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要約

HaCaTケラチノサイトにおける細胞運動性のハイスループット測定のためのこのプロトコルでは、細胞核の画像を収集および処理する方法、およびImageJプラグインTrackMateを使用して粒子追跡を実行する方法について説明します。

要約

集団細胞移動は、発生、創傷治癒、がん転移など、多くの基本的な生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。細胞の運動性の制御を理解するためには、さまざまな条件下で簡単かつ一貫して測定できなければなりません。ここでは、核染色を使用してHaCaTケラチノサイトの単一細胞およびバルク運動性を測定および定量化する方法について説明します。この方法には、TrackMate 出力ファイルを解析して、イメージング部位の単一セルおよびバルクの変位、運動率、軌道角度を計算するための MATLAB スクリプトが含まれています。この運動性解析スクリプトは、TrackMateデータからの細胞運動率の迅速、簡単、スケーラブルな解析を可能にし、上皮細胞の運動性制御の同定と研究に広く使用することができます。また、顕微鏡で収集した顕微鏡ビデオを再編成してTIFスタックに変換するためのMATLABスクリプトも提供しており、ImageJ TrackMateプラグインを使用して一括で解析できます。この方法論を用いて、HaCaTケラチノサイトの細胞運動性調節におけるアドヘレンス結合とアクチン細胞骨格動態の役割を探ることで、HaCaTケラチノサイトのα-カテニン枯渇後に見られる運動性の上昇にはArp2/3活性が必要であるという証拠を実証しました。

概要

上皮細胞における細胞運動性の正確で応答性の高い制御は、創傷治癒と上皮層の補充に不可欠です。運動性を維持できないと、胚発生や創傷治癒に問題が生じる可能性があり1 、運動性シグナル伝達の過剰ががん転移の主な原因です2。

HaCaTケラチノサイトにおける運動性の細胞制御を理解することは、これらのプロセスに関する重要な洞察を提供します。ここで概説する手順は、単一細胞レベルまたは集団レベルでの細胞運動性の平均の大きさの一貫した測定と計算を提供します。この方法を使用して、遺伝的摂動または低分子阻害剤による処理後のHaCaTケラチノサイトの運動性を測定し、運動速度を制御する細胞シグナル伝達を理解しました。提供された MATLAB スクリプトは、各セルの平均速度と運動の平均方向の両方を測定します。

集団細胞の運動性は、発生とがん転移の両方における上皮間葉系移行にとって重要です3。細胞は、接着、分極、突出、および収縮の協調を通じて運動性を達成します4。これらのプロセスは、動的アクチン細胞骨格の協調制御に大きく依存しています。PI3Kまたはさまざまな受容体チロシンキナーゼの下流にあるRac1 GTPaseの活性化により、細胞が分極し、アクチン重合が起こります5。アクチン細胞骨格動態は、このGTPアーゼや他のRho媒介性GTPアーゼによって制御されており、これらはさまざまな成長因子の下流によって活性化されます。これらのRho媒介性GTPアーゼは、アクチン分岐を刺激するArp2/3複合体を活性化します6。これらのアクチン細胞骨格のダイナミクスは、運動性の別の重要な調節因子である細胞間接合と密接に関連しています。特に、細胞間に強い接着を形成する接着結合がアクチン細胞骨格とどのように協調して組織の完全性を維持しているかに関心があります7。

私たちは以前に、shRNAを介したα-カテニンノックダウンを発現するHaCaTケラチノサイトが、非標的shRNAコントロールを発現する細胞よりも高い運動速度を示すことを示しました8。私たちは、開発した運動性解析ツールを用いて、α-カテニンの枯渇によるこの運動性上昇のメカニズムをさらに理解したいと考えています。α-カテニンは、接着体ジャンクション9の必須の細胞質成分である。それは、モノマー10,11として結合するβ-カテニンとの相互作用を通じて、付着結合に関与します。しかし、α-カテニンは、接着結合から解離してアクチンフィラメントに結合して束ねるホモ二量体を形成することもでき、これによりArp2/3の活性が阻害されます10,11。α-カテニンは、β-カテニンに結合している間はアクチンと直接相互作用しないが、ビンキュリンに結合することにより、付着結合と細胞骨格との間の調整を促進または強化し、アクチンフィラメントを安定化させる可能性がある12。

