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요약

HaCaT 각질세포의 세포 운동성을 고처리량으로 측정하기 위한 이 프로토콜은 ImageJ 플러그인 TrackMate를 사용하여 세포핵의 이미지를 수집 및 처리하고 입자 추적을 수행하는 방법을 설명합니다.

초록

집단 세포 이동은 발달, 상처 치유 및 암 전이를 포함한 많은 기본적인 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 세포 운동성의 조절을 이해하려면 다양한 조건에서 쉽고 일관되게 측정할 수 있어야 합니다. 여기에서는 핵 염색을 사용하여 HaCaT 각질세포의 단세포 및 벌크 운동성을 측정하고 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법에는 TrackMate 출력 파일을 분석하여 단일 셀에서 변위, 운동성 속도 및 궤적 각도를 계산하고 이미징 사이트에 대한 대량으로 계산하기 위한 MATLAB 스크립트가 포함되어 있습니다. 이 운동성 분석 스크립트를 사용하면 TrackMate 데이터에서 세포 운동성을 빠르고 간단하며 확장 가능한 방식으로 분석할 수 있으며, 상피 세포의 운동성 조절을 식별하고 연구하는 데 광범위하게 사용될 수 있습니다. 또한 현미경에서 수집된 현미경 비디오를 재구성하고 ImageJ TrackMate 플러그인을 사용하여 대량으로 분석할 수 있는 TIF 스택으로 변환하기 위한 MATLAB 스크립트를 제공합니다. 이 방법론을 사용하여 HaCaT 각질세포에서 세포 운동성을 조절하는 데 있어 부착 접합부 및 액틴 세포골격 역학의 역할을 탐구함으로써 HaCaT 각질세포에서 α-카테닌 고갈 후 나타나는 운동성 증가에 Arp2/3 활성이 필요하다는 증거를 입증했습니다.

서문

상피 세포의 세포 운동성을 정확하고 즉각적으로 조절하는 것은 상처 치유와 상피층 보충에 매우 중요합니다. 운동성을 유지하지 못하면 배아 발달 및 상처 치유1 에 문제가 발생할 수 있으며, 과도한 운동성 신호전달은 암 전이의 주요 원인입니다2.

HaCaT 각질세포의 운동성 세포 조절에 대한 이해는 이러한 과정에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 여기에 요약된 절차는 단일 세포 또는 집단 수준에서 세포 운동성의 평균 크기에 대한 일관된 측정 및 계산을 제공합니다. 우리는 이 방법을 사용하여 유전적 섭동 또는 소분자 억제제 처리 후 HaCaT 각질세포의 운동성을 측정하여 운동성 속도를 조절하는 세포 신호를 이해했습니다. 제공된 MATLAB 스크립트는 각 셀에 대한 운동성의 평균 속도와 평균 방향을 모두 측정합니다.

집단 세포 운동성은 발달과 암 전이 모두에서 상피-중간엽 전이에 매우 중요합니다3. 세포는 접착(adhesion), 분극(polarization), 돌출(protusion), 수축(retraction)의 조정을 통해 운동성을 달성한다4. 이러한 과정은 동적 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)의 조정된 조절에 크게 의존합니다. PI3K 또는 다양한 수용체 티로신 키나아제의 다운스트림에서 Rac1 GTPase가 활성화되면 세포가 분극화되어 액틴 중합이 일어납니다5. 액틴 세포골격 역학(Actin cytoskeletal dynamics)은 이 GTPase 및 기타 Rho 매개 GTPase에 의해 조절되며, 이는 다양한 성장 인자의 다운스트림에 의해 활성화됩니다. 이러한 Rho 매개 GTPase는 액틴 분지화6을 자극하는 Arp2/3 복합체를 활성화합니다. 이러한 액틴 세포골격 역학(actin cytoskeleton dynamics)은 운동성의 또 다른 핵심 조절자인 세포간 접합(intercellular junctions)과 밀접한 관련이 있습니다. 우리는 특히 세포 사이에 강한 접착력을 형성하는 부착 연접(adherens junctions)이 어떻게 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)과 조화를 이루어 조직의 무결성을 유지하는지에 관심이 있습니다7.

