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  • 材料
  • 参考文献
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摘要

该协议用于高通量测量 HaCaT 角质形成细胞中的细胞运动，描述了收集和处理细胞核图像以及使用 ImageJ 插件 TrackMate 进行粒子跟踪的方法。

摘要

集体细胞迁移在许多基本生物过程中起着关键作用，包括发育、伤口愈合和癌症转移。要了解细胞运动的调节，我们必须能够在不同条件下轻松一致地测量它。在这里，我们描述了一种使用核染色测量和量化 HaCaT 角质形成细胞的单细胞和大量运动的方法。该方法包括一个 MATLAB 脚本，用于分析 TrackMate 输出文件，以计算单个细胞中的位移、运动速率和轨迹角，并批量计算成像站点的位移、运动速率和轨迹角。该运动分析脚本允许对 TrackMate 数据的细胞运动率进行快速、直接和可扩展的分析，并可广泛用于识别和研究上皮细胞的运动调节。我们还提供了一个 MATLAB 脚本，用于重新组织在显微镜上收集的显微镜视频并将其转换为 TIF 堆栈，可以使用 ImageJ TrackMate 插件批量分析。使用这种方法来探索粘附连接和肌动蛋白细胞骨架动力学在调节 HaCaT 角质形成细胞运动中的作用，我们证明了 Arp2/3 活性是 HaCaT 角质形成细胞 α-catenin 耗竭后运动升高所必需的。

引言

上皮细胞中细胞运动的精确、反应性调节对于伤口愈合和补充上皮层至关重要。不能维持运动会导致胚胎发育和伤口愈合问题1 ，而过度活跃的运动信号传导是癌症转移2 的关键因素。

了解 HaCaT 角质形成细胞对运动的控制为了解这些过程提供了重要的见解。此处概述的程序提供了单细胞或群体水平上细胞运动平均幅度的一致测量和计算。我们使用这种方法来测量遗传扰动或用小分子抑制剂处理后 HaCaT 角质形成细胞的运动，以了解控制运动速率的细胞信号传导。提供的 MATLAB 脚本测量每个细胞的平均速度和平均运动方向。

集体细胞运动对于发育和癌症转移中的上皮-间质转化至关重要3。细胞通过粘附、极化、突出和回缩的协调来实现运动4。这些过程在很大程度上依赖于动态肌动蛋白细胞骨架的协调调节。PI3K 下游 Rac1 GTP 酶或各种受体酪氨酸激酶的激活使细胞极化，导致肌动蛋白聚合5。肌动蛋白细胞骨架动力学受这种酶和其他 Rho 介导的 GTP 酶的调节，这些 GTP 酶被各种生长因子的下游激活。然后，这些 Rho 介导的 GTP 酶激活刺激肌动蛋白分支的 Arp2/3 复合物6。这些肌动蛋白细胞骨架动力学与运动的另一个关键调节因子密切相关：细胞间连接。我们特别感兴趣的是在细胞之间形成强烈粘附的粘附连接如何与肌动蛋白细胞骨架协调以维持组织完整性7。

我们之前已经表明，表达 shRNA 介导的 α-catenin 敲低的 HaCaT 角质形成细胞比表达非靶向 shRNA 对照的角质形成细胞表现出更高的运动率8。我们希望使用我们开发的运动分析工具来进一步了解 α-catenin 耗竭后这种运动性升高的机制。α-连环蛋白是粘附连接9 所需的胞质成分。它通过与 ß-catenin 相互作用参与粘附连接，并以单体形式结合10,11。然而，α-catenin 也可以从粘附连接上解离，形成结合和束化肌动蛋白丝的同型二聚体，从而抑制 Arp2/3 活性10,11。虽然 α-catenin 在与 ß-catenin 结合时不直接与肌动蛋白相互作用，但它仍可能通过与黏着斑蛋白结合来促进或加强粘附连接和细胞骨架之间的协调，从而稳定肌动蛋白丝12。