ImageJ 用の TrackMate プラグインは、細胞核の追跡に使用できる粒子追跡の確立された方法ですが、TrackMate 出力を解析、分析、統合して複数のイメージング部位の細胞運動性を計算するための利用可能なツールは統合されておらず、複数のプログラミング言語の専門知識がない人にとっては使用が難しいことがわかりました。Tinevez と Herbert は TrackMate の使用に関する入門書を提供していますが、平均二乗変位解析のセクションではかなりの MATLAB スキルが必要です13。タイムラプス顕微鏡ビデオから運動率を抽出する既存の方法は、より複雑な三次元分析を提供しますが、より多くのプログラミングの専門知識が必要です14,15。パスファインダーは、以前に私たちの研究室で開発された細胞追跡および運動性分析ソフトウェアであり、細胞の移動速度と方向を測定しますが、Windowsマシンでのみ実行可能であり、制限されたJavaランタイム環境が必要です16。TrackMate は非常に信頼性が高く、十分に文書化されたツールであるため、MATLAB を使用して大規模な 2 次元 TrackMate データセットを生成、解析、整理するための簡単な方法を開発しました。また、このスクリプトは、追跡された細胞がイメージング部位を横切った後にTrackMate出力で発生することがある繰り返しの整数データポイントも削除し、これらのスプリアスデータポイントを含めることなく、運動性や方向性の高い細胞を解析に含めることができます。また、ImageXpress Micro XLで収集した画像をTIFFスタックに再編成し、TrackMateを使用して一括で分析するためのスクリプトも提供しています。

このプロトコルでは、細胞を96ウェルイメージングプレートに播種します。細胞がプレートの底部に付着するのに十分な時間を確保した後、Hoechst核染色と運動性への影響が関心のある小分子で細胞を治療します。5時間以上にわたって細胞核の画像を収集し、その後、MATLABを使用して画像シーケンスをバックグラウンド減算TIFFスタックに処理します。これらのTIFFスタックは、ImageJ TrackMateプラグインを使用して分析され、各セルをまたいで個々のセルを登録および追跡する17。すべてのイメージング部位の細胞トラックを生成した後、カスタム MATLAB スクリプトを使用して、細胞がイメージングフィールドから離れた後に発生する偽のデータポイントを削除し、各イメージング部位の平均運動率を計算します。このスクリプトは、ユーザーが指定した最小数のタイムポイントで追跡されるセルのみを解析し、ユーザーは全体の距離や移動方向でセルをフィルタリングできます。その結果、各セルの平均変位、平均移動方向、全体の変位、および全体的な移動方向が算出され、イメージング部位内のすべてのセルについてこれらの値の一括平均を計算するために使用されます。このプロトコルは、大規模なイメージング実験で一括して実行できるため、比較的ハイスループットな運動性解析に適しています(図1)。

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プロトコル

1. 細胞培養とイメージングプレートの調製

  1. 加湿インキュベーター内の37°Cおよび5%二酸化炭素で、細胞培養培地(2 mM L-グルタミン、100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、および10%(v/v)ウシ胎児血清を添加した細胞培養培地)でHaCaT細胞を培養します。
  2. ウェルあたりの細胞数(5000〜20,000細胞/ウェルを使用)を、96ウェルの黒色ポリスチレンマイクロプレートなどの96ウェルイメージングプレートにシードします。3つのウェルに、培地のみ(細胞なし)を加えます。
  3. プレートを完全に平らな面に20〜30分間置いて、細胞が均一な空間分布でプレートの底に付着できるようにします。
  4. プレートを加湿した細胞培養インキュベーター(37°C、5%二酸化炭素)に4〜6時間移し、細胞がプレートの底部に完全に付着することを確認します。
  5. プレートから培地を取り出し、2 μg/mL Hoechst色素(1 mg/mLストック溶液を1:5000に希釈)を入れた細胞培養培地と交換します。
  6. プレートを加湿細胞培養インキュベーター(37°C、5%二酸化炭素)に2時間戻します。
  7. ウェルあたり100 μLのリン酸緩衝生理食塩水でプレートを3回穏やかに洗浄してから、90 μLのイメージング培地(フェノールレッドフリーのダルベッコ修正イーグルス培地に2 mM L-グルタミン、100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、および10%(v / v)ウシ胎児血清)を各ウェルに加えます。
  8. 低分子阻害剤やその他のエフェクターの効果を測定する場合は、イメージングの直前に細胞を治療してください。