우리는 이전에 shRNA에 매개된 α-catenin knockdown을 발현하는 HaCaT 각질세포가 non-targeting shRNA control8을 발현하는 HaCaT 각질세포보다 더 높은 운동성을 나타낸다는 것을 보여주었습니다. 우리는 α-카테닌 고갈 시 이러한 운동성 상승의 메커니즘을 더 깊이 이해하기 위해 우리가 개발한 운동성 분석 도구를 사용하고자 합니다. α-Catenin은 adherens junctions9의 필수 세포질 성분입니다. 그것은 단량체10,11로 결합하는 ß-catenin과의 상호 작용을 통해 부착 접합에 참여합니다. 그러나 α-catenin은 또한 부착 접합부에서 분리되어 Actin 필라멘트를 결합하고 묶는 homodimer를 형성할 수 있으며, 이는 Arp2/3 활성을 억제합니다10,11. α-카테닌은 ß-카테닌에 결합되어 있는 동안 액틴과 직접 상호작용하지 않지만, 빈쿨린에 결합함으로써 부착 접합부와 세포골격 사이의 조정을 촉진하거나 강화할 수 있으며, 이는 액틴 필라멘트12를 안정화시킵니다.

ImageJ용 TrackMate 플러그인은 세포핵을 추적하는 데 사용할 수 있는 입자 추적을 위한 잘 정립된 방법이지만, 여러 이미징 부위의 세포 운동성을 계산하기 위해 TrackMate 출력을 구문 분석, 분석 및 통합하는 데 사용할 수 있는 도구가 통합되지 않았으며 여러 프로그래밍 언어에 대한 전문 지식이 없는 사람들에게는 사용하기 어려웠습니다. Tinevez와 Herbert는 TrackMate 사용에 대한 입문서를 제공하지만, 평균 제곱 변위 해석 섹션에는 상당한 MATLAB 기술13이 필요합니다. 타임 랩스 현미경 비디오에서 운동성을 추출하는 기존 방법은 더 복잡한 3차원 분석을 제공하지만 더 많은 프로그래밍 전문 지식이 필요합니다14,15. 이전에 우리 연구실에서 개발한 세포 추적 및 운동성 분석 소프트웨어인 Pathfinder는 세포 이동 속도와 방향을 측정하지만 Windows 시스템에서만 실행 가능하며 제한적인 Java Runtime 환경16이 필요합니다. TrackMate는 신뢰할 수 있고 잘 문서화된 도구이기 때문에 MATLAB을 사용하여 대규모 2차원 TrackMate 데이터 세트를 생성, 분석 및 구성하기 위한 간단한 방법을 개발했습니다. 또한 이 스크립트는 추적된 세포가 이미징 부위를 벗어난 후 TrackMate 출력에서 때때로 발생하는 반복되는 정수 데이터 포인트를 제거하여 이러한 가짜 데이터 포인트를 포함하지 않고 높은 운동성 및/또는 방향성을 가진 세포를 분석에 포함할 수 있습니다. 또한 ImageXpress Micro XL에서 수집된 이미지를 TrackMate를 사용하여 대량으로 분석할 수 있는 TIFF 스택으로 재구성하기 위한 스크립트를 제공합니다.

이 프로토콜에서 세포는 96웰 이미징 플레이트에 파종됩니다. 세포가 플레이트 바닥에 부착될 수 있도록 충분한 시간을 허용한 후, Hoechst 핵 염색 및 운동성에 미치는 영향에 관심이 있는 작은 분자로 세포를 처리합니다. 5시간 이상의 시간 동안 세포핵의 이미지를 수집한 후 MATLAB을 사용하여 이미지 시퀀스를 배경 빼기 TIFF 스택으로 처리합니다. 이러한 TIFF 스택은 시점17에 걸쳐 각 개별 셀을 등록하고 추적하는 ImageJ TrackMate 플러그인을 사용하여 분석됩니다. 모든 이미징 부위에 대한 세포 트랙을 생성한 후 사용자 지정 MATLAB 스크립트를 사용하여 세포가 이미징 필드를 떠난 후 발생하는 스퓨리어스 데이터 포인트를 제거하고 각 이미징 부위의 평균 운동성을 계산합니다. 이 스크립트는 사용자가 지정한 최소 타임포인트 수에 대해서만 추적되는 셀을 분석하고 사용자가 전체 거리 및/또는 이동 방향별로 셀을 필터링할 수 있도록 합니다. 그 결과 각 세포에 대한 평균 변위, 평균 이동 방향, 전체 변위 및 전체 이동 방향이 생성되며, 이는 이미징 부위의 모든 세포에 대한 값의 벌크 평균을 계산하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 대규모 이미징 실험에서 대량으로 수행할 수 있으며, 이는 상대적으로 고처리량 운동성 분석에 적합합니다(그림 1).