虽然 ImageJ 的 TrackMate 插件是一种成熟的粒子跟踪方法，可用于跟踪细胞核，但我们发现用于解析、分析和整合 TrackMate 输出以计算多个成像位点的细胞运动的可用工具没有集成，并且对于没有多种编程语言专业知识的人来说很难使用。Tinevez 和 Herbert 提供了使用 TrackMate 的入门知识，但均方位移分析部分需要相当多的 MATLAB 技能13。从延时显微镜视频中提取运动率的现有方法提供了更复杂的三维分析，但需要更多的编程专业知识14,15。Pathfinder 是我们实验室之前开发的一种细胞示踪和运动分析软件，可测量细胞迁移速度和方向，但只能在 Windows 机器上执行，并且需要有限的 Java 运行时环境16。由于 TrackMate 是一个可靠且文档齐全的工具，因此我们开发了一种使用 MATLAB 生成、分析和组织大型二维 TrackMate 数据集的简单方法。我们的脚本还删除了在跟踪细胞越过成像位点后有时出现在 TrackMate 输出中的重复整数数据点，从而允许在分析中包含具有高运动性和/或方向性的细胞，而无需包含这些虚假数据点。我们还提供了一个脚本，用于将 ImageXpress Micro XL 上收集的图像重新组织成 TIFF 堆栈，以便使用 TrackMat 进行批量分析。

在该方案中，将细胞接种在 96 孔成像板中。在让细胞有足够的时间粘附到板的底部后，我们用 Hoechst 核染色和任何对运动影响感兴趣的小分子处理它们。我们在 5 小时或更长时间内收集细胞核的图像，然后使用 MATLAB 将图像序列处理成背景减去的 TIFF 堆栈。这些 TIFF 堆栈使用 ImageJ TrackMate 插件进行分析，该插件跨时间点17 注册和跟踪每个单独的细胞。在为所有成像位点生成细胞轨迹后，我们使用自定义 MATLAB 脚本删除细胞离开成像区域后出现的虚假数据点，并计算每个成像位点的平均运动率。该脚本仅分析跟踪用户指定的最小时间点数的单元格，并允许用户按总距离和/或行进方向筛选单元格。结果是每个像元的平均位移、平均行进方向、总位移和总行进方向，用于计算成像站点中所有像元的这些值的体积平均值。该协议可以在大型成像实验中批量执行，这适用于相对高通量的运动分析（图 1）。

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研究方案

1. 细胞培养和成像板制备

  1. 在 37 °C 和 5% 二氧化碳的细胞培养基（补充有 2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素/链霉素和 10% （v/v） 胎牛血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基）中培养 HaCaT 细胞，置于加湿培养箱中。
  2. 在 96 孔成像板（例如 96 孔黑色聚苯乙烯微孔板）中接种每孔所需数量的细胞（我们使用 5000 - 20,000 个细胞/孔）。向三个孔中，仅添加培养基（无细胞）。
  3. 将板放在完全平坦的表面上 20 - 30 分钟，以便细胞可以以均匀的空间分布附着在板的底部。
  4. 将板转移到加湿的细胞培养箱（37°C，5%二氧化碳）中4-6小时，以使细胞完全粘附在板的底部。
  5. 从板中取出培养基，用 2 μg/mL Hoechst 染料（1 mg/mL 储备液的 1：5000 稀释液）的细胞培养基替换。
  6. 将板放回加湿的细胞培养箱（37°C，5%二氧化碳）中2小时。
  7. 用每孔 100 μL 磷酸盐缓冲盐水轻轻洗涤板 3 次，然后向每个孔中加入 90 μL 成像培养基（不含酚红的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基，补充有 2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素/链霉素和 10% （v/v） 胎牛血清）。
  8. 如果测量小分子抑制剂或其他效应器的作用，请在成像前立即处理细胞。

2. 成像

  1. 在显微镜中以 10 倍放大倍率对板（包括仅培养基孔）进行成像，显微镜具有 37 °C 和 5% 二氧化碳的加湿环境室。
    注：本协议中的分析脚本是为在 Molecular Devices ImageXpress Micro XL 宽场显微镜上收集的数据编写的。
  2. 根据实验所需的时间分辨率收集图像。为获得最佳结果，每小时至少记录 4 个时间点，持续至少 5 小时。如果测量小分子抑制剂或其他扰动对细胞的影响，请在预期看到效果的时间后至少成像 5 小时。出于我们的目的，我们对 100 个 8 分钟的时间点进行成像，总成像时间为 13 小时 20 分钟。