2. イメージング

  1. プレート(培地のみのウェルを含む)を、37°C、5%の二酸化炭素の加湿環境チャンバーを備えた顕微鏡で10倍の倍率でイメージングします。
    注:このプロトコルの解析スクリプトは、Molecular Devices ImageXpress Micro XL広視野顕微鏡で収集されたデータ用に書かれています。
  2. 実験に必要な時間分解能に従って画像を収集します。最良の結果を得るには、1時間に少なくとも4つのタイムポイントを少なくとも5時間記録します。低分子阻害剤やその他の摂動が細胞に及ぼす影響を測定する場合は、効果が見られると予想される時間から少なくとも5時間後に画像化してください。私たちの目的のために、100の8分間のタイムポイントを画像化し、合計イメージング時間は13時間20分です。

3. 画像処理

  1. 付属のカスタムMATLABスクリプト「ImageReorganizer.m」を使用して、サムネイル画像を削除し、画像ファイルを時間的ではなく適切に再編成します。ImageXpress は、「[実験名] > [YYYY-MM-DD] > [実行番号] > Timepoint_ [Timepoint] > [Image files]」というフォルダ構成のファイルを出力します。画像が再編成されると、このスクリプトは、その時点のメディア専用ウェルの平均画像とガウスぼやけた画像を使用して、各時点の画像に対して背景減算を実行します。次に、このスクリプトは、背景から差し引かれた画像を各イメージング サイトの TIFF スタックに整理します。各 TIFF スタックには "[Well]_[Site].tif という名前が付けられます。
    1. 実験が1日以上にわたる場合は、すべての日の[実行番号]フォルダの内容を結合して、すべての「Timepoint_[Timepoint]」サブフォルダが同じ「[実行番号]」フォルダに入るようにします。
    2. このスクリプトには MATLAB 関数 int2strz18 が必要であることに注意してください。この関数へのローカルパスを、2行目の「addpath」の後に入力します。
    3. メディア専用ウェルの行を 9 行目に "emptyrows" として入力し、10 行目に列を "emptycolumns" として入力します。
    4. 実験用ウェルの行を 15 行目に "rows" として入力し、列を 16 行目に "columns" として入力します。17行目に「sites」とともにウェルあたりのイメージングサイト数を入力します。
    5. 「[実行番号]」フォルダのパス名をMATLABのパスバーに入力し、スクリプトを実行します。

4. 細胞追跡

注:TrackMateは、Tinevez et al.17 のRun_TrackMate_Headless.groovyスクリプトのわずかに変更されたバージョンを使用して、指定されたディレクトリ内のすべてのTIFFスタックで実行することも、個々のTIFFスタックごとに手動で実行することもできます。いくつかのサンプル TIFF スタックで FIJI を手動で実行して、正しいパラメーターを使用していることを確認してから、これらのパラメーターを使用してすべての TIFF スタックで Groovy スクリプトを実行します。