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프로토콜

1. 세포 배양 및 이미징 플레이트 준비

  1. 가습 인큐베이터에서 37°C에서 세포 배양 배지(2mM L-글루타민, 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신 및 10%(v/v) 소 태아 혈청이 보충된 Dulbecco의 Modified Eagle's Medium)에서 HaCaT 세포를 배양합니다.
  2. 96웰 이미징 플레이트(예: 96웰 블랙 폴리스티렌 마이크로플레이트)에 웰당 원하는 수의 세포(5000 - 20,000 세포/웰 사용)를 시드합니다. 3개의 웰에 중간 크기(세포 없음)만 추가합니다.
  3. 플레이트를 완전히 평평한 표면에 20 - 30분 동안 놓아 세포가 균일한 공간 분포로 플레이트 바닥에 부착될 수 있도록 합니다.
  4. 플레이트를 가습된 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% 이산화탄소)로 4-6시간 동안 옮겨 세포가 플레이트 바닥에 완전히 부착되도록 합니다.
  5. 플레이트에서 배지를 제거하고 세포 배양 배지를 2 μg/mL Hoechst 염료(1 mg/mL 원액의 1:5000 희석)로 교체합니다.
  6. 플레이트를 가습된 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% 이산화탄소)에 2시간 동안 반환합니다.
  7. 각 웰에 90μL의 이미징 배지(2mM L-글루타민, 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신 및 10%(v/v) 소 태아 혈청이 보충된 페놀 레드가 없는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 추가하기 전에 웰당 100μL의 인산염 완충 식염수로 플레이트를 세 번 부드럽게 세척합니다.
  8. 소분자 억제제 또는 기타 효과제의 효과를 측정하는 경우, 이미징 직전에 세포를 처리하십시오.

2. 이미징

  1. 37°C의 가습된 환경 챔버와 5% 이산화탄소가 있는 현미경에서 10배 배율로 플레이트(매체 전용 웰 포함)를 이미지화합니다.
    참고: 이 프로토콜의 분석 스크립트는 Molecular Devices ImageXpress Micro XL 광시야 현미경에서 수집된 데이터에 대해 작성되었습니다.
  2. 실험에 필요한 시간 해상도에 따라 이미지를 수집합니다. 최상의 결과를 얻으려면 최소 5시간 동안 시간당 최소 4개의 타임포인트를 기록하십시오. 세포에 대한 저분자 억제제 또는 기타 perturbances의 효과를 측정하는 경우, 효과를 볼 것으로 예상되는 시간 이후 최소 5시간 동안 이미지를 촬영하십시오. 이를 위해 총 13시간 20분의 이미징 시간 동안 100개의 8분 시점을 이미징합니다.

3. 이미지 처리

  1. 제공된 사용자 지정 MATLAB 스크립트 "ImageReorganizer.m"을 사용하여 썸네일 이미지를 제거하고 이미지 파일을 시점이 아닌 순으로 재구성할 수 있습니다. ImageXpress는 "[실험 이름] > [YYYY-MM-DD] > [실행 번호] > Timepoint_[시점] > [이미지 파일]" 폴더 구성의 파일을 출력합니다. 이미지가 재구성되면 이 스크립트는 해당 시점의 미디어 전용 웰의 평균 및 가우스 흐릿한 이미지를 사용하여 각 시점의 이미지에 대한 배경 빼기를 수행합니다. 그런 다음 이 스크립트는 배경에서 뺀 이미지를 각 이미징 사이트에 대한 TIFF 스택으로 구성합니다. 각 TIFF 스택의 이름은 "[Well]_[Site].tif"로 지정됩니다.
    1. 실험이 하루 이상 연장된 경우 모든 "Timepoint_[Timepoint]" 하위 폴더가 동일한 "[Run number]" 폴더에 있도록 모든 날짜에 대한 [Run number] 폴더의 내용을 결합합니다.
    2. 참고로, 이 스크립트에는 MATLAB 함수 int2strz18이 필요합니다. 2행에서 "addpath" 뒤에 이 함수에 대한 로컬 경로를 입력합니다.
    3. 미디어 전용 웰의 행을 9행에서 "emptyrows"로 입력하고 10행에서 열을 "emptycolumns"로 입력합니다.
    4. 실험 우물의 행을 15행에 "rows"로 입력하고 16행에 열을 "columns"로 입력합니다. 17행에 웰당 이미징 사이트의 수와 "사이트"를 입력합니다.
    5. MATLAB의 경로 표시줄에 "[Run number]" 폴더의 경로 이름을 입력하고 스크립트를 실행합니다.

