağladıkları protokole göre Tinevez ve ^ark.17'den Run_TrackMate_Headless.groovy komut dosyasını indirin ve kullanın. Bu komut dosyasının biraz değiştirilmiş bir sürümünü kullanıyoruz, bu da hem girdi dosyalarını hem de çıktı dosya adlarını kolayca toplu hale getirmemize ve giriş için tek bir grafik kullanıcı arayüzü kullanarak tüm parametreleri girmemize olanak tanır. Aşağıda, burada TrackMate_Headless_Mod.groovy olarak sağlanan bu değiştirilmiş komut dosyasını kullanmak için ayrıntılı talimatlar verilmiştir.
   1. Dosya>Aç'ı seçerek ve ardından TrackMate_Headless_Mod.groovy komut dosyasının konumuna giderek komut dosyasını FIJI'de açın.
   2. Çalıştır'ı seçin.
   3. TIFF yığınlarının bulunduğu dizini ("StackGenerator.m" öğesinin varsayılan çıktısı "[Deney Adı] > [YYYY-AA-GG] >> yığınları" olmalıdır) "Giriş dizini" olarak girin.
   4. Bir çıkış dizini oluşturun ve yol adını "Çıktı dizini" olarak girin. "Dosya uzantısı" için varsayılan değer ".tif" olmalıdır; değilse, "Dosya uzantısı" olarak ".tif" girin.
   5. TrackMate'i yalnızca dizindeki dosyaların bir alt kümesinde çalıştırmak için, bunları dahil etmek için "Dosya adı şunu içerir"den sonraki giriş alanını kullanın. Aksi takdirde, bu alanı boş bırakın.
   6. "Kaydederken dizin yapısını koru"yu seçin.
   7. İstediğiniz ayarlara göre piksel cinsinden "Nokta yarıçapı", "Kalite eşiği", "Maksimum çerçeve boşluğu", "Maksimum bağlantı mesafesi" ve "Boşluk kapatma maksimum mesafesi" girin. 10x büyütmede HaCaT çekirdekleri için genellikle sırasıyla 3,5, 18, 2, 15 ve 40 kullanırız.
   8. Tamam'ı seçin. Bu komut dosyası, belirlenen çıktı dizinindeki her TIFF yığını için bir XML dosyası çıktısı vermelidir.
2. Alternatif olarak, Tinevez ve ^ark.13'te belirtilen protokole göre her TIFF yığını için FIJI'deki TrackMate eklentisini manuel olarak çalıştırın
   1. FIJI'de bir TIFF yığını açın ve menü çubuğunda Eklentiler >İzleme > TrackMate'i seçerek TrackMate eklentisini açın.
   2. Bir açılır pencere şu istemi görüntülerse: "Görünüşe göre bu görüntünün 1 zaman noktası var, ancak [zaman noktası sayısı] dilimleri var. Z ve T'yi değiştirmek istiyor musunuz?" sorusuna Evet'i seçin.
   3. TrackMate v4.0.1'de, "Tahmini blob çapı" (7.000x büyütmede HaCaT çekirdekleri için 10 piksel kullanıyoruz) ve eşik (18.000 kullanıyoruz, ancak bu, kullanılan mikroskoba ve Hoechst boyasının yoğunluğuna bağlı olarak değişecektir) dışındaki varsayılan ayarları kullanın.
   4. Optimize edilmiş parçacık algılamayı sağlamak ve blob çapı ve eşik ayarlarını gerektiği gibi ayarlamak için Önizleme işlevini kullanın.
   5. "Boşluk kapatma maksimum mesafesi" için, varsayılan ayarlar genellikle bazal HaCaT motilitesi için çalışır, ancak boşluk kapatma maksimum mesafesinin, motiliteyi artıran koşullar altında 40.0 piksele kadar artırılması gerekebilir.
   6. Hücre izlerinde minimum boşluklarla izlemenin optimize edildiğini görsel olarak onaylayın.
   7. Bir eylem seçin [sic] altında, Parçaları XML dosyasına aktar ve yürüt'ü seçin.
   8. Tüm TIFF yığınları için bu işlemi tekrarlayın.

5. Hareketlilik oranlarının ölçülmesi

NOT: Başarısız izleri kaldırmak ve tüm TrackMate çıktı dosyaları için motiliteyi ölçmek için sağlanan özel MATLAB komut dosyası "TrackMateAnalysis.m"i kullanın. Komut dosyası, çerçevenin dışına çıkan parçaları (konum izlemeleri varsayılan olarak tamsayılara dönüştürülür) ve belirlenen zaman noktasından daha az sayıda izlenen izleri kaldırır. Komut dosyası, çerçevenin dışına çıkan parçaları (konum izlemeleri varsayılan olarak tamsayılara dönüştürülür) ve tasarlanabilir bir zaman noktası sayısından daha az sayıda izlenen izleri kaldırır. Çıktı, tek tek hücreler ve bir görüntüleme bölgesindeki tüm hücreler için zaman noktası başına ortalama yer değiştirmedir. (Örnek çıktı: 'Output.mat')