3. 图像处理

  1. 使用提供的自定义 MATLAB 脚本 “ImageReorganizer.m” 删除缩略图，并按井而不是时间点重新组织图像文件。ImageXpress 按以下文件夹组织方式输出文件：“[实验名称] > [YYYY-MM-DD] > [运行编号] > Timepoint_[时间点] > [图像文件]”。重新组织图像后，此脚本使用该时间点仅培养基孔的平均和高斯模糊图像对每个时间点的图像执行背景扣除。然后，此脚本将减去背景的图像组织到每个成像站点的 TIFF 堆栈中。每个 TIFF 堆栈都命名为“[Well]_[Site].tif”。
    1. 如果试验延长了一天以上，请合并所有日期的 [Run number] 文件夹的内容，以便所有“Timepoint_[Timepoint]”子文件夹位于同一个“[Run number]”文件夹中。
    2. 请注意，此脚本需要 MATLAB 函数 int2strz18。在第 2 行的 “addpath” 之后输入此函数的本地路径。
    3. 在第 9 行将仅培养基孔的行输入为 “emptyrows”，在第 10 行将列输入为 “emptycolumns”。
    4. 在第 15 行将实验孔的行输入为 “rows”，在第 16 行将列输入为 “columns”。在第 17 行中输入每孔的成像位点数以及 “sites”。
    5. 在 MATLAB 的路径栏中输入 “[Run number]” 文件夹的路径名，然后运行脚本。

4. 细胞示踪

注意：TrackMate 可以使用 Tinevez 等人 17 的 Run_TrackMate_Headless.groovy 脚本的略微修改版本在指定目录中的所有 TIFF 堆栈上运行，也可以为每个单独的 TIFF 堆栈手动执行。我们在几个示例 TIFF 堆栈上手动运行 FIJI，以确保在使用这些参数的所有 TIFF 堆栈上运行 Groovy 脚本之前，我们使用了正确的参数。

  1. 要在 FIJI 中为文件夹中的所有 TIFF 堆栈运行 TrackMate 插件，请根据 Tinevez 等人提供的协议下载并使用 Run_TrackMate_Headless.groovy 脚本17 。我们使用此脚本的略微修改版本，它使我们能够轻松地对输入文件和输出文件名进行批处理，并使用一个图形用户界面输入所有参数。以下是使用此修改后的脚本的详细说明，此处以 TrackMate_Headless_Mod.groovy 的形式提供。
    1. 在 FIJI 中打开脚本，方法是选择 File>Open ，然后导航到 TrackMate_Headless_Mod.groovy 脚本的位置。
    2. 选择 Run （运行）。
    3. 输入 TIFF 堆栈所在的目录（“StackGenerator.m”的默认输出应为“[实验名称] > [YYYY-MM-DD] >>堆栈”）作为“输入目录”。
    4. 创建一个输出目录，并将其路径名输入为 “Output directory”。“文件扩展名应为 ”.tif“的默认值，如果不是，则输入 ”.tif“ 作为 ”文件扩展名”。
    5. 要仅在目录中的文件子集上运行 TrackMate，请在“File name contains”后面使用输入空间来包含这些文件。否则，请将该空间留空。
    6. 选择“保存时保持目录结构”。
    7. 根据所需的设置，以像素为单位输入“点半径”、“质量阈值”、“最大帧间隙”、“链接最大距离”和“间隙闭合最大距离”。我们通常分别使用 3.5、18、2、15 和 40 作为 10 倍放大倍率的 HaCaT 细胞核。
    8. 选择 Ok （确定）。此脚本应在指定的输出目录中为每个 TIFF 堆栈输出一个 XML 文件。
  2. 或者，根据 Tinevez 等人13 中概述的协议，在 FIJI 中为每个 TIFF 堆栈手动运行 TrackMate 插件。
    1. 在 FIJI 中打开一个 TIFF 堆栈，然后在菜单栏中选择 Plugins >Tracking > TrackMate 打开 TrackMate 插件。
    2. 如果弹出窗口显示提示“此图像似乎有 1 个时间点，但 [时间点数] 切片。是否要交换 Z 和 T？选择 “是”。
    3. 在 TrackMate v4.0.1 中，使用除“估计斑点直径”（我们在 10 倍放大倍率下对 HaCaT 原子核使用 7.000 像素）和阈值（我们使用 18.000 像素，但这会根据使用的显微镜和 Hoechst 染料的强度而有所不同）以外的默认设置。
    4. 使用 预览 功能确保优化颗粒检测，并根据需要调整液滴直径和阈值设置。
    5. 对于“间隙闭合最大距离”，默认设置通常适用于基础 HaCaT 运动，但在增强运动的条件下，可能需要将间隙闭合最大距离增加到最多 40.0 像素。
    6. 目视确认跟踪已优化，细胞迹线中的间隙最小。
    7. 在 Select a action [sic] 下，选择 Export tracks to XML file and execute。
    8. 对所有 TIFF 堆栈重复上述步骤。