  1. フォルダ内のすべてのTIFFスタックに対してFIJIでTrackMateプラグインを実行するには、Tinevez et al.17 からRun_TrackMate_Headless.groovyスクリプトをダウンロードして使用してください。このスクリプトを少し変更したバージョンを使用しているため、入力ファイルと出力ファイル名の両方を簡単にバッチ処理し、入力用の1つのグラフィカルユーザーインターフェイスを使用してすべてのパラメーターを入力できます。以下は、この変更されたスクリプトの使用に関する詳細な手順です。このスクリプトは、ここでは TrackMate_Headless_Mod.groovy として提供されています。
    1. FIJI でスクリプトを開くには、[ File>Open ] を選択し、TrackMate_Headless_Mod.groovy スクリプトの場所に移動します。
    2. [実行] を選択します。
    3. 「入力ディレクトリ」として、TIFFスタックが配置されているディレクトリ(「StackGenerator.m」のデフォルト出力は「[実験名]> [YYYY-MM-DD]>>スタック」)を入力します。
    4. 出力ディレクトリを作成し、そのパス名を「出力ディレクトリ」として入力します。「ファイル拡張子」のデフォルトは「.tif;」でない場合は、「ファイル拡張子」として「.tif」を入力します。
    5. ディレクトリ内のファイルのサブセットに対してのみTrackMateを実行するには、「ファイル名に含まれるもの」の後の入力スペースを使用してそれらを含めます。それ以外の場合は、そのスペースを空白のままにします。
    6. 「保存時にディレクトリ構造を保持する」を選択します。
    7. 「スポット半径」、「品質しきい値」、「最大フレームギャップ」、「リンク最大距離」、「ギャップを閉じる最大距離」を任意の設定に従ってピクセル単位で入力します。通常、HaCaT核にはそれぞれ3.5、18、2、15、40を10倍の倍率で使用します。
    8. [OK] を選択します。このスクリプトは、指定された出力ディレクトリにある各 TIFF スタックの XML ファイルを出力する必要があります。
  2. または、Tinevez et al.13で概説されているプロトコルに従って、各TIFFスタックに対してFIJIでTrackMateプラグインを手動で実行します。
    1. FIJIでTIFFスタックを開き、メニューバーでPluginsを選択し、TrackMateプラグインを開きます >Tracking>TrackMate 。
    2. ポップアップウィンドウに「この画像には1つのタイムポイントがありますが、[タイムポイントの数]スライスがあります。Z と T を入れ替えますか?」 [ はい] を選択します。
    3. TrackMate v4.0.1では、「推定ブロブ直径」(HaCaT原子核を10倍の倍率で7.000ピクセルを使用)としきい値(18.000を使用しますが、これは使用する顕微鏡とHoechst色素の強度によって異なります)以外のデフォルト設定を使用します。
    4. プレビュー機能を使用して、パーティクル検出を最適化し、必要に応じてブロブの直径としきい値の設定を調整します。
    5. 「ギャップを閉じる最大距離」の場合、デフォルト設定は基礎的なHaCaTの運動性に機能することがよくありますが、運動性を高める条件下では、ギャップを閉じる最大距離を最大40.0ピクセルまで増やす必要がある場合があります。
    6. 細胞トレースのギャップを最小限に抑えてトラッキングが最適化されていることを視覚的に確認します。
    7. [アクションの選択 [原文ママ]で、[トラックをXMLファイルにエクスポートして実行]を選択します。
    8. すべての TIFF スタックに対して繰り返します。

5. 運動率の定量化

注: 付属のカスタム MATLAB スクリプト "TrackMateAnalysis.m" を使用して、失敗したトレースを削除し、すべての TrackMate 出力ファイルの運動性を定量化します。このスクリプトは、フレーム外に移動するトラック (位置トレースのデフォルトは整数) と、指定された数のタイムポイントよりも短い時間しか追跡されないトラックを削除します。このスクリプトは、フレーム外に移動するトラック (位置トレースのデフォルトは整数) と、指定された数のタイムポイントよりも短い時間追跡されるトラックを削除します。出力は、イメージング部位の個々の細胞およびすべての細胞の時点あたりの平均変位です。(出力例: 'Output.mat')

  1. このスクリプトには、提供されている MATLAB 関数 "import_trackmate_xml.m" が必要であることに注意してください。この関数へのローカルパスを4行目の「addpath」の後に入力します。
  2. 7 行目に、統合出力に含めるためにパーティクルを追跡する必要がある最小時点数を示します。
  3. 12 行目と 13 行目には、フィルター処理された分析に含める必要がある移動距離の範囲 (ピクセル単位) を示します。移動可能なすべての距離を含めるには、0 からイメージングフィールドの幅までの範囲を入力します。
  4. 14 行目と 15 行目には、フィルター処理された解析に含める軌道の範囲 (度単位) を示します。可能なすべての軌跡を含めるには、0 から 360 の範囲を入力します。
  5. すべてのTrackMate出力XMLファイルを含むフォルダでスクリプトを実行します。
    注: このスクリプトは、この解析で生成されたすべてのデータを含む MATLAB セル構造体を生成して保存します。Tables{1,:} は、このスクリプトによって解析された各イメージング サイトの Trackmate 出力 XML ファイルの名前を一覧表示します。Tables{2,:} は、各時点におけるすべての単一セルの位置 (ピクセル)、変位 (ピクセル)、および移動角度 (度、0° はイメージング サイト内の移動方向を右向きに示す) を含むサブストラクチャーです。また、移動した合計距離 (ピクセル)、平均運動性 (ピクセル/タイムポイント)、すべてのタイムポイントにわたる各セルの平均移動角度 (度)、および各セルの最初と最後のタイムポイント間の移動角度の合計も含まれます。テーブルの 3行目と 4行目には、それぞれ、各イメージング サイトのすべての時点にわたるすべての細胞の平均運動性値と標準偏差運動性値 (ピクセル/時間点) が含まれています。5行目と6行目には、それぞれ、各イメージングサイトのすべての時点におけるすべてのセルによる移動距離(ピクセル)の合計の平均値と標準偏差の値が含まれています。7行目と 8行目には、イメージング サイト内のすべてのセルの最初と最後の時点の間の全体的な移動角度 (度) の平均値と標準偏差の値が含まれています。テーブルの行 3 から 8 には、最小タイムポイント追跡基準を満たすすべてのセルに対してこれらの値が含まれていますが、行 9 から 14 には同じ値が含まれていますが、ユーザーが指定したフィルター条件を満たすセルに対してのみ含まれています。