4. 세포 추적

참고: TrackMate는 Tinevez et al.17 의 Run_TrackMate_Headless.groovy 스크립트의 약간 수정된 버전을 사용하여 지정된 디렉토리의 모든 TIFF 스택에서 실행하거나 각 개별 TIFF 스택에 대해 수동으로 수행할 수 있습니다. 몇 가지 샘플 TIFF 스택에서 FIJI를 수동으로 실행하여 해당 매개변수를 사용하여 모든 TIFF 스택에서 Groovy 스크립트를 실행하기 전에 올바른 매개변수를 사용하고 있는지 확인합니다.

  1. 폴더의 모든 TIFF 스택에 대해 FIJI에서 TrackMate 플러그인을 실행하려면 제공된 프로토콜에 따라 Tinevez et al.17 의 Run_TrackMate_Headless.groovy 스크립트를 다운로드하여 사용하십시오. 우리는 이 스크립트의 약간 수정된 버전을 사용하여 입력 파일과 출력 파일 이름을 모두 쉽게 일괄 처리하고 입력을 위해 하나의 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 모든 매개변수를 입력할 수 있습니다. 다음은 TrackMate_Headless_Mod.groovy로 제공되는 이 수정된 스크립트를 사용하는 방법에 대한 자세한 지침입니다.
    1. 파일>열기를 선택한 다음 TrackMate_Headless_Mod.groovy 스크립트의 위치로 이동하여 FIJI에서 스크립트를 엽니다.
    2. 실행을 선택합니다.
    3. TIFF 스택이 있는 디렉토리("StackGenerator.m"의 기본 출력은 "[실험 이름] > [YYYY-MM-DD] >> 스택이어야 함)를 "입력 디렉토리"로 입력합니다.
    4. 출력 디렉토리를 만들고 해당 경로 이름을 "출력 디렉토리"로 입력합니다. "파일 확장명"의 기본값은 ".tif"이어야 하며, 그렇지 않은 경우 "파일 확장명"으로 ".tif"를 입력합니다.
    5. 디렉터리에 있는 파일의 하위 집합에서만 TrackMate를 실행하려면 "파일 이름 포함" 뒤의 입력 공간을 사용하여 해당 파일을 포함합니다. 그렇지 않으면 해당 공간을 비워 둡니다.
    6. "저장할 때 디렉토리 구조 유지"를 선택하십시오.
    7. 원하는 설정에 따라 "스폿 반경", "품질 임계값", "최대 프레임 갭", "최대 연결 거리" 및 "갭 닫기 최대 거리"를 픽셀 단위로 입력합니다. 일반적으로 10배 배율에서 HaCaT 핵에 대해 각각 3.5, 18, 2, 15 및 40을 사용합니다.
    8. 확인을 선택합니다. 이 스크립트는 지정된 출력 디렉터리의 각 TIFF 스택에 대한 XML 파일을 출력해야 합니다.
  2. 또는 Tinevez et al.13에 설명된 프로토콜에 따라 각 TIFF 스택에 대해 FIJI에서 TrackMate 플러그인을 수동으로 실행합니다.
    1. FIJI에서 TIFF 스택을 열고 메뉴 표시줄에서 Plugins >Tracking > TrackMate 를 선택하여 TrackMate 플러그인을 엽니다.
    2. 팝업 창에 "이 이미지에는 1개의 타임포인트가 있지만 [number of timepoints] 슬라이스가 있는 것 같습니다. Z와 T를 바꾸시겠습니까?" 예를 선택합니다.
    3. TrackMate v4.0.1에서는 "예상 블롭 직경"(10배 배율에서 HaCaT 핵에 대해 7.000픽셀 사용) 및 임계값(18.000을 사용하지만 사용된 현미경 및 Hoechst 염료의 강도에 따라 다름)을 제외한 기본 설정을 사용합니다.
    4. 미리보기 기능을 사용하여 최적화된 입자 감지를 보장하고 필요에 따라 블롭 직경 및 임계값 설정을 조정할 수 있습니다.
    5. "갭 클로징 최대 거리"의 경우 기본 설정은 기본 HaCaT 운동성에 대해 작동하는 경우가 많지만 운동성을 향상시키는 조건에서는 갭 클로징 최대 거리를 최대 40.0픽셀까지 늘려야 할 수 있습니다.
    6. 세포 추적의 간격을 최소화하면서 추적이 최적화되었는지 육안으로 확인합니다.
    7. Select a action [sic]에서 Export tracks to XML file and execute(트랙을 XML 파일로 내보내기 및 실행)를 선택합니다.
    8. 모든 TIFF 스택에 대해 반복합니다.