5. 运动率的量化

注意：使用提供的自定义 MATLAB 脚本 “TrackMateAnalysis.m” 来删除失败的轨迹并量化所有 TrackMate 输出文件的运动性。该脚本会删除移出帧的轨迹（其位置轨迹默认为整数）和轨迹的跟踪时间少于指定数量的时间点。该脚本将删除移出帧的轨迹（其位置轨迹默认为整数）和轨迹的轨迹少于可指定的时间点数。输出是成像位点中单个细胞和所有细胞的每个时间点的平均位移。（输出示例：'Output.mat'）

  1. 请注意，此脚本需要提供的 MATLAB 函数 “import_trackmate_xml.m.”在第 4 行的 “addpath” 后面输入此函数的本地路径。
  2. 在第 7 行，指示应跟踪粒子以包含在合并输出中的最小时间点数。
  3. 在第 12 行和第 13 行中，指示过滤分析中应包含的行进距离范围（以像素为单位）。要包括所有可能行驶的距离，请输入从 0 到成像场宽度的范围。
  4. 在第 14 行和第 15 行中，指示过滤分析中应包含的轨迹范围（以度为单位）。要包含所有可能的轨迹，请输入从 0 到 360 的范围。
  5. 在包含所有 TrackMate 输出 XML 文件的文件夹中运行脚本。
    注意：该脚本生成并保存一个 MATLAB 单元结构，其中包含此分析中生成的所有数据。Tables{1，：} 列出了此脚本分析的每个成像站点的 Trackmate 输出 XML 文件的名称。Tables{2，：} 是一个子结构，包含每个时间点所有单个细胞的位置（像素）、位移（像素）和行进角度（度，其中 0° 表示成像部位内的向右行进方向）。它还包含每个单元格在所有时间点的总行进距离（像素）、平均运动性（像素/时间点）、平均行进角度（度），以及每个单元格的第一个和最后一个时间点之间的总行进角度。表格的第 3 行和第 4 行分别包含每个成像位点中所有时间点的所有细胞的平均和标准差运动值（像素/时间点）。第 5 行和第 6 行分别包含每个成像位点中所有单元格总行进距离（像素）的平均值和标准差值。第 7 行和第 8 行包含成像站点中所有单元格的第一个和最后一个时间点之间的总行进角度（度）的平均值和标准差值。Tables 的第 3-8 行包含满足最小时间点跟踪标准的所有单元格的这些值，而第 9-14 行包含相同的值，但仅适用于满足用户指示的筛选条件的单元格。

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结果

为了确保我们的分析脚本可靠和一致，我们在三个独立实验中测量了 HaCaT 角质形成细胞的运动。我们发现，虽然细胞运动的标准差在实验之间是可变的（可能是由于 HaCaT 细胞对汇合和机械刺激的敏感性），但根据双尾学生的 t 检验，平均运动在多个实验中一致复制，重复之间没有统计学上的显着差异（图 2）。

由于 Arp2/3 复合?...

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讨论

上述方法和分析工具提供了一种简单且可扩展的方法来测量和量化 HaCaT 角质形成细胞的运动，该方法使用 MATLAB 并且需要最少的编程经验。该方案要求在至少 5 小时的过程中对细胞核进行染色和成像。虽然可以在任何合适的显微镜上进行数据收集，但该协议提供了一个脚本，用于将 ImageXpress Micro XL 显微镜上收集的图像处理到每个成像位点的 TIFF 堆栈中，该堆栈显示了所?...