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結果

解析スクリプトの信頼性と一貫性を確保するために、3つの独立した実験でHaCaTケラチノサイトの運動性を測定しました。細胞の運動性の標準偏差は実験間で変動する一方で(おそらくHaCaT細胞のコンフルエンスと機械的刺激に対する感受性による)、平均運動性は複数の実験で一貫して再現され、両側のスチューデントのt検定によれば、反復間で統計的に有意な差がな?...

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ディスカッション

上記の方法論と解析ツールは、MATLAB を使用し、最小限のプログラミング経験で HaCaT ケラチノサイトの運動性を測定および定量化するための簡単でスケーラブルな手段を提供します。このプロトコルでは、細胞の核を少なくとも5時間にわたって染色および画像化する必要があります。データ収集は任意の適切な顕微鏡で実行できますが、このプロトコルは、ImageXpress ...

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開示事項

X.L.とコロラド大学ボルダー校は、治療薬用HDAC阻害剤の開発に金銭的関心を持ち、OnKureの株式を保有しています。X.L.は、コロラド大学ボルダー校から独自のHDAC阻害剤をライセンス供与したOnKureの共同設立者であり、取締役会のメンバーです。OnKureは、この研究の実験計画にも資金提供にも関与していません。

謝辞

Daniel Messenger、Lewis Baker、Douglas Chapnick、Adrian Ramirez、Quanbin Xu、およびLiu研究室とBortz研究室の他のメンバーの洞察とアドバイスに感謝します。MATLAB の専門知識を共有し、XML インポート用の関数を作成した Jian Tay に感謝します。BioFrontiers Advanced Light Microscopy CoreのJoseph Dragavon氏には、顕微鏡検査とイメージングのサポートをいただき、ありがとうございました。細胞培養コアファシリティのTheresa Nahreini氏とNicole Kethley氏には、細胞培養のサポートに感謝します。この研究は、国立がん研究所および国立衛生研究所(R01AR068254)の国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所からの助成金によって支援され、X.L.および国立総合医科学研究所(NIGMS)からのR01GM126559、D.B.およびX.L.G.E.W.およびE.N.B.からの博士課程前研修助成金(T32GM08759)によって支援されました。ImageXpress Micro XL は、National Center for Research Resources (S10 RR026680) の支援を受けました。FACSAriaは、国立衛生研究所(S10OD021601)の支援を受けました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat clear bottom black polystyrine TC-treated microplates, individually wrapped, with lid, sterileCorning3603
Dulbecco's modified eagle medium (high D-glucose)Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific12800-082
Fetal bovine serumSigma-Aldrich IncF0926
Fluorobrite Dulbecco's modified eagle medium (high D-glucose, 3.7 g/L sodium bicarbonate, no L-glutamine, no phenol red)Gibco/Thermo Fisher ScientificA18967-01
GlutaminePlusR&D Systems Inc.R90210
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrateInvitrogen/Thermo Fisher ScientificH21492
Penicillin streptomycinLife Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate buffered salineGibco/Thermo Fisher Scientific14190-144

参考文献

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  4. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling networks that regulate cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
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