1. Bu komut dosyasının, sağlanan "import_trackmate_xml.m." MATLAB işlevini gerektirdiğini unutmayın. 4. satırdaki "addpath" işleminden sonra bu işlevin yerel yolunu girin.
2. 7. satırda, konsolide çıktınıza dahil edilmek üzere bir parçacığın izlenmesi gereken minimum zaman noktası sayısını belirtin.
3. 12 ve 13. satırlarda, filtrelenmiş analize dahil edilmesi gereken kat edilen mesafe aralığını (piksel cinsinden) belirtin. Kat edilen tüm olası mesafeleri dahil etmek için, 0 ile görüntüleme alanınızın genişliği arasında bir aralık girin.
4. 14 ve 15. satırlarda, filtrelenmiş analize dahil edilmesi gereken yörünge aralığını (derece olarak) belirtin. Tüm olası yörüngeleri dahil etmek için 0 ile 360 arasında bir aralık girin.
5. Komut dosyasını, tüm TrackMate çıktı XML dosyalarını içeren klasörde çalıştırın.
   NOT: Komut dosyası, bu analizde oluşturulan tüm verileri içeren bir MATLAB hücre yapısı oluşturur ve kaydeder. Tables{1,:}, bu komut dosyası tarafından analiz edilen her görüntüleme sitesi için Trackmate çıktı XML dosyalarının adlarını listeler. Tablolar{2,:}, her bir zaman noktasındaki tüm tek hücreler için konumları (pikselleri), yer değiştirmeleri (pikseller) ve hareket açılarını (derece, 0° görüntüleme alanı içinde sağa doğru hareket yönünü gösterir) içeren bir altyapıdır. Ayrıca, tüm zaman noktalarında her hücre için kat edilen toplam mesafeyi (piksel), ortalama hareketliliği (piksel/zaman noktası), ortalama hareket açısını (derece) ve her hücre için ilk ve son zaman noktası arasındaki toplam hareket açısını içerir. Tabloların sırasıyla 3^{. ve 4. satırları}, her görüntüleme bölgesindeki tüm zaman noktalarındaki tüm hücreler için ortalama ve standart sapma motilite değerlerini (piksel/zaman noktası) içerir. Sırasıyla 5^{. ve 6. satırlar}, her görüntüleme bölgesindeki tüm zaman noktalarında tüm hücreler tarafından kat edilen toplam mesafe (piksel) için ortalama ve standart sapma değerlerini içerir. 7^{. ve 8. sıralar}, bir görüntüleme bölgesindeki tüm hücreler için ilk ve son zaman noktaları arasındaki toplam hareket açısı (derece) için ortalama ve standart sapma değerlerini içerir. Tablolar'ın 3-8 arası satırları, minimum zaman noktası izleme ölçütlerine uyan tüm hücreler için bu değerleri içerirken, 9-14 arasındaki satırlar, yalnızca kullanıcı tarafından belirtilen filtre ölçütlerini karşılayan hücreler için aynı değerleri içerir.

Sonuçlar

Analiz senaryomuzun güvenilir ve tutarlı olduğundan emin olmak için, HaCaT keratinositlerinin motilitesini üç bağımsız deneyde ölçtük. Hücre motilitelerinin standart sapması deneyler arasında değişken olsa da (muhtemelen HaCaT hücrelerinin birleşme ve mekanik uyaranlara duyarlılığı nedeniyle), ortalama motilitenin, iki kuyruklu bir öğrencinin t-testine göre replikasyonlar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar olmaksızın birden fazla deneyde tu...

Tartışmalar

Yukarıda açıklanan metodoloji ve analiz araçları, MATLAB kullanan ve minimum programlama deneyimi gerektiren HaCaT keratinositlerinin motilitesini ölçmek ve ölçmek için basit ve ölçeklenebilir bir araç sağlar. Bu protokol, hücre çekirdeklerinin en az 5 saat boyunca boyanmasını ve görüntülenmesini gerektirir. Veri toplama herhangi bir uygun mikroskopta gerçekleştirilebilirken, bu protokol, bir ImageXpress Micro XL mikroskobunda toplanan görüntüleri, tüm zaman no...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well flat clear bottom black polystyrine TC-treated microplates, individually wrapped, with lid, sterile	Corning	3603
Dulbecco's modified eagle medium (high D-glucose)	Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific	12800-082
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich Inc	F0926
Fluorobrite Dulbecco's modified eagle medium (high D-glucose, 3.7 g/L sodium bicarbonate, no L-glutamine, no phenol red)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	A18967-01
GlutaminePlus	R&D Systems Inc.	R90210
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate	Invitrogen/Thermo Fisher Scientific	H21492
Penicillin streptomycin	Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate buffered saline	Gibco/Thermo Fisher Scientific	14190-144