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披露声明

X.L. 和科罗拉多大学博尔德分校在开发用于治疗的 HDAC 抑制剂方面拥有经济利益，并拥有 OnKure 的股权。X.L. 是 OnKure 的联合创始人和董事会成员，该公司已获得科罗拉多大学博尔德分校的专有 HDAC 抑制剂许可。OnKure 既不参与这项研究的实验设计，也不资助这项研究。

致谢

我们感谢 Daniel Messenger、Lewis Baker、Douglas Chapnick、Adrian Ramirez、Quanbin Xu 以及 Liu 和 Bortz 实验室的其他成员提供的见解和建议。我们感谢 Jian Tay 分享他的 MATLAB 专业知识并编写用于 XML 导入的函数。我们感谢 BioFrontiers Advanced Light Microscopy Core 的 Joseph Dragavon 提供的显微镜和成像支持。我们感谢 Cell Culture Core Facility 的 Theresa Nahreini 和 Nicole Kethley 提供的细胞培养支持。这项工作得到了美国国立卫生研究院 （R01AR068254） 美国国立癌症研究所和国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所对 XL 和国家普通医学科学研究所 （NIGMS） R01GM126559 对 D.B. 和 X. L. G.E.W. 和 ENB 的支持得到了 NIGMS （T32GM08759） 的博士前培训资助。ImageXpress Micro XL 得到了美国国家研究资源中心 （S10 RR026680） 的支持。FACSAria 得到了美国国立卫生研究院 （S10OD021601） 的支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat clear bottom black polystyrine TC-treated microplates, individually wrapped, with lid, sterileCorning3603
Dulbecco's modified eagle medium (high D-glucose)Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific12800-082
Fetal bovine serumSigma-Aldrich IncF0926
Fluorobrite Dulbecco's modified eagle medium (high D-glucose, 3.7 g/L sodium bicarbonate, no L-glutamine, no phenol red)Gibco/Thermo Fisher ScientificA18967-01
GlutaminePlusR&D Systems Inc.R90210
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrateInvitrogen/Thermo Fisher ScientificH21492
Penicillin streptomycinLife Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate buffered salineGibco/Thermo Fisher Scientific14190-144

参考文献

  1. Li, L., He, Y., Zhao, M., Jiang, J. Collective cell migration: Implications for wound healing and cancer invasion. Burns & Trauma. 1 (1), 21-26 (2015).
  2. Stuelten, C. H., Parent, C. A., Montell, D. J. Cell motility in cancer invasion and metastasis: insights from simple model organisms. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 296-312 (2018).
  3. Campbell, K., et al. Collective cell migration and metastases induced by an epithelial-to-mesenchymal transition in Drosophilaintestinal tumors. Nature Communications. 10 (1), 1-10 (2019).
  4. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling networks that regulate cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  5. Parri, M., Chiarugi, P. Rac and Rho GTPases in cancer cell motility control. Cell Communication and Signaling. 8 (1), 23(2010).
  6. Sumida, G. M., Yamada, S. Rho GTPases and the downstream effectors actin- related protein 2/3 (Arp2/3) complex and myosin II induce membrane fusion at self-contacts. The Journal of Biological Chemistry. 290 (6), 3238-3247 (2015).
  7. Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell., 4th edition. , (2002).
  8. Bunker, E. N., Wheeler, G. E., Chapnick, D. A., Liu, X. Suppression of α-catenin and adherens junctions enhances epithelial cell proliferation and motility via TACE- mediated TGF-α autocrine/paracrine signaling. Molecular Biology of the Cell. 32 (4), 348-361 (2021).
  9. Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2525-2532 (2007).
  10. Drees, F., Pokutta, S., Yamada, S., Nelson, W. J., Weis, W. I. α-Catenin is a molecular switch that binds E-cadherin-β-catenin and regulates actin-filament assembly. Cell. 123 (5), 903-915 (2005).
  11. Yamada, S., Pokutta, S., Drees, F., Weis, W. I., Nelson, W. J. Deconstructing the cadherin-catenin-actin complex. Cell. 123 (5), 889-901 (2005).
  12. Rangarajan, E., Izard, T. The cytoskeletal protein α-catenin unfurls upon binding to vinculin. The Journal of Biological Chemistry. 287 (22), 18492-18499 (2012).
  13. Tinevez, J. -Y., Herbert, S. The NEMO dots assembly: single-particle tracking and analysis. Bioimage Data Analysis Workflows. , 67-97 (2020).
  14. Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
  15. Wu, P. -H., Giri, A., Wirtz, D. Statistical analysis of cell migration in 3D using the anisotropic persistent random walk model. Nature Protocols. 10, 517-527 (2015).
  16. Chapnick, D. A., Jacobsen, J., Liu, X. The development of a novel high throughput computational tool for studying individual and collective cellular migration. PloSOne. 8 (12), 82444(2013).
  17. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  18. Vargas Aguilera, C. A. int2strz.m. MATLAB Commons. , (2016).

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