5. 운동성 속도의 정량화

참고: 제공된 사용자 정의 MATLAB 스크립트 "TrackMateAnalysis.m"을 사용하여 실패한 트레이스를 제거하고 모든 TrackMate 출력 파일의 운동성을 정량화합니다. 이 스크립트는 프레임 밖으로 이동하는 추적(위치 추적이 기본적으로 정수로 설정됨)과 지정된 시간 지점 수보다 적게 추적되는 추적을 제거합니다. 이 스크립트는 프레임 밖으로 이동하는 추적(위치 추적이 기본적으로 정수로 설정됨)과 지정 가능한 시점 수보다 적은 시간 동안 추적되는 추적을 제거합니다. 출력은 이미징 부위의 개별 세포와 모든 세포에 대한 시점당 평균 변위입니다. (출력 예: 'Output.mat')

  1. 이 스크립트에는 제공된 MATLAB 함수 "import_trackmate_xml.m"이 필요합니다. 4행에서 "addpath" 뒤에 이 함수에 대한 로컬 경로를 입력합니다.
  2. 라인 7에서 통합 출력에 포함되기 위해 입자를 추적해야 하는 최소 시점 수를 표시합니다.
  3. 12행과 13행에서 필터링된 분석에 포함되어야 하는 이동 거리의 범위(픽셀 단위)를 나타냅니다. 가능한 모든 이동 거리를 포함하려면 0에서 이미징 필드의 너비까지의 범위를 입력하십시오.
  4. 14행과 15행에서 필터링된 분석에 포함되어야 하는 궤적의 범위(도 단위)를 나타냅니다. 가능한 모든 궤적을 포함하려면 0에서 360 사이의 범위를 입력합니다.
  5. 모든 TrackMate 출력 XML 파일이 포함된 폴더에서 스크립트를 실행합니다.
    참고: 이 스크립트는 이 분석에서 생성된 모든 데이터를 포함하는 MATLAB 셀 구조를 생성하고 저장합니다. Tables{1,:}에는 이 스크립트에서 분석한 각 이미징 사이트에 대한 Trackmate 출력 XML 파일의 이름이 나열되어 있습니다. Tables{2,:}는 각 시점에서 모든 단일 셀에 대한 위치(픽셀), 변위(픽셀) 및 이동각(도, 0°는 이미징 부위 내에서 오른쪽 이동 방향을 나타냄)을 포함하는 하위 구조입니다. 또한 모든 시점에서 각 셀에 대한 총 이동 거리(픽셀), 평균 운동성(픽셀/시점), 평균 이동 각도(도) 및 각 셀의 첫 번째 시점과 마지막 시점 사이의 총 이동 각도도 포함됩니다. 테이블의 3번째 및 4번째 행에는 각각 각 이미징 부위의 모든 시점에 걸쳐 모든 셀에 대한 평균 및 표준 편차 운동성 값(픽셀/시점)이 포함되어 있습니다. 5번째 및 6번째 행에는 각각 각 이미징 부위의 모든 시점에 걸쳐 모든 셀이 이동한 총 거리(픽셀)에 대한 평균 및 표준 편차 값이 포함되어 있습니다. 7번째 및 8번째 행에는 이미징 부위의 모든 세포에 대한 첫 번째 시점과 마지막 시점 사이의 전체 이동 각도(도)에 대한 평균 및 표준 편차 값이 포함되어 있습니다. 테이블의 3-8행에는 최소 타임포인트 추적 기준을 충족하는 모든 셀에 대한 이러한 값이 포함되어 있는 반면, 9-14행에는 동일한 값이 포함되지만 사용자가 지정한 필터 조건을 충족하는 셀에 대해서만 포함됩니다.

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결과

당사의 분석 스크립트가 신뢰할 수 있고 일관성이 있는지 확인하기 위해 세 가지 독립적인 실험에서 HaCaT 각질 세포의 운동성을 측정했습니다. 세포 운동성의 표준 편차는 실험마다 차이가 있지만(아마도 융합 및 기계적 자극에 대한 HaCaT 세포의 민감성 때문일 수 있음), 쌍꼬리 학생의 t-검정에 따르면 반복 간에 통계적으로 유의미한 차이 없이 평균 운동성이 여러 실험에...

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토론

위에서 설명한 방법론 및 분석 툴은 MATLAB을 사용하며 최소한의 프로그래밍 경험만 있으면 되는 HaCaT 각질세포의 운동성을 측정하고 정량화할 수 있는 간단하고 확장 가능한 수단을 제공합니다. 이 프로토콜은 세포핵을 최소 5시간 동안 염색하고 이미지화할 것을 요구합니다. 데이터 수집은 모든 적절한 현미경에서 수행할 수 있지만, 이 프로토콜은 ImageXpress Micro XL 현미경...

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공개

X.L.과 University of Colorado Boulder는 치료제를 위한 HDAC 억제제 개발에 재정적 이해관계를 가지고 있으며 OnKure의 지분을 소유하고 있습니다. X.L.은 콜로라도 볼더 대학교(University of Colorado Boulder)로부터 독점 HDAC 억제제에 대한 라이선스를 취득한 OnKure의 공동 창립자이자 이사회 구성원입니다. OnKure는 이 연구의 실험 설계나 자금 지원에 관여하지 않습니다.

감사의 말

Daniel Messenger, Lewis Baker, Douglas Chapnick, Adrian Ramirez, Quanbin Xu 및 Liu 및 Bortz 연구소의 다른 구성원들의 통찰력과 조언에 감사드립니다. MATLAB에 대한 전문 지식을 공유해 주시고 XML import를 위한 함수를 작성해 주신 Jian Tay에게 감사드립니다. 현미경 검사 및 이미징 지원을 제공해 주신 BioFrontiers Advanced Light Microscopy Core의 Joseph Dragavon에게 감사드립니다. 세포 배양 지원 및 세포 배양 핵심 시설의 Theresa Nahreini와 Nicole Kethley에게 감사드립니다. 이 연구는 국립보건원(National Cancer Institute)과 국립보건원(National Institutes of Health, R01AR068254)의 관절염 및 근골격 및 피부질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)의 보조금으로 지원되었으며, X. L. 및 국립일반의학연구소(NIGMS)의 R01GM126559, D.B. 및 X.L.G.E.W. 및 E.N.B.는 NIGMS(T32GM08759)의 박사 전 교육 보조금의 지원을 받았습니다. ImageXpress Micro XL은 National Center for Research Resources(S10 RR026680)의 지원을 받았습니다. FACSAria는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, S10OD021601)의 지원을 받았습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat clear bottom black polystyrine TC-treated microplates, individually wrapped, with lid, sterileCorning3603
Dulbecco's modified eagle medium (high D-glucose)Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific12800-082
Fetal bovine serumSigma-Aldrich IncF0926
Fluorobrite Dulbecco's modified eagle medium (high D-glucose, 3.7 g/L sodium bicarbonate, no L-glutamine, no phenol red)Gibco/Thermo Fisher ScientificA18967-01
GlutaminePlusR&D Systems Inc.R90210
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrateInvitrogen/Thermo Fisher ScientificH21492
Penicillin streptomycinLife Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate buffered salineGibco/Thermo Fisher Scientific14190-144

참고문헌

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  17. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  18. Vargas Aguilera, C. A. int2strz.m. MATLAB Commons. , (2016